柯井衛(wèi)朱永生唐 海劉 鑫賴俊諭劉 星

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科,四川 瀘州 646000)

泌尿系結(jié)石在全球范圍內(nèi)屬于高發(fā)病,不同國家或地區(qū)發(fā)病率存在差異,我國發(fā)病率大約為6%左右,而其中大約80%的泌尿系結(jié)石由草酸鈣組成[1]。泌尿系統(tǒng)結(jié)石是一個(gè)復(fù)雜的過程,目前的研究認(rèn)為與飲食、地理、氣候、種族及遺傳等多種因素有關(guān)[2],但不同結(jié)石類型的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。隨著臨床上治療設(shè)備及技術(shù)的發(fā)展,采用沖擊波或其他外科手術(shù)等方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于泌尿系結(jié)石的治療。然而臨床中發(fā)現(xiàn),上述治療手段治療腎結(jié)石的過程中往往不可避免的會(huì)引起創(chuàng)傷性損傷甚至嚴(yán)重影響腎功能,且治療后復(fù)發(fā)率可高達(dá)70%左右[3]。目前在藥物治療方面,磷酸纖維素鈉、正磷酸鹽及噻嗪類利尿藥等可應(yīng)用于泌尿系結(jié)石治療及預(yù)防其復(fù)發(fā),但臨床療效不能達(dá)到滿意效果,而且存在引起副作用的風(fēng)險(xiǎn)[4]。中草藥治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石具有悠久的歷史,且在臨床中取得了一定的效果,作為無創(chuàng)治療方法其還具有副作用少、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于泌尿系結(jié)石的治療及其研究中[5]。本研究探討中藥復(fù)方棱術(shù)排石顆粒對(duì)大鼠尿草酸鈣結(jié)石形成的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討,從而為臨床提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12~13周齡的雄性SD大鼠32只,SPF級(jí),體重200~220 g,購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(川)2018-17],飼養(yǎng)在本單位的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(川)2018-065],飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±2)℃,濕度(50±10)%,12 h循環(huán)光照。正常飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境,第2周開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)過程中遵循3R原則。本實(shí)驗(yàn)已通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批批準(zhǔn)(XNFS(A)-2019-062)。

1.2 主要試劑與儀器

棱術(shù)排石顆粒(藥方比例為:三棱200 g、川芎200 g、海金沙300 g、糊精700 g、莪術(shù)200 g、金錢草600 g、牽牛子(醋制)200 g、白芍300 g、川木通300 g、威靈仙300 g)有我院藥劑科提供;蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)特異性抑制劑R031-8220(EK-0514)采購自美國Selleck公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)濃度測(cè)定試劑盒(AE-0294)、3,3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)化學(xué)發(fā)光試劑盒(AE-29984)采購自Sigma公司;Vonkossa試 劑 盒(BK-29402)、丙二 醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒(BT-019942)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒(BA-00032)購自上海碧云天生物技術(shù)公司;PKC(ab-03941)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1,Keap1)(ab-23992)、結(jié)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor2,Nrf2)(ab-12323),抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements,ARE)抗體(ab-02994)、兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(ab-05132)以及山羊抗兔IgG(ab-08274)采購自美國abcam公司;2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸(2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)試劑盒(R-029442)、Western blot試劑盒(R-033245)購自德國Rebstock公司。

石蠟切片機(jī)(M2016,上海徠卡儀器有限公司,中國);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(680型,伯樂公司,美國);電泳儀(DYY-6C,北京六一儀器廠,中國);凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR+,伯樂公司,美國);分光光度計(jì)(Nanodrop 2000,賽默飛世爾公司,美國);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler96,羅氏公司,英國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 收集分析結(jié)石標(biāo)本

經(jīng)自行排石、外沖擊波碎石、經(jīng)皮腎鏡碎石取石、開放性手術(shù)取石、輸尿管軟鏡或硬鏡下碎石取石、膀胱鏡下碎石取石、開放性手術(shù)取石等方式收集結(jié)石標(biāo)本。結(jié)石成分通過傅立葉紅外光譜儀Turbo FT型(美國D&P)測(cè)定。

1.3.2 分組處理

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組,即:對(duì)照組、模型組、治療組和抑制劑組,每組8只。除對(duì)照組外,所有大鼠28 d內(nèi)連續(xù)給予1%乙二醇及2%氯化銨誘導(dǎo)大鼠泌尿系草酸鈣結(jié)石形成[6],造模同時(shí)進(jìn)行藥物處理,治療組灌胃給藥10.0 g/kg的棱術(shù)排石顆粒,抑制劑組在治療組基礎(chǔ)上腹腔注射30 mg/kg R031-8220,對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.3.3 尿液樣本收集及尿液指標(biāo)分析

28 d后,用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液,測(cè)定24 h尿量、尿液pH值后,取2 mL尿液中加入0.5 mL濃硫酸,300 r/min離心10 min,采用原子吸收光密度法測(cè)定尿液中Ca2+、Mg2+含量。另去部分尿液采用高錳酸鉀法測(cè)定尿草酸(oxalic acid,Ox)分泌量。

