李盼盼符 健陳 偉陳 麗

(1.海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院)感染科,?？?570100;2.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部,海口 570100)

暴發(fā)性肝功能衰竭(fulminant hepatic failure,FHF)是一種以急性嚴(yán)重肝損害為特征的臨床綜合征,又稱為暴發(fā)性肝炎或急性肝衰竭[1]。FHF主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)大面積壞死及凋亡,肝功能出現(xiàn)嚴(yán)重失代償,導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。肝細(xì)胞凋亡可由細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外信號通路觸發(fā),如DNA損傷、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)等。已知ERS出現(xiàn)在多種肝病中,如病毒性肝炎、藥物性肝損傷、心臟缺血再灌注損傷等[3-5]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)在病理?xiàng)l件下受到干擾時(shí),未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein reaction,UPR)被激活,UPR進(jìn)一步激活ERS相關(guān)蛋白,ERS相關(guān)蛋白包括真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation-initiation factor 2α,eIF2α)、激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP),eIF2α/ATF4/CHOP通路在ERS和UPR條件下,可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[6]。研究發(fā)現(xiàn),eIF2α/ATF4/CHOP通路在抗腫瘤中具有重要作用,地蘭佐米可通過誘導(dǎo)ERS并激活eIF2α/ATF4/CHOP通路,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,表現(xiàn)出良好的臨床抗腫瘤作用[7]。前列地爾即前列腺素E1(Prostaglandin E1,PGE1),是一種血管活性藥物,具有擴(kuò)血管、改善微循環(huán)障礙的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn),PGE1有助于緩解肝硬化患者炎癥狀態(tài),改善肝功能,提高臨床療效[9]。Guo等[6]研究還指出,PGE1具有防止ERS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的功能。研究發(fā)現(xiàn),促肝細(xì)胞生長素可改善急慢性肝炎患者肝功能指標(biāo),縮短治療時(shí)間,用藥安全[10],因此,本研究將其作為陽性對照藥物。因此本研究通過制備FHF大鼠模型,探究PGE1對FHF大鼠eIF2α/ATF4/CHOP通路及肝功能的影響,以期為臨床治療FHF篩選新的治療藥物。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD雄性大鼠96只,5周齡,體重150~180 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(粵)2019-0002],大鼠飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(瓊)2020-0007],所有動(dòng)物均嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng),溫度為25℃,濕度為60%。實(shí)驗(yàn)符合3R原則,本研究經(jīng)海南省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(202001037)。

1.2 主要試劑與儀器

D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖(E.coliendotoxin lipopolysaccharide,LPS)(批 號 分 別 為:G0500、L4516,美國Sigma公司);PGE1(前列地爾注射液,批號:20190912,北京泰德制藥股份有限公司);促肝細(xì)胞生長素注射液(批號:20191218,威海賽洛金藥業(yè)有限公司);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(Total bilirubin,TBIL)檢測試劑盒(批號分別為:M30679、M31447、M30175,上海信帆生物科技有限公司);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(批號:G1120,德國默克公司);TRIzol試劑(批號:15596026,美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號分別為:SL-30779、A53225,賽默飛世爾科技中國有限公司);SYBR Premix Ex Taq實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒(批號:RR036A,大連TaKaRa公司);兔抗鼠磷酸化-eIF2α(phosphorylation-eIF2α,p-eIF2α)、eIF2α、ATF4、CHOP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、GAPDH一抗(批號分別為:ab169528、ab184909、ab11419、ab133619、ab123977、ab10009,美國Abcam公司);羊抗鼠二抗(批號:7074P2,美國CST公司)。全自動(dòng)生化分析儀(型號:CS-400B,上海寰熙醫(yī)療器械有限公司);光學(xué)顯微鏡(型號:CX43,日本奧林巴斯公司);紫外分光光度計(jì)(型號:Alpha-1860Plus,上海譜元儀器有限公司);qRT-PCR儀(型號:7300,美國ABI公司);電泳儀(型號:JY-SCZ2+、北京君意生物科技有限公司);凝膠成像儀(型號:Gel Doc EZ,上海艾研生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制作

