夏一鳴黃曉玲仝慧慧齊浩銘莫麗冬王 辰范維佳黃慧玲?

(1.天津醫(yī)科大學(xué),天津 300070;2.天津市環(huán)湖醫(yī)院,天津市神經(jīng)外科研究所,天津市腦血管與神經(jīng)變性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300350)

基因敲除技術(shù)是通過同源重組將靶基因的某些重要外顯子或功能結(jié)構(gòu)域、甚至所有外顯子敲除掉,導(dǎo)致靶基因的表達(dá)失敗。而條件性基因敲除技術(shù)可以對(duì)感興趣的特異性組織或細(xì)胞中的細(xì)胞進(jìn)行時(shí)空特異性的敲除,卻不造成生物本身的死亡。自從1994年Gu等[1]第一次報(bào)道了利用噬菌體P1的Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶Cre重組酶條件性敲除DNA聚合酶β片段后,在新型基因打靶中,Cre-loxP重組系統(tǒng)獲得廣泛應(yīng)用,成為條件性打靶技術(shù)、誘導(dǎo)性基因打靶、時(shí)空特異性基因打靶策略核心。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的迅速崛起,使用CRISPR/Cas9技術(shù)和Cre-loxP技術(shù)條件性敲除小鼠或大鼠已成為基因敲除研究的新型方式。

?；撬?taurine,Tau)是一種內(nèi)源性的含硫β-氨基酸,化學(xué)結(jié)構(gòu)式為H2N-CH2-CH2-SO3H。Tau雖不參與蛋白質(zhì)的合成,但是具有非常廣泛的營(yíng)養(yǎng)生理作用[2]。Tau能夠改善低蛋白孕鼠甲狀腺功能,可以促進(jìn)大腦的發(fā)育[3-4]。在腦組織中,Tau含量水平非常高,高達(dá)40 mmol/L[5]。研究表明:長(zhǎng)期缺乏Tau將導(dǎo)致腦萎縮、心力衰竭、視網(wǎng)膜病或免疫缺陷[6-7]。文獻(xiàn)報(bào)道以及我們的前期研究顯示:Tau對(duì)維持機(jī)體正常功能有廣泛的生物學(xué)作用,對(duì)神經(jīng)組織缺血、缺氧及缺血再灌注損傷具有明顯的防治作用[8]。

Tau主要是通過細(xì)胞膜上高親和性的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體(taurine transporter;TauT;slc6a6)逆濃度梯度主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),以維持腦細(xì)胞內(nèi)的Tau高濃度(胞內(nèi)濃度約為細(xì)胞外的400倍),調(diào)節(jié)腦細(xì)胞滲透壓[9]。TauT由621個(gè)氨基酸組成,分子質(zhì)量約為70×103,存在于細(xì)胞膜上,包含12個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。一個(gè)分子的Tau的主動(dòng)攝取需要2~3個(gè)鈉離子和1個(gè)氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞質(zhì)[10]。TauT的活性對(duì)Tau的轉(zhuǎn)運(yùn)起著至關(guān)重要的作用。

我們的課題一直關(guān)注Tau對(duì)神經(jīng)疾病后線粒體功能的影響,我們的研究和文獻(xiàn)報(bào)道也證實(shí):Tau對(duì)線粒體功能穩(wěn)定具有重要的保護(hù)作用[11-12]。線粒體(mitochondrion)被稱為細(xì)胞的氧化中心和“動(dòng)力工廠”,為有機(jī)體提供約90%的能量。線粒體參與很多疾病的生理、病理過程。一方面,Tau是線粒體tRNA的組成部分,線粒體tRNA中缺乏Tau修飾會(huì)引起線粒體疾病[13-14]。另一方面,它可抑制多種刺激下介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15-16],Tau的缺乏會(huì)引起線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ、Ⅲ活性降低,ATP生成減少、超氧化物生成增加和自噬的缺陷[17-18]。

