趙苗鑫胡相卡董蘇敏馬 悅劉曉娟楊 鶴代春美

(錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧 錦州 121000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病人群中最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[1-2],約占糖尿病患者的40%,也是糖尿病患者終末期腎病的主要因素[3],具有動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[4]。目前普遍認(rèn)為,控制血壓和血糖是預(yù)防糖尿病腎病進(jìn)展的有效手段,但是效果不理想,尚未降低DN進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)[5]。由于DN發(fā)病率高,對(duì)人們的生活造成了嚴(yán)重的影響,目前尚無(wú)有效的治療舉措,所以探索DN的發(fā)病機(jī)制,去尋找一種有效的治療藥物已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

紅花黃色素(Safflower Yellow,SY)是從中藥紅花中提取的一種查爾酮類化合物[6],是紅花中主要的有效物質(zhì)[7]。SY不僅是中國(guó)允許使用的食用色素,而且具有抗氧化、抗炎、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、免疫抑制、改善微循環(huán)、清除氧自由基等作用[8]。在臨床高血壓、高血脂、冠心病、糖尿病及并發(fā)癥等多種疾病中都有應(yīng)用[9]。

本研究將探討SY對(duì)糖尿病腎病小鼠腎損傷是否具有保護(hù)作用及潛在機(jī)制,從而為SY治療DN的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6J小鼠50只,SPF級(jí),6~8周齡,體重18~22 g,購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司[SCXK(遼)2020-0001]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的喂養(yǎng)及組織取材于錦州醫(yī)科大學(xué)心腦血管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(遼)2019-0007],已取得錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(IACUC-2019019),實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物福利及相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、指南要求,遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

紅花黃色素(批號(hào):36338-96-2)購(gòu)自上海廣銳公司,純度>95%;鏈脲佐菌素(STZ)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司購(gòu)買(批號(hào):S0130);SOD試劑盒(批號(hào):E2011)、MDA試劑盒(批號(hào):E2019)購(gòu)于北京普利萊;GSH-PX試劑盒(批號(hào):S0052)購(gòu)自碧云天;IL-1β試劑盒(批號(hào):RK00006)、IL-6試劑盒(批號(hào):RK00008)、TNF-α試劑盒(批號(hào):RK00027)購(gòu)自AB-Clonal Technology公司;PKC-β抗體(批號(hào):A13628)、Raf抗體(批號(hào):A19638)、P-Raf抗體(批號(hào):AP0498)、ERK抗體(批號(hào):A16686)、P-ERK抗體(批號(hào):AP0472)購(gòu)自AB-Clonal Technology公司;β-actin抗體(批號(hào):AC026)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(二抗)(批號(hào):AS014)購(gòu)于AB-clonal Technology公司;ECL曝光液購(gòu)于Biosharp公司;羅氏活力型血糖儀(德國(guó)羅氏公司);Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司);凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào):Universal Hood 2、BIO-RAD公司);轉(zhuǎn)印儀(型號(hào):Trans-Blot SD Cell、BIO-RAD公司);BIO-RAD電泳槽。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型的建立及分組

C57BL/6J小鼠(6~8周齡)50只按體重隨機(jī)分成對(duì)照組(n=10)和糖尿病(DM)組,參照Sun等[10]研究中糖尿病腎病模型的建立,建立2型糖尿病小鼠模型,各組小鼠腹腔注射50 mg/kg STZ(以pH 4.2檸檬酸鈉緩沖液稀釋),連續(xù)注射5 d。STZ注射之前需禁食12 h。最后一次注射STZ后第7天后尾靜脈取血,空腹血糖≥16.7 mmol/L則糖尿病模型造模成功。STZ注射是公認(rèn)的造糖尿病模型的方法,且在一段時(shí)間后可成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生糖尿病腎病[11]。40只小鼠造模成功36只,最后將存活且造模成功的DM小鼠隨機(jī)分為4組:DM組(9只)、DM+SY(10 mg/kg)(9只)、DM+SY(30 mg/kg)(9只)、DM+SY(90 mg/kg)(9只)。各給藥組分別腹腔注射SY 10周,正常組模型組給予等體積蒸餾水。

