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(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

隨著全球人口老齡化的加劇,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-2],迫切需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究以應(yīng)對(duì)CVD的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。CVD的發(fā)生常伴有心肌缺血性損傷,成功制備心肌缺血損傷動(dòng)物模型是研究心肌梗死類疾病病理機(jī)制和藥物治療的重要環(huán)節(jié)。因此,建立與人的心肌缺血癥狀接近的動(dòng)物模型尤為重要。常用的模型制備方法有手術(shù)法、藥物誘導(dǎo)法等[3]。手術(shù)法的操作較為復(fù)雜,大鼠的個(gè)體差異和術(shù)者的水平參差不齊等因素往往導(dǎo)致大鼠存活率及造模成功率下降[4-5]。藥物誘導(dǎo)法對(duì)大鼠的損傷較小,具有實(shí)驗(yàn)周期短、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的要求較低等優(yōu)勢(shì)。異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)可激動(dòng)心臟β1受體使心肌產(chǎn)生正性作用,導(dǎo)致血管強(qiáng)烈舒張引起舒張壓明顯下降,進(jìn)而導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈灌流不足,使大鼠持續(xù)產(chǎn)生心功能障礙和左心室擴(kuò)張,ISO心肌缺血模型是誘導(dǎo)心肌損傷的一種簡單、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、快速的模型[6]。國內(nèi)外通常使用中等劑量ISO 10~120 mg/kg連續(xù)兩次或多次皮下注射方式和高劑量ISO 150~400 mg/kg以單次劑量或連續(xù)兩次施用的方式制備急性心肌損傷模型,高劑量ISO制備模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率較高[7]。另外,有研究表明短時(shí)間內(nèi)通過皮下和腹腔注射ISO所引起的心肌損傷差異不大[8]。所以本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射的方式給予大鼠中等劑量的ISO制備急性心肌損傷模型。通過評(píng)價(jià)不同劑量ISO對(duì)大鼠左室功能的影響,以建立簡單易行的大鼠急性心肌損傷模型,為研究人員選擇合適的造模方法提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠共32只,雄性,8~10周齡,體重230~250 g,由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供[SCXK(遼)2015-0001],實(shí)驗(yàn)環(huán)境為齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(黑)2016-001]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)評(píng)審?fù)ㄟ^(QMU-AECC-2019-53),按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

ISO(美國sigma公司W(wǎng)XBC3929V);氯化鈉注射液(河北天成藥業(yè)C17010901);TTC試劑盒(北京藍(lán)博斯特生物CT29142210)。泰盟BL-420S生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)、抗干擾鼠臺(tái)(成都泰盟);轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(Leica Biosystems);組織研磨刀(德國IKA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與模型建立

將大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只:正常對(duì)照組、高劑量模型組、中劑量模型組、低劑量模型組。采用頸部皮下多點(diǎn)注射ISO的方法復(fù)制心肌損傷動(dòng)物模型,高、中、低劑量模型組皮下注射ISO劑量分別為100 mg/kg,50 mg/kg和25 mg/kg,每天1次,連續(xù)2 d,最后一次給藥24 h后麻醉大鼠做心電圖檢測(cè),Control組給予等量的生理鹽水。

1.3.2 各組大鼠心電圖檢測(cè)

大鼠麻醉后固定于抗干擾鼠臺(tái),將三個(gè)針形電極扎入大鼠皮下右上肢,右下肢,左下肢相應(yīng)位置,連接泰盟BL-420S生物信號(hào)采集系統(tǒng),選擇對(duì)應(yīng)通道,輸入信號(hào)為心電圖,待波形穩(wěn)定后連續(xù)描記大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖2 min[9]。

1.3.3 各組大鼠TTC染測(cè)量心肌梗死面積

大鼠麻醉后,開胸取出心臟,剪下右心室,將左心室心肌橫向切成2~3 mm薄片,置于1% TTC磷酸緩沖液中染色,37℃恒溫水浴5~10 min,取出放入10%甲醛溶液中固定,正常心肌組織染呈紅色,梗死區(qū)呈白色[10]。

1.3.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理學(xué)形態(tài)

參照文獻(xiàn)方法[11]操作,取大鼠心肌組織置于4%多聚甲醛中保存,常規(guī)制備石蠟組織切片,蘇木精-伊紅染色后,固定封片,光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠心肌組織病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,單因素方差分析用于比較組間差距。P<0.05差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、心重和左室重比較