傳統(tǒng)Tau缺乏模型的構(gòu)建基本采用加入胍基乙烷磺酸鹽等TauT抑制劑,或者通過喂養(yǎng)不含Tau食物的飼料來抑制Tau的攝入[19-20]。在本課題中,我們首次利用Cre-loxP技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建神經(jīng)特異性敲除TauT基因大鼠模型(TauTloxP/loxP/Cre+),使得TauT基因能夠在大鼠腦組織中穩(wěn)定敲除,克服了傳統(tǒng)Tau缺乏模型的不穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間短等缺點(diǎn)。這為研究Tau對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)中的作用提供了新的長(zhǎng)久模型,并可以在此平臺(tái)下研究TauT在各種神經(jīng)疾病治療和診斷中的作用及分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

神經(jīng)特異性表達(dá)Nestin-Cre雄性大鼠,SPF級(jí),1只,體重200 g(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[SCXK(京)2019-0011]);TauTloxP/WT大鼠雌雄各1只,體重200 g,委托中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所基因工程創(chuàng)制平臺(tái)構(gòu)建;實(shí)驗(yàn)所用的條件性敲除大鼠(TauTloxP/loxP/Cre+大鼠)為Nestin-Cre大鼠和TauTloxP/WT大鼠雜交后獲得。實(shí)驗(yàn)中所用TauTloxP/loxP/Cre+大鼠、野生型SD大鼠(WT大鼠,北京華阜康生物科技股份有限公司購(gòu)買[SCXK(京)2019-0008])均為SPF級(jí)健康雄性大鼠,2月齡大鼠每組各24只,體重(250±30)g。12月齡大鼠每組各2只,體重(850±30)g。

TauTloxP/WT和Nestin-Cre大鼠以及WT大鼠均在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境中飼養(yǎng)[SYXK(津)2019-0002],溫度25℃左右、空氣濕度保持在50%、明暗循環(huán)12 h/d。實(shí)驗(yàn)研究的全部動(dòng)物均遵守3R原則且通過中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員審查(DWLL-20180916和DWLL-20180917)。

1.2 主要試劑與儀器

體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司,Am1345);EasyPure Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司,EE101-12);2×Taq PCR StarMix、總RNA提取試劑盒、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司,KT201、DP419、KR118、FP205);高效RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司,R0010);PageRulerTMPlus Prestained Protein Ladder(美國(guó)Thermo公司,26619);Millipore Western blot ECL(德國(guó)Merck公司,WBKLS0500);TauT一抗(英國(guó)St John’s Laboratory,STJ95923);GAPDH一抗(美國(guó)Proteintech公司,60004-1-lg);HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,ZB-2305、ZB-2301);Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,P0006);動(dòng)物細(xì)胞/組織活性線粒體分離試劑盒、線粒體呼吸鏈復(fù)合物I(NADH-輔酶Q還原酶,Complex I)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物II(琥珀酸-輔酶Q還原酶,Complex II)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物III(輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶,Complex III)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV(正鐵細(xì)胞色素C-氧化還原酶,Complex IV)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物V(F0F1-ATP酶/ATP合成酶,Complex V)的活性比色法定量檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司,GMS10006.2、GMS50007、GMS50008、GMS50009、GMS50010、GMS50083);高電流電泳儀PowerPacTMHC(美國(guó)Bio-RAD公司,1645052);多功能成像系統(tǒng)(法國(guó)Vilber公司,HC006);PCR儀(杭州博日科技股份有限公司,TC-96/G/H(b));熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司,LC480);顯微鏡(日本OLYMPUS公司,BX53);全自動(dòng)免疫組化儀(德國(guó)Leica公司,BOND-Ⅲ);紫外/可見分光光度儀(英國(guó)JENWAY公司,6850)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TauTloxP/loxP/Cre+大鼠的構(gòu)建