1.3.2 樣本的收集

連續(xù)給藥10周,在最后一次稱量小鼠體重后,用乙醚將小鼠麻醉,仰臥位固定,打開(kāi)胸腔,腹主動(dòng)脈取血,離心10 min(3000 r/min)后分離血清,部分用全自動(dòng)生化分析儀分析血肌酐、尿素氮的值,部分置于-20℃冰箱待用。隨后取出腎組織,剪去腎周圍的組織及血管,用生理鹽水清洗3遍,一部分固定于4%的多聚甲醛,一部分置于-80℃冰箱待用。

1.3.3 小鼠體重和血糖檢測(cè)

各組小鼠每?jī)芍芊Q量體重并尾靜脈取血檢測(cè)其空腹血糖值,在檢測(cè)之前小鼠禁食不禁水12 h。

1.3.4 小鼠腎組織HE染色

取一側(cè)腎組織,用多聚甲醛固定(濃度為4%)24 h后,制作石蠟切片,脫蠟后染色,切片于400倍顯微鏡下觀察腎組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.3.5 腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

將腎組織裂解充分,具體步驟嚴(yán)格參照小鼠GSH、SOD、MDA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6 ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子的表達(dá)

具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.7 Western blot檢測(cè)小鼠腎組織蛋白表達(dá)

-80℃冰箱中取出的腎組織,剪取20 mg,放入EP管中剪碎后加入RIPA裂解液充分裂解后并超聲,于冰上操作,裂解后于4℃離心機(jī)離心25 min(12000 r/min),將離心后抽取的上清液放入一個(gè)新的EP管中;BCA法檢測(cè)樣品中的蛋白濃度;加足夠的電泳液后上樣,90 V電壓進(jìn)行蛋白的分離,電泳結(jié)束后用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜上,室溫封閉1~2 h;然后分別加入PKC-β、Raf、PRaf、ERK、P-ERK一抗4℃過(guò)夜;加入對(duì)應(yīng)二抗,室溫孵育1~2 h;以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參。蛋白質(zhì)印跡需經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各組條帶進(jìn)行分析,并計(jì)算目的蛋白灰度值和內(nèi)參β-actin灰度值的比值,結(jié)果用Image J軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的實(shí)驗(yàn)均需要重復(fù)3次,采用SPSS 23.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SY對(duì)DN小鼠體重和血糖的影響

相比正常組,模型組小鼠的體重減輕(P<0.01),血糖升高(P<0.01)。經(jīng)SY治療后,相比模型組,各治療組小鼠的體重上升(P<0.05),血糖下降,給藥10周后小鼠的血糖變化更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

表1 SY對(duì)DN小鼠體重的影響(ˉx±s,g,n=9)Table 1 Effect of SY on body weight in DN mice

表2 SY對(duì)DN小鼠血糖的影響(ˉx±s,mmol/L,n=9)Table 2 Effect of SY on blood glucose in DN mice

2.2 SY對(duì)DN小鼠血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)的影響

相比正常組,模型組小鼠的Scr、BUN水平升高(P<0.01);相比模型組,各治療組小鼠的Scr和BUN水平下降(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 SY對(duì)DN小鼠Scr和BUN的影響(ˉx±s,n=9)Table 3 Effect of SY on Scr and BUN in DN mice

2.3 SY對(duì)DN小鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響

正常組小鼠腎組織大小、形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)腎小球肥大,腎小球基底膜未見(jiàn)增厚、腎小管未見(jiàn)明顯改變。模型組小鼠腎組織嚴(yán)重?fù)p傷,可見(jiàn)腎小球體積增大,腎小球基底膜(GBM)增厚,腎小管發(fā)生空泡樣變性。經(jīng)SY治療后各組腎小球體積減小,GBM增厚和腎小管發(fā)生空泡樣變性得到不同程度改善。見(jiàn)圖1。

圖1 SY對(duì)DN小鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響(HE染色)Figure 1 Effect of SY on renal histomorphology in DN mice(HE staining)

2.4 SY對(duì)DN小鼠GSH、SOD、MDA影響

與正常組相比,模型組小鼠的GSH、SOD含量下降(P<0.01);MDA上升(P<0.01)。與模型組相比,中高劑量治療組小鼠的GSH、SOD含量上升(P<0.05);與之相反的是經(jīng)SY治療后各組MDA的含量下降(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 SY對(duì)DN小鼠GSH、SOD、MDA的影響(ˉx±s,n=3)Table 4 Effect of SY on GSH、SOD、MDA in DN mice