不同劑量模型組與正常對(duì)照組比較,大鼠心重及左室重均明顯升高,差異均由統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表1。

表1 不同劑量異丙腎上腺素對(duì)大鼠體重、心重和左室重的影響(n=8)Table 1 Effect of different dose of ISO on the body weight,heart weight and left ventricle weight in rats

2.2 各組大鼠心電圖(ECG)結(jié)果比較

分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)開始前和最后一次給藥24 h后大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖,每只動(dòng)物測(cè)定十個(gè)心電周期,手動(dòng)測(cè)量ECG各參數(shù)。結(jié)果見下表2,圖1。檢測(cè)結(jié)果表明,大鼠個(gè)體間心電圖結(jié)果差異較大,與Control組相比,高劑量模型組的P波時(shí)程增加(P<0.01),低劑量模型組與高劑量模型組P波波幅增加(P<0.05,P<0.01),同時(shí)大鼠出現(xiàn)了心律不齊的心電圖表現(xiàn)。

表2 不同劑量異丙腎上腺素對(duì)大鼠心電圖的影響(n=8)Table 2 Effect of different dose of ISO on ECG in rats

2.3 各組大鼠心肌組織氯化三苯基四氮唑(TTC)染色結(jié)果比較

TTC染色后存活心肌被染為紅色,梗死區(qū)因不著色而呈現(xiàn)白色。染色結(jié)果顯示高劑量模型組與對(duì)照組相比白色區(qū)面積明顯增大,中劑量模型組和低劑量模型組白色區(qū)面積相對(duì)較小,以上結(jié)果表明各模型組大鼠心肌均有不同程度損傷,其中高劑量模型組損傷最為嚴(yán)重,結(jié)果見圖2。

2.4 各組大鼠心肌組織HE染色比較

HE染色顯示,對(duì)照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)清晰,橫紋排列整齊,細(xì)胞核卵圓居中。不同劑量模型組心肌組織出現(xiàn)病理性色素沉著,部分細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、溶解、碎裂;出現(xiàn)炎性反應(yīng)帶,炎性細(xì)胞浸潤,以心肌內(nèi)膜面尤為嚴(yán)重;中劑量模型組與高劑量模型組部分出現(xiàn)壞死,見圖3。

3 討論

心肌損傷、缺血梗死是臨床多種心血管疾病的主要病因,成功制備心肌損傷動(dòng)物模型是研究心肌梗死類疾病病理機(jī)制和藥物治療的重要環(huán)節(jié)。ISO可引起舒張壓明顯下降,冠脈灌流壓下降,心肌細(xì)胞缺血缺氧,通過氧化應(yīng)激,Ca2+超載,細(xì)胞自噬與凋亡等多種因素造成心肌細(xì)胞損傷[12]。心肌缺血、壓力負(fù)荷過重或交感神經(jīng)過度興奮等多種原因均導(dǎo)致心肌損傷,從而引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常,最終導(dǎo)致心室收縮功能或舒張功能發(fā)生障礙[13]。超聲心動(dòng)圖、核磁共振、左心室插管以及心臟稱重等均可用于大鼠心臟功能的測(cè)定,心電圖是臨床檢查中診斷心率失常、心肌受損的重要方法之一,因此通過無創(chuàng)性的心電圖檢測(cè)評(píng)價(jià)大鼠心臟損傷具備一定的協(xié)助診斷價(jià)值[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠麻醉狀態(tài)下心電圖和人體心電圖有相似之處,有明顯的P波和QRS波群,但大鼠心率比較快,心室波形沒有明顯的ST段。與正常對(duì)照組比較,不同劑量模型組大鼠心重及左室重均明顯升高,實(shí)驗(yàn)開始前各組大鼠心電圖均正常,與Control組相比,高劑量模型組的P波時(shí)程增加,低劑量模型組與高劑量模型組P波波幅增加,同時(shí)大鼠出現(xiàn)了心律不齊的心電圖表現(xiàn)。P波振幅增加表明右房擴(kuò)大,P波時(shí)程增加表明左房擴(kuò)大,兩者同時(shí)增加表明雙房擴(kuò)大,同時(shí)結(jié)合心重和左室重測(cè)量結(jié)果,表明大鼠處于代償性心臟肥大。TTC是一種脂溶性光敏感復(fù)合物,常用作染色劑檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗塞,它與組織中脫氫酶反應(yīng)產(chǎn)生紅色的脂溶性物質(zhì),但梗死組織中脫氫酶活性下降不能與其反應(yīng),故不被染色呈蒼白色[15]。TTC染色結(jié)合HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),中劑量和高劑量模型組心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重,出現(xiàn)心肌細(xì)胞壞死,炎細(xì)胞浸潤及心肌梗死等損傷性表現(xiàn)。上述研究結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)中高劑量、中劑量和低劑量模型大鼠心肌均有不同程度損傷,高劑量模型組心肌損傷最嚴(yán)重。