TauTloxP/loxP/Cre+大鼠模型構(gòu)建首先需要利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TauTloxP/WT雜合子大鼠。一方面針對(duì)TauT基因第5外顯子390 bp序列兩端設(shè)計(jì)兩個(gè)不同的sgRNA序列(Rat-TauT-gRNA-up:5’-TAGGCCCCTTTGTCCCACAGAC-3’,Rat-TauT-gRNAdown:5’-AAACGTCTGTGGGACAAAGGGG-3’;RTauT-gRNA-up:5’-TAGGGACAGACCCTGTCTCTGG-3’,R-TauT-gRNA-down:5’-AAACCCAGAGACAGG GTCTGTC-3’),合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段,連接到BsaI酶處理的線性化的表達(dá)質(zhì)粒(pUC57-sgRNA)中,經(jīng)質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化后再通過Dra I內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)錄出sgRNA。另一方面構(gòu)建Cas9表達(dá)載體(pST1374-NLS-flag-linker-Cas9),再用Age I內(nèi)切酶線性化轉(zhuǎn)錄出Cas9 mRNA。通過將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA和Cas9 mRNA以及TauT基因第5外顯子兩端各含有一個(gè)loxP序列的供體通過顯微注射法注射進(jìn)SD大鼠受精卵,利用同源重組獲得F0代TauTloxP/WT雜合子大鼠(圖1所示)。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TauTloxP/W T大鼠示意圖Figure 1 TauTloxP/WT rat schematic diagram constructed by CRISPR/Cas9 technology

將獲得的TauTloxP/WT大鼠雜交繁殖得到TauTloxP/loxP純合子大鼠,并和Nestin-Cre大鼠進(jìn)行雜交,獲得TauTloxP/WT/Cre+轉(zhuǎn)基因大鼠,再由TauTloxP/WT/Cre+大鼠和TauTloxP/loxP大鼠雜交得到神經(jīng)特異性TauTloxP/loxP/Cre+基因敲除大鼠。

1.3.2 TauTloxP/loxP/Cre+大鼠PCR鑒定

將出生21 d左右的大鼠,剪趾編號(hào)并提取基因組總DNA,PCR擴(kuò)增目的條帶,電泳成像分析。根據(jù)兩個(gè)loxP外端基因序列設(shè)計(jì)引物。loxP上游引物:5’-ATTCAGTCACTCATCCGTCCCT-3’,下游引物:5’-TCTGACAGTTAAAGAATCTAAGGCTCA-3’,片段大小為712 bp。Cre鑒定上游引物:5’-TACTGACGGTGGGAGAATG-3’,下 游 引 物:5’-CTGTTTCACTATCCAGGTTACG-3’,片段大小為432 bp。將鑒定的TauTloxP/loxP/Cre+大鼠,提取腦組織DNA進(jìn)一步PCR鑒定,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠在腦組織中l(wèi)oxP引物擴(kuò)增條帶為290 bp。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦及各器官TauT基因表達(dá)量

2月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠、WT雄性大鼠腦及各臟器組織研磨后取100 mg左右,提取總RNA,接著反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)。TauT目的基因引物序列:上游5’-GAGGTCATCATAGGCCAGTAC-3’;下 游5’-GTACACATTCAGGAGGGACAC-3’,片段大小為120 bp。GAPDH內(nèi)參引物序列:上游5’-AACTCCCA TTCTTCCACC-3’;下 游5’-ACCACCCTGTTGCT GTAG-3’,片段大小為100 bp。20 μL PCR反應(yīng)體系:2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,ddH2O 7.8 μL,引物各0.6 μL,cDNA模板1 μL。qPCR反應(yīng)條件:95℃15 min預(yù)變性,95℃15 s,60℃1 min,40個(gè)循環(huán)。

qPCR相對(duì)定量分析:2-△△Ct法,其中[△△Ct=(待測(cè)目的基因平均Ct值-待測(cè)內(nèi)參基因平均Ct值)-(對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值)]。