2.5 SY對(duì)DN小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

與正常組相比,模型組小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)升高(P<0.01)。與模型組相比,各治療組小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)呈劑量依賴性下降(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 SY對(duì)DN小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β的影響(ˉx±s,n=3)Table 5 Effect of SY on TNF-α、IL-6、IL-1β in DN mice

2.6 SY對(duì)DN小鼠腎組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

相比于正常組,模型組小鼠腎組織中PKC-β、PRaf、P-ERK的表達(dá)均升高(P<0.05)。相比于模型組,中高劑量組小鼠腎組織中的PKC-β、P-Raf的表達(dá)均下降(P<0.05),高劑量組小鼠腎組織中PERK表達(dá)下降(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表6。

圖2 SY對(duì)DN小鼠PKC-β、ERK、P-ERK、Raf、P-Raf蛋白表達(dá)的影響(ˉx±s)Figure 2 Effect of SY on PKC-β、ERK、P-ERK、Raf、P-Raf proteins expression in DN mice

表6 SY對(duì)DN小鼠P-ERK、ERK、P-Raf、Raf、PKC蛋白表達(dá)的影響(ˉx±s,n=3)Table 6 Effect of SY on PKC-β、ERK、P-ERK、Raf、P-Raf proteins expression in DN mice

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病后期的主要并發(fā)癥之一,嚴(yán)重威脅著患者的生存質(zhì)量,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在DN的進(jìn)展中起著非常重要的作用[12]。紅花黃色素(SY)是從紅花中提取的食用天然色素,為國(guó)家級(jí)新藥[13],能夠保護(hù)腎功能,延緩或阻止糖尿病腎病的發(fā)展[11]。本研究結(jié)果表明,SY能增加糖尿病腎病小鼠的體重,抑制其血糖升高,且可降低血肌酐和尿素氮水平;在炎癥狀態(tài)和氧化應(yīng)激下,腎組織會(huì)發(fā)生腎小管空泡樣變性、腎小球肥大、腎小球基底膜增厚等病理性改變[14]。通過(guò)HE染色觀察到,經(jīng)SY治療后,DN小鼠腎小管空泡樣病變、腎小球肥大及腎小球基底膜增厚等病理改變均得到改善,提示其具有改善腎功能的作用。

血糖升高時(shí)經(jīng)denovo合成酶途徑生成的二酰甘油(DAG)含量增加,可激活蛋白激酶C(PKC)通路,PKC是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族的一員,是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和功能的關(guān)鍵酶[15]。PKC通路的激活是導(dǎo)致糖尿病腎病發(fā)病的重要原因之一[11]。一方面,PKC的活化可激活PKC/Ras-Raf-MEK-ERK通路,進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路,使炎癥因子TNFα、IL-6和IL-1β的釋放增加[16-17]且其表達(dá)隨著DN的進(jìn)展不斷升高[17],介導(dǎo)與DN有關(guān)的多種生物效應(yīng)[18]。本研究結(jié)果表明,SY可降低通路蛋白PKCβ、P-ERK、P-Raf的表達(dá),這可能是SY改善DN小鼠腎損傷的作用機(jī)制;同時(shí)炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)減少,說(shuō)明SY可以通過(guò)減少炎癥因子的表達(dá)水平從而對(duì)DN有改善作用。另外,PKC通路的活化可增加氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶;GSH是體內(nèi)重要的還原劑[20];MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物分解產(chǎn)物[21],可間接反映組織過(guò)氧化損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SY可增加DN小鼠體內(nèi)SOD、GSH的含量,降低MDA的含量,表明SY可以通過(guò)減輕氧化應(yīng)激從而對(duì)DN有改善作用。

綜上所述,紅花黃色素可能是通過(guò)抑制PKC/Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路以及減輕氧化應(yīng)激,達(dá)到抗炎作用和抗氧化作用,進(jìn)而對(duì)糖尿病腎病小鼠的腎組織起治療作用。在后續(xù)的深入研究中,將選擇臨床療效較好的藥物作為陽(yáng)性藥,設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組,進(jìn)一步研究紅花黃色素對(duì)糖尿病腎病的治療作用。