大鼠96只適應(yīng)性觀察喂養(yǎng)一周,隨機(jī)抽取16只作為對照,其余80只為造模組。手術(shù)前12 h禁止飲食,飲水自由。稱重標(biāo)記后,俯臥位固定于手術(shù)臺,用1 mL無菌生理鹽水溶解D-GalN(300 mg/kg)-LPS(30 μg/kg)后腹腔注射[11],此模型是肝衰竭的經(jīng)典模型,能準(zhǔn)確反應(yīng)肝細(xì)胞功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化,重復(fù)性好。造模4 h后隨機(jī)抽取造模組及對照大鼠各1只,取肝組織HE染色觀察肝病理變化,另將所有大鼠經(jīng)剪尾采血檢測肝功能(ALT、AST、TBIL),較對照組明顯升高(P<0.05)視為造模成功。排除死亡、造模不成功的4只大鼠,共造模成功76只(1只用于驗(yàn)證是否成功,另外75只分成五組),成功率95%。對照組大鼠注入等量滅菌生理鹽水。

1.3.2 動(dòng)物模型的分組及給藥

造模大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分成5組,包括模型組(n=15)、陽性對照組(n=15)、低、中、高劑量PGE1組(每組n=15);1.3.1中剩下的15只正常大鼠作為對照組。造模6 h后,陽性對照組大鼠尾靜脈注射促肝細(xì)胞生長素1.36 mg/kg[12];低、中、高劑量PGE1組大鼠分別尾靜脈注射PGE1 12.5、25、37.5 μg/kg[13];每天1次,連續(xù)給藥3 d,對照組和模型組尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1.3.3 大鼠肝功能水平的檢測及HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化

造模72 h后,采用1%戊巴比妥鈉4 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,麻醉生效后,將大鼠采取仰臥位,無菌條件下切口開腹,腹主動(dòng)脈采血,離心收集血清,測定ALT、AST、TBIL水平。獲取大鼠肝組織100 mg,15%福爾馬林液固定后,常規(guī)石蠟包埋,4 μm切片。使用二甲苯脫蠟,再使用從低到高濃度的乙醇進(jìn)行水化。水化后使用蘇木精進(jìn)行染色,流水稍洗去燃料,再用0.1%鹽酸乙醇進(jìn)行分化,然后水洗去多余染料。伊紅液染色,染色后流水洗去多余染料。水洗后再用從低到高濃度的乙醇進(jìn)行醇洗以及脫水處理。最后用二甲苯進(jìn)行透明,用樹脂進(jìn)行封片,置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.4 qRT-PCR法檢測大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平

取大鼠肝組織并剪碎,按照TRIzol法提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測總RNA純度及濃度,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為20 μL:2×SYBR Mix 10 μL,H2O 8 μL,正反向引物各0.5 μL,模板1 μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性10 s、60℃退火30 s,72℃40 s,40個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測大鼠肝組織中p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白表達(dá)水平

取大鼠肝組織并剪碎,添加蛋白裂解液置于冰上30 min,離心后收集上清液,參照BCA蛋白濃度測定試劑盒測定肝組織中蛋白總濃度,配制10%分離膠、5%濃縮膠,取50 μg蛋白上樣,待蛋白樣品剛進(jìn)入濃縮膠時(shí)電壓設(shè)置為80 V,進(jìn)入分離膠后,電壓升高至120V,電泳結(jié)束后,將目的條帶凝膠切除,目的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,冰上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜反應(yīng),電壓為100 V,反應(yīng)時(shí)間1 h,結(jié)束后用TBST溶液清洗,加入5%脫脂牛奶室溫下進(jìn)行1 h封閉,TBST溶液清洗后,加入 一 抗(p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3、GAPDH,稀釋倍數(shù)均為1∶1000),4℃過夜,TBST清洗后加入羊抗鼠二抗(稀釋倍數(shù)1∶5000),室溫下孵育2 h,TBST清洗后,ECL顯色置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)采用Image J軟件對Western blot條帶進(jìn)行采集分析,并計(jì)算目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參GAPDH的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)有差異進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q法進(jìn)行檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05為差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)的比較