1.3.4 Western blot檢測(cè)TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦及各器官TauT蛋白表達(dá)

2月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠、WT雄性大鼠腦組織及心、肝、腎,勻漿裂解后,11430 r/min心10 min,取上清,Bradford法測(cè)定蛋白濃度。上樣總蛋白濃度為40 μg,SDS-PAGE電泳,70 V,40 min后轉(zhuǎn)120 V至溴酚藍(lán)條帶到底部,300 mA轉(zhuǎn)膜90 min,5%脫脂奶粉封閉2 h,TauT一抗(1∶1000)、GAPDH一抗(1:10000),4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,TauT用山羊抗兔二抗(1∶10000)和GAPDH使用的山羊抗小鼠二抗(1∶10000)常溫孵育2 h,TBST洗膜3次,顯影、成像。

1.3.5 免疫組化及HE染色

選取2月齡、12月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠各2只,用PBS心臟灌注至血液流盡后,換4%多聚甲醛繼續(xù)灌注至大鼠身體僵硬,取腦,4%多聚甲醛固定24 h,脫水,石蠟包埋,切片脫蠟至水后,分別做HE染色和免疫組化。HE染色:蘇木精染色,水洗,伊紅染色,水洗,脫水封片,鏡下觀察。免疫組化:取2月齡大鼠的切片脫蠟至水后,封閉、TauT一抗(1∶100)、沖洗、TauT二抗孵育、沖洗、DAB染色、蘇木精復(fù)染、脫水透明、封片,鏡下觀察并分析。1.3.6 TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織mtDNA拷貝數(shù)檢測(cè)

2月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠、WT雄性大鼠腦組織研磨后取100 mg左右,提取總DNA,使用40 ng DNA作為起始量,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。目的基因COXⅠ上游基因引物:5’-TAATTCGAGCTGAA CTAGGAC-3’,下 游 引 物:5’-TACAAGTCAGTTC CCGAAGC-3’;片段大小143 bp。內(nèi)參基因Rpl4上游基因:5’-CACGCAAGAAGATTCATCGC-3’,下游引物5’-AACAATCTTCTCCGATTTGGC-3’;片段大小194 bp。20 μL PCR反應(yīng)體系:2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,ddH2O 7.8 μL,引物各0.6 μL,模板1 μL。qPCR反應(yīng)條件:95℃15 min預(yù)變性,95℃15 s,60℃1 min,40個(gè)循環(huán)。計(jì)算方法同1.3.3。

1.3.7 TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性測(cè)定

線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活力的測(cè)定,均根據(jù)試劑盒說明書操作執(zhí)行。簡(jiǎn)單來說,將2組大鼠腦組織剪碎勻漿后,1430 r/min,10 min取上清,再9525 r/min,10 min取沉淀,反復(fù)凍融破碎線粒體后,Bradford法測(cè)蛋白濃度,然后使用紫外/可見分光光度儀進(jìn)行線粒體呼吸鏈酶活性測(cè)定。Complex I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別在340 nm、600 nm、550 nm、550 nm、340 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。酶活力計(jì)算公式:【(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))×體系容量(mL)×樣品稀釋倍數(shù)】÷【樣品容量(mL)×毫摩爾吸光系數(shù)×反應(yīng)時(shí)間(min)】=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克。Complex I/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ結(jié)果單位分別為:μmol NADH/(min·mg);μmol DCPIP/(min·mg);μmol CoQH2/(min·mg);μmol CytC/(min·mg);μmol NADH/(min·mg)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn),P<0.05時(shí)表示組間具有顯著差異,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 大鼠構(gòu)建及遺傳分析

基因測(cè)序和序列比對(duì)結(jié)果顯示loxP序列被成功插入在第5外顯子兩端(圖2A、2B)。我們對(duì)插入的loxP序列進(jìn)行遺傳分析。TauTloxP/WT×WT出生的F1代中只有陰性和雜合子;TauTloxP/WT×TauTloxP/WT出生的F2代TauTloxP/loxP大鼠比例為22.2%;TauTloxP/WT×TauTloxP/loxP出生的F3代中TauTloxP/loxP大鼠比例為52.4%。綜上,loxP插入TauT基因第5外顯子兩端后能夠穩(wěn)定的遺傳,且符合孟德爾遺傳定律,結(jié)果如表1所示。