注:A:對(duì)照組建模前;B:低劑量組建模前;C:中劑量組建模前;D:高劑量組建模前;E:空白組建模后;F:低劑量組建模后;G:中劑量組建模后;H:高劑量組建模后;I:低劑量組心律失常;J:高劑量組心律失常。圖1 不同劑量異丙腎上腺素作用前后大鼠心電圖Note.A,Control before modeling.B,Model-L before modeling.C,Model-M group before modeling.D,Model-H before modeling.E,Control after modeling.F,Model-L after modeling.G,Model-M after modeling.H,Model-H after modeling.I,Model-L,arrhythmia.J,Model-H,arrhythmia.Figure 1 Electrocardiogram of rats before and after the action of different dose of isoproterenol

注:A:對(duì)照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組。圖2 不同劑量異丙腎上腺素作用大鼠心肌組織TTC染色Note.A,Control group.B,Model-L group.C,Model-M group.D,Model-H group.Figure 2 TTC staining of ventricular tissue of rats treated by different dose of isoproterenol

注:a:對(duì)照組;b:低劑量組;c:中劑量組;d:高劑量組圖3 不同劑量異丙腎上腺素作用大鼠心肌組織HE染色Note.a,Control group.b,Model-L group.c,Model-M group.d,Model-H group.Figure 3 HE staining of ventricular tissue of rats treated by different dose of isoproterenol

目前國內(nèi)外有多種方法用來制備急性心肌損傷模型,例如低溫冷凍法、冠脈微栓塞法、藥物誘導(dǎo)法(ISO、阿霉素),最常用的便是外科手術(shù)結(jié)扎法[16]。以往的研究報(bào)道,外科手術(shù)結(jié)扎法的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率可達(dá)30%~40%,并且在麻醉、氣管插管、開胸體位、冠脈結(jié)扎位置及術(shù)后護(hù)理等各個(gè)環(huán)節(jié)的操作均影響造模的成功率[17]。冷凍法的操作相對(duì)簡單,死亡率相對(duì)較低,模型復(fù)制的穩(wěn)定性較高,但心肌梗死位置更集中在心外膜,不能很好的模擬臨床上患者的發(fā)病機(jī)制[18]。冠脈微栓塞法雖不進(jìn)行外科手術(shù),但以往只應(yīng)用于大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌損傷的制備,大鼠等小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用較少,實(shí)驗(yàn)難度大,對(duì)研究人員的要求較高[19]。阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型在給藥劑量、給藥方式和給藥時(shí)間上國內(nèi)外尚未統(tǒng)一,若腹腔注射藥物,則大鼠胃腸道癥狀明顯,生存率較低[20-21]。本實(shí)驗(yàn)使用ISO皮下注射法避免了氣管插管和冠脈結(jié)扎等手術(shù)操作對(duì)大鼠造成的創(chuàng)傷和感染,實(shí)驗(yàn)周期短。實(shí)驗(yàn)人員僅需掌握相關(guān)的基礎(chǔ)操作和控制藥物的劑量便可復(fù)制大鼠急性心肌損傷模型。有較高的實(shí)用性、可靠性和較低的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率,造模成功率高[22]。不足在于不能人為控制大鼠心肌損傷部位,不能滿足一些需要精確定位實(shí)驗(yàn)的造模需求。另外本實(shí)驗(yàn)局限性是沒有評(píng)估大鼠超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)和生化參數(shù)的改變,期望相關(guān)的實(shí)驗(yàn)人員能夠進(jìn)行進(jìn)一步的研究。ISO誘導(dǎo)的大鼠急性心肌損傷模型不僅簡單且效果可靠,希望此模型能為后續(xù)關(guān)于缺血/梗死類心臟疾病的相關(guān)機(jī)制研究提供依據(jù)和指導(dǎo)。