各組大鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組、低、中、高劑量PGE1組大鼠血清ALT、AST、TBIL明顯降低(P<0.05);且隨著PGE1給藥劑量的增加,低、中、高劑量PGE1組大鼠血清ALT、AST、TBIL依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性;與陽性對照組相比,低、中劑量PGE1組大鼠血清ALT、AST、TBIL明顯升高(P<0.05),高劑量PGE1組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)的比較(ˉx±s,n=15)Table 2 Comparison of liver function related indexes of rats in each group

2.2 PGE1對大鼠肝組織病理學(xué)的影響

對照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊、致密、形態(tài)完整,未出現(xiàn)病理學(xué)損害;模型組大鼠肝細(xì)胞廣泛變性并有局灶性壞死,空泡細(xì)胞質(zhì),中央靜脈受損;陽性對照組大鼠用藥后肝細(xì)胞損害有所緩解;PGE1組隨藥物濃度的升高,肝細(xì)胞損害有所降低,細(xì)胞變形減輕,壞死細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。見圖1。

2.3 各組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA水平的比較

各組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA水平均升高(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組及低、中、高劑量PGE1組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA水平均降低(P<0.05);且隨著PGE1給藥劑量的增加,低、中、高劑量PGE1組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA水平依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性;與陽性對照組相比,低、中劑量PGE1組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA水平均升高(P<0.05),高劑量PGE1組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA水平無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3 mRNA水平的比較(ˉx±s,n=15)Table 3 Comparison of eIF2α,ATF4,CHOP and Caspase-3 mRNA levels in liver tissue of rats in each group

2.4 各組大鼠肝組織中p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白表達(dá)水平的比較

各組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠肝組織中p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白水平均升高(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組及低中高劑量PGE1組大鼠肝組織中p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白水平均降低(P<0.05);且隨著PGE1給藥劑量的增加,低、中、高劑量PGE1組大鼠肝組織中p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白水平依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性;與陽性對照組相比,低、中劑量PGE1組大鼠肝組織中p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白水平均升高(P<0.05),高劑量PGE1組大鼠肝組織中p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白水平無顯著差異(P>0.05)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠肝組織中p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白表達(dá)水平的比較(ˉx±s,n=15)Table 4 Comparison of protein expression levels of p-eIF2α/eIF2α,ATF4,CHOP and Caspase-3 in liver tissue of rats in each group

注:A:對照組;B:模型組;C:陽性對照組;D:低劑量PGE1組;E:中劑量PGE1組;F:高劑量PGE1組。圖1 PGE1對大鼠肝組織病理學(xué)的影響(HE染色)Note.A,Control group.B,Model group.C,Positive control group.D,Low dose PGE1 group.E,Medium dose PGE1 group.F,High dose PGE1 group.Figure 1 Effect of PGE1 on liver histopathology in rats(HE staining)

注:A:對照組;B:模型組;C:陽性對照組;D:低劑量PGE1組;E:中劑量PGE1組;F:高劑量PGE1組。圖2 各組大鼠肝組織中p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP及Caspase-3蛋白表達(dá)水平Note.A,Control group.B,Model group.C,Positive control group.D,Low dose PGE1 group.E,Medium dose PGE1 group.F,High dose PGE1 group.Figure 2 Protein expression levels of p-eIF2α,eIF2α,ATF4,CHOP and Caspase-3 in liver tissue of rats in each group

3 討論

FHF是一種復(fù)雜的臨床綜合征,由多種病因引起,如肝炎病毒感染、藥物的毒性反應(yīng)、自身免疫性肝病等,臨床表現(xiàn)出大量肝細(xì)胞壞死和嚴(yán)重肝功能損傷,且在首發(fā)癥狀出現(xiàn)8周內(nèi)發(fā)生肝性腦病[14]。當(dāng)前針對FHF缺乏有效治療手段,病死率高,急需治療FHF的有效方法。