表1 F1~F3代大鼠繁殖情況Table 1 Reproduction of F1~F3 generation rats

2.2 基因型鑒定結(jié)果

新生大鼠腳趾DNA的PCR鑒定結(jié)果如圖3:TauTloxP/loxP純合子為一條帶,712 bp;TauTloxP/WT雜合子為兩條帶,712 bp和632 bp;TauTWT/WT陰性為一條帶,632 bp(圖3A);Cre為一條帶,437 bp(圖3B);TauTloxP/loxP/Cre+大鼠腦組織TauT基因被敲除后條帶大小為290 bp(圖3C)。

注:A:基因測(cè)序結(jié)果顯示第5外顯子兩端插入loxP序列(紅色框);B:與基因組序列比對(duì)結(jié)果顯示第5外顯子兩端loxP序列被插入。圖2 loxP基因序列比對(duì)結(jié)果Note.A,Gene sequencing results showed that loxP sequences were inserted at both ends of the fifth exon(red box).B,Comparison with the genome sequence showed that loxP sequences were inserted at both ends of the fifth exon.Figure 2 loxP gene sequence alignment results

注:M:DNA標(biāo)記;A:1、2:TauTloxP/WT;3、4:TauTWT/WT;5:TauTloxP/loxP;B:1、2、3、4:Cre陽性;C:1:大腦TauT基因敲除結(jié)果;2:小腦TauT基因敲除結(jié)果。圖3 條件性基因敲除大鼠部分PCR鑒定結(jié)果Note.M,DNA marker.A,1/2,TauTloxP/WT.3/4,TauTWT/WT.5,TauTloxP/loxP.B,1,2,3 and 4,Cre positive.C,1,Result of brain TauT gene knockout.2,Result of cerebellar TauT gene knockout.Figure 3 Partial PCR identification results of conditional gene knockout rats

此外,通過RT-PCR顯示:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠大腦和腎組織TauT mRNA表達(dá)量相比較WT組顯著降低;而在心、肝組織中TauT mRNA表達(dá)量沒有顯著差異(如圖4)。

2.3 Western blot及免疫組化檢測(cè)TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織及各器官TauT蛋白的表達(dá)

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠TauT蛋白在腦組織中表達(dá)顯著降低,而在心、肝、腎組織中和WT大鼠蛋白表達(dá)量并無明顯差異(如圖5A、5B)。

此外,通過免疫組化觀察TauTloxP/loxP/Cre+大鼠大腦皮層和海馬(CA3區(qū))和小腦中TauT蛋白表達(dá)與WT組大鼠相比明顯減少,而在心、肝、腎組織兩者無明顯差異。這與免疫印跡結(jié)果一致(如圖6)。

2.4 TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織HE染色結(jié)果

從HE染色結(jié)果顯示:2月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠與WT大鼠相比,大腦皮質(zhì)和海馬DG區(qū)細(xì)胞數(shù)量和密度有所減少(圖7A/7B、7A1/7B1)。而12月齡的TauTloxP/loxP/Cre+大鼠與WT大鼠相比,大腦皮質(zhì)和海馬DG區(qū)細(xì)胞極性消失,結(jié)構(gòu)排列疏松紊亂,細(xì)胞核胞漿分界模糊(圖7C/7D、7C1/7D1)。此外,12月齡大鼠腦皮質(zhì)和海馬DG區(qū)與2月齡大鼠相比,細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松,細(xì)胞排列不規(guī)則,這種現(xiàn)象在12月齡的TauTloxP/loxP/Cre+大鼠中更加明顯(如圖7)。

注:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠TauT mRNA表達(dá)相對(duì)定量分析比較。與WT組比較,??P<0.01。圖4 TauTloxP/loxP/Cre+和WT大鼠腦組織及各器官TauT mRNA表達(dá)情況(n=6)Note.TauT mRNA expression in TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats was compared quantitatively.Compared with WT group,??P<0.01.Figure 4 TauT mRNA expression in brain tissues and organs of TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats

2.5 TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶活性和mtDNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

結(jié)果顯示:和WT大鼠相比,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均顯著低于WT組酶活性,而只有線粒體復(fù)合酶Ⅱ沒有受到影響(如圖8A;表2)。此外,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠腦組織mtDNA表達(dá)量比WT大鼠顯著升高(如圖8B)。

表2 TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性測(cè)定(ˉx±s,n=6)Table 2 Activity of mitochondrial respiratory chain complex enzymes in brain tissues of TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats

注:A:TauTloxp/loxp/Cre+大鼠和WT大鼠心、肝、腦、腎TauT蛋白表達(dá)情況;B:TauTloxp/loxp/Cre+大鼠和WT大鼠組蛋白表達(dá)相對(duì)定量分析比較。與WT組比較,??P<0.01。圖5 TauTloxp/loxp/Cre+大鼠和WT大鼠大鼠腦組織及其它器官TauT蛋白表達(dá)情況(n=6)Note.A,Expression of TauT protein in heart,liver,brain and kidney of TauTloxp/loxp/Cre+rats and WT rats.B,Relative quantitative analysis of TauT protein expression in the TauTloxp/loxp/Cre+and WT groups.Compared with WT group,??P<0.01.Figure 5 TauT protein expression in brain tissues and other organs of TauTloxp/loxp/Cre+rats and WT rats

注:A、A1:2月齡WT大鼠皮質(zhì)、海馬;B、B1:2月齡TauTloxp/loxp/Cre+大鼠皮質(zhì)、海馬;C、C1:12月齡WT大鼠皮質(zhì)、海馬;D、D1:12月齡TauTloxp/loxp/Cre+大鼠皮質(zhì)、海馬。圖7 不同月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦皮質(zhì)、海馬HE染色Note.A/A1,Cortex and hippocampus of 2-month-old WT rats.B/B1,Cortex and hippocampus of 2-month-old TauTloxP/loxP/Cre+rats.C/C1,Cortex and hippocampus of 12-month-old WT rats.D/D1,Cortex and hippocampus of 12-month-old TauTloxP/loxP/Cre+rats.Figure 7 HE staining of cerebral cortex and hippocampus in TauTloxP/loxP/C re+rats and WT rats of different months of age

注:A、B、C、D、E、F:TauTloxp/loxp/Cre+大鼠心、肝、腎、皮質(zhì)、海馬(CA3)、小腦;G、H、I、J、K、L:WT大鼠心、肝、腎、皮質(zhì)、海馬(CA3)、小腦。圖6 TauTloxp/loxp/Cre+大鼠和WT大鼠在心、肝、腎、皮層、海馬和小腦免疫組化結(jié)果比較Note.A/B/C/D/E/F,TauTloxp/loxp/Cre+rat heart,liver,kidney,cortex,hippocampus(CA3),cerebellum.G/H/I/J/K/L,WT rat heart,liver,kidney,cortex,hippocampus,cerebellum.Figure 6 Comparison of immunohistochemical results in the heart,liver,kidney,cortex,hippocampus and cerebellum of TauTloxp/loxp/Cre+and WT rats

注:A:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶活性;B:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦組織mtDNA相對(duì)表達(dá)量。與WT組比較,?P<0.05,??P<0.01。圖8 TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶活性和mtDNA相對(duì)表達(dá)量(n=6)Note.A,Activity of mitochondrial respiratory chain complex in brain tissue of TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats.B,Relative expression levels of mtDNA in brain tissues of TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats.Compared with WT group,?P<0.05,??P<0.01.Figure 8 Activity of mitochondrial respiratory chain complex enzyme in TauTloxP/loxP/Cre+rat and WT rat brain tissues

3 討論

傳統(tǒng)的條件性敲除技術(shù)需要使用胚胎干細(xì)胞的同源重組、胚胎操作、顯微注射和輔助生殖技術(shù)[21],操作繁瑣,實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)[22]。目前,對(duì)于TauT敲除模型的研究,一般通過敲除TauT第1外顯子或者第2~5外顯子形成TauT全身性敲除小鼠,TauT的全身性敲除會(huì)引起心肌功能的損傷和視網(wǎng)膜變形以及運(yùn)動(dòng)能力的減弱[23-24]。眾所周知,大鼠提供的人類疾病模型,尤其是神經(jīng)疾病的行為學(xué)和藥理學(xué)上,大鼠比小鼠提供更有效的生理學(xué)指標(biāo)[25-26]。本文我們用SD大鼠,選擇TauT第5外顯子,運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組中產(chǎn)生精確的雙鏈斷裂,提高了基因打靶的效率,同時(shí)利用同源重組機(jī)制,整合轉(zhuǎn)染的同源DNA模板[27-28]。結(jié)合Cre-loxP技術(shù),構(gòu)建TauT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性敲除大鼠模型。查閱文獻(xiàn),這是在國(guó)際上Tau領(lǐng)域中第一次利用大鼠的TauT基因的條件性敲除報(bào)道,進(jìn)一步證明CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)目的基因的條件性敲除是一種十分可靠的方法[22]。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了TauTloxP/loxP/Cre+大鼠模型,從大鼠繁殖情況來看,插入的loxP序列可以穩(wěn)定遺傳,且符合孟德爾遺傳定律。通過RT-PCR結(jié)果顯示:與WT大鼠比較,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠在腦組織中TauT mRNA表達(dá)水平顯著降低,表明TauT基因的確被明顯敲除。免疫印跡顯示:與WT相比,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠TauT表達(dá)在腦中顯著降低,而在心、肝和腎中TauT表達(dá)并無顯著差異,這與大腦組織的免疫組化結(jié)果一致。對(duì)提取TauTloxP/loxP/Cre+大鼠的小腦做免疫組化結(jié)果也表明了TauT蛋白的敲除。但是在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大腦組織仍有少量的TauT的基因和蛋白表達(dá),這可能與Nestin-Cre大鼠有關(guān)。為了實(shí)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)TauT基因的特異性敲除,Cre重組酶的表達(dá)受大鼠Nestin啟動(dòng)子和內(nèi)含子2增強(qiáng)子控制。Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞特征性標(biāo)志物,在胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)上皮中表達(dá),對(duì)神經(jīng)元分化具有重要作用。由于Nestin神經(jīng)特異性啟動(dòng)只在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá),而我們的樣本是取自大鼠半腦,這其中包含著大量的細(xì)胞類型,可能包含著TauT表達(dá)的細(xì)胞,從而導(dǎo)致產(chǎn)生了少量的TauT表達(dá)。

有趣的是,在對(duì)心、肝和腎組織的TauT mRNA表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn):TauTloxP/loxP/Cre+大鼠的心和肝組織TauT mRNA表達(dá)水平?jīng)]有受到影響,腎組織中TauT mRNA表達(dá)水平卻顯著降低,但不影響其TauT蛋白表達(dá)。這種結(jié)果表明:Nestin-Cre介導(dǎo)的重組不僅發(fā)生在神經(jīng)外胚層,也發(fā)生在腎細(xì)胞類型中。這也證實(shí)了Dubois研究Nestin-Cre大鼠在腎中表達(dá)的結(jié)果[29]。本實(shí)驗(yàn)中我們多次實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠腎的TauT mRNA基因下降而蛋白質(zhì)表達(dá)不變,表明對(duì)于腎,中樞神經(jīng)TauT敲除只是影響其轉(zhuǎn)錄水平,還未出現(xiàn)翻譯水平的變化即蛋白功能的變化。這可能是由于mRNA表達(dá)量的下調(diào)不足以引起蛋白表達(dá)量的變化。一般而言,真核生物中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平所發(fā)生時(shí)間和位點(diǎn)存在時(shí)空間隔,后者因磷酸化等一系列轉(zhuǎn)錄后修飾,對(duì)蛋白功能的調(diào)控比較復(fù)雜。由于