1.3.4 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

收集尿液后,稱取大鼠重量并處死各組大鼠,下腔靜脈取血,3000 r/min離心10 min后取上血清,使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine ratio,Cr)中Ca2+、Mg2+含量。

1.3.5 Vonkossa染色觀察病理學(xué)變化

左側(cè)腎用10%多聚甲醇固定后,常規(guī)石蠟包埋,經(jīng)Vonkossa染色,制成切片,光鏡下觀察各組大鼠左側(cè)腎的病理改變。

1.3.6 DCFH-DA染色檢測(cè)各組大鼠腎組織中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及與MDA、SOD酶的活性

取出各組大鼠的腎組織,冰凍切片,二甲苯浸洗兩次,添加10 μmol/L DCFH-DA染色2 h,熒光顯微鏡下拍照記錄,并用Image 8.0軟件分析圖像,注意所用染色劑要保證現(xiàn)用現(xiàn)配[7]。按照各試劑盒說明書要求操作,使用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)細(xì)胞中MDA的含量和SOD活性。

1.3.7 Western blot檢測(cè)檢測(cè)各組大鼠腎組織PKC、Keap1、Nrf2、ARE的表達(dá)水平

取出各組大鼠左腎組織勻漿,冰上裂解30 min后,離心獲得上清,蛋白濃度采用BCA試劑盒測(cè)定,每個(gè)樣品取50 μg,然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、TBST液封閉,維持4℃過夜孕育,后分別加入一抗(PKC、Keap1、Nrf2、ARE)(1∶1500),孕育1 h,洗滌加入抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶10000),加入ECL顯色30 min,以GAPDH作為內(nèi)參表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 16.0,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)進(jìn)行表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿液指標(biāo)的比較

各組大鼠尿液生化指標(biāo)如表1所示,與對(duì)照組相比,模型組大鼠24 h尿量、尿pH、Mg2+明顯降低,Ox、Ca2+水平明顯升高(P<0.05);經(jīng)棱術(shù)排石顆粒治療后,與模型組相比,治療組大鼠24 h尿量、尿pH、Mg2+明顯升高,Ox、Ca2+水平明顯降低(P<0.05);抑制劑組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 棱術(shù)排石顆粒對(duì)草酸鈣結(jié)石大鼠尿液指標(biāo)的影響(ˉx±s,n=8)Table 1 Effect of Riangzhipeishi granule on urine index of calcium oxalate calculi rats

2.2 各組大鼠血液生化指標(biāo)比較

各組大鼠血液生化指標(biāo)如表2所示,與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清BUN、Cr、Ca2+水平明顯升高,Mg2+明顯降低(P<0.05);經(jīng)棱術(shù)排石顆粒治療后,與模型組相比,治療組大鼠血清BUN、Cr水平明顯降低,Mg2+明顯升高(P<0.05);抑制劑組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 棱術(shù)排石顆粒對(duì)草酸鈣結(jié)石大鼠血生化指標(biāo)的影響(ˉx±s,n=8)Table 2 Effects of Riangzhipeishi granule on blood biochemical indexes of calcium oxalate calculi rats

2.3 Vonkossa染色檢測(cè)各組大鼠腎組織病理變化

Vonkossa染色結(jié)果如圖1所示,對(duì)照組大鼠腎表面光滑且富有彈性,色澤正常,其他組大鼠腎蒼白。對(duì)照組大鼠中腎內(nèi)膜層細(xì)胞排列規(guī)整,內(nèi)皮連續(xù)完整,無缺損現(xiàn)象出現(xiàn)。模型組大鼠腎中膜、內(nèi)膜細(xì)胞排列紊亂,內(nèi)皮凸起伴有大量淋巴細(xì)胞填充,腎皮質(zhì)及腎乳頭內(nèi)有草酸鈣沉積,手觸摸有明顯顆粒感;治療組大鼠腎中膜、內(nèi)膜細(xì)胞排列較整齊,內(nèi)皮輕微凸起少見淋巴細(xì)胞填充,腎皮質(zhì)及腎乳頭內(nèi)有少有草酸鈣沉積,手觸摸顆粒感不明顯;而抑制劑組大鼠腎病理變化與模型組相似。

2.4 各組大鼠腎MDA、SOD、ROS水平的比較

與對(duì)照組相比,模型組大鼠腎MDA水平、ROS熒光強(qiáng)度明顯增加,而SOD酶活性明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,治療組大鼠腎組織中MDA水平、ROS熒光強(qiáng)度明顯降低,而SOD酶活性明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);抑制劑組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2,表3。

表3 各組大鼠腎組織MDA、SOD、ROS比較(ˉx±s,n=8)Table 3 Comparison of MDA,SOD and ROS in renal tissues of rats in each group

注:A:對(duì)照組;B:模型組;C:治療組;D:抑制劑組。下同。圖1 Vonkossa染色檢測(cè)各組大鼠腎組織病理變化Note.A,Control group.B,Model group.C,Treatment group.D,Inhibitor group.The same as below.Figure 1 Pathological changes of renal tissues of rats in each group detected by Vonkossa staining

圖2 各組大鼠腎組織ROS水平的檢測(cè)Figure 2 Detection of ROS levels in renal tissues of rats in each group