PGE1是一種天然的內(nèi)源性血管舒張藥,在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能上具有重要作用,臨床上用于多個(gè)系統(tǒng)疾病的治療,如心腦血管疾病、肝腎綜合征、呼吸系統(tǒng)疾病等[15]。研究表明,PGE1對肝具有顯著的保護(hù)作用,對于改善肝微循環(huán)、擴(kuò)張肝血管,增加肝血竇流量,促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成,加速肝細(xì)胞再生等方面具有重要作用[16]。因此探究PGE1對FHF的影響,對探明如何防治FHF具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),PGE1可通過改善肝微循環(huán)提高重癥肝炎患者肝功能指標(biāo),且不增加不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)[17]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL升高;與模型組比較,低、中、高劑量PGE1組大鼠血清ALT、AST、TBIL依次降低,高劑量PGE1組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平與陽性對照組無明顯差異。提示PGE1同陽性對照藥物具有相似作用,均可降低FHF大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL水平,進(jìn)而改善肝功能,且呈劑量依賴。宋景春等[18]研究發(fā)現(xiàn),PGE1聯(lián)合核苷類抗病毒藥物可以明顯改善乙肝病毒感染失代償期肝硬化患者的肝功能,減輕肝纖維化程度、抑制血清炎性因子產(chǎn)生,臨床療效顯著。病理學(xué)結(jié)果也顯示,對照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊、致密、形態(tài)完整,未出現(xiàn)病理學(xué)損害;模型組大鼠肝細(xì)胞廣泛變性并有局灶性壞死,空泡細(xì)胞質(zhì),中央靜脈受損;陽性對照組大鼠用藥后肝細(xì)胞損害有所緩解;PGE1組隨藥物濃度的升高,肝細(xì)胞損害有所降低,細(xì)胞變形減輕,壞死細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。提示PGE1可改善大鼠肝損傷狀況。

ERS是一種重要的細(xì)胞自我防御機(jī)制,由主標(biāo)記物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和三種應(yīng)激傳感器蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)和肌醇需求激酶1α(IRE1α)調(diào)節(jié),短期輕度的ERS會啟動(dòng)促生存途徑;但長期重度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[19]。研究認(rèn)為,輕度的ERS可激活UPR,主要通過磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal regulated kinase,PERK)、肌醇需求酶1、活性轉(zhuǎn)錄因子-6三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白信號通路起到促生存作用[20]。但重度且持久的ERS則導(dǎo)致ERS相關(guān)蛋白通路激活,啟動(dòng)凋亡途徑,對不能挽救的細(xì)胞進(jìn)行清除。在正常生理?xiàng)l件下,PERK由于與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GPR78)結(jié)合而處于非活性狀態(tài),一旦發(fā)生ERS,GPR78與PERK的管腔結(jié)構(gòu)域分離,導(dǎo)致PERK的寡聚化和反式自磷酸化,PERK成為一種能夠促進(jìn)eIF2α亞單位磷酸化的活性激酶,促進(jìn)eIF2α水平升高,eIF2α則進(jìn)一步誘導(dǎo)ATF4的優(yōu)先翻譯,在長時(shí)間ERS條件下,當(dāng)肝細(xì)胞自我適應(yīng)性調(diào)節(jié)失敗時(shí),PERK還可能通過激活下游CHOP來觸發(fā)促凋亡信號,從而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡[21]。細(xì)胞凋亡受到多種基因的調(diào)控,Caspase-3為主要的凋亡執(zhí)行蛋白,被激活后能分解細(xì)胞的骨架蛋白、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu),參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程[22]。研究發(fā)現(xiàn),ERS還可以激活Caspase蛋白家族的級聯(lián)反應(yīng),通過激活Caspase-3觸發(fā)凋亡途徑,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。因此本研究將Caspase-3納入檢測因素,探究肝細(xì)胞凋亡水平。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA及p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3蛋白水平均升高;與模型組比較,低、中、高劑量PGE1組大鼠肝組織中eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA及p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3蛋白水平均逐漸降低;且高劑量PGE1組與陽性對照組各mRNA和蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測PGE1可通過減緩肝細(xì)胞ERS反應(yīng),從而降低eIF2α亞單位磷酸化水平,進(jìn)而減少ATF4的釋放和轉(zhuǎn)錄作用,CHOP等促凋亡蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3等表達(dá)水平降低,最終達(dá)到保肝護(hù)肝的作用。

綜上所述,PGE1可能通過抑制ERS,降低eIF2α/ATF4/CHOP通路表達(dá)水平,進(jìn)而減緩大鼠肝細(xì)胞凋亡進(jìn)程,達(dá)到保肝護(hù)肝的作用。但本研究也存在不足之處,如:未進(jìn)行TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡情況、未在研究中設(shè)計(jì)通路抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證,后續(xù)研究中將完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。