2.5 Western blot檢測(cè)各組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比,模型組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白表達(dá)量明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,治療組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白表達(dá)量明顯下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),抑制劑組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖3,表4。

表4 各組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白比較(ˉx±s,n=8)Table 4 Comparison of PKC,Keap1,Nrf2,and ARE proteins in renal tissues of rats in each group

圖3 各組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白表達(dá)Figure 3 Protein expressions of PKC,Keap1,Nrf2,and ARE in renal tissues of rats in each group

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)[7],泌尿系統(tǒng)結(jié)石的發(fā)病率逐年升高,且我國是世界上三大結(jié)石高發(fā)地之一,其中影響泌尿結(jié)石的最主要因素包括遺傳、代謝、飲食和地理因素。目前臨床診斷技術(shù)不斷進(jìn)步,大多數(shù)尿路結(jié)石患者可根據(jù)結(jié)石成分分析及代謝評(píng)估確定發(fā)病原因,這對(duì)結(jié)石的預(yù)防及治療具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期分析了1407例四川地區(qū)尿路結(jié)石患者的結(jié)石成分,結(jié)果顯示,尿路結(jié)石主要分布于上尿路,且92.11%的患者為草酸鈣結(jié)石,該結(jié)石的位置分部與成分組成與報(bào)道基本相符[8]。中藥在治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石中取得了一定的療效,其中一經(jīng)驗(yàn)方制成的中成藥具有療效確切、價(jià)格低廉且副作用低等特點(diǎn)具有良好的應(yīng)用前景。棱術(shù)排石顆粒是我院常用治療泌尿結(jié)石的藥物,特別是對(duì)于腎草酸鈣結(jié)石的治療取得了滿意的效果,但其作用機(jī)制尚無報(bào)道。

乙二醇作為草酸的前體物質(zhì),可引起腎小管上皮細(xì)胞損傷引起高草酸尿癥狀并最終導(dǎo)致腎結(jié)石的形成,氯化銨可降低尿液pH值,促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶的形成[9],本研究以乙二醇和氯化銨構(gòu)建大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型,結(jié)果顯示,模型組大鼠24 h尿量、尿pH、血清及尿中Mg2+降低,而尿Ox、血清腎功能指標(biāo)BUN、Cr及血清和尿中Ca2+水平均明顯升高,草酸鈣結(jié)石的形成分為多個(gè)階段,包括晶核的形成、晶體成長、集聚和潴留等多個(gè)過程,Ca2+是結(jié)石形成的必要物質(zhì),草酸鈣結(jié)石以Ca2+升高為主要標(biāo)志[10]。高Ox尿是草酸鈣結(jié)石形成的重要影響因子,Mg2+可絡(luò)合Ox,降低Ox的水平從而抑制草酸鈣結(jié)石的形成[11]。病理觀察顯示,模型大鼠腎組織中存在大量草酸鈣結(jié)晶,說明模型構(gòu)建成功。經(jīng)棱術(shù)排石顆粒治療后,上述指標(biāo)及病理狀態(tài)均明顯改善,說明棱術(shù)排石顆?？捎行б种颇I草酸鈣結(jié)石的形成。

研究發(fā)現(xiàn),長期的高水平草酸可促進(jìn)腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生大量的ROS可損傷腎小管,增加了腎小管上皮細(xì)胞表面的黏附效應(yīng),促進(jìn)了草酸鈣結(jié)石的形成[12]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,棱術(shù)排石顆粒中多種藥材中含有具抗氧化活性成分,其中三棱中總茋類物質(zhì)不僅能夠清除活性氧,還可以抑制機(jī)體中氧自由基的生成以及抵抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[13]。研究發(fā)現(xiàn),川芎可以改變糖尿病腎病氧化應(yīng)激水平改善病理狀態(tài)[14]。金錢草提取物能夠增加腎組織SOD水平,從而有效抑制結(jié)晶的形成[15]。本研究結(jié)果顯示,棱術(shù)排石顆粒治療后大鼠MDA水平明顯降低,SOD酶活明顯升高,說明棱術(shù)排石顆粒治療腎草酸鈣結(jié)石可能與改善氧化應(yīng)激水平有關(guān)。PKC-Nrf2/ARE信號(hào)通路是重要的抗氧化防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[16]。正常狀態(tài)下,PKC介導(dǎo)的通路下游蛋白Nrf2與Keap1結(jié)合以二聚體的形式存在,而氧化應(yīng)激刺激可使Keap1半胱氨酸殘基被修飾,從而使該二聚體發(fā)生解離,Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化應(yīng)激原件ARE相互作用,從而發(fā)揮抗氧化的作用[17]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過棱術(shù)排石顆粒治療的腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白表達(dá)含量均明顯升高,說明棱術(shù)排石顆粒治療的腎草酸鈣結(jié)石可能是通過激活PKC-Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路達(dá)到治療效果。

綜上所述,棱術(shù)排石顆?？捎行Ц纳颇I草酸鈣結(jié)石大鼠的病理狀態(tài),其機(jī)制可能與激活PKCNrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路降低氧化應(yīng)激水有關(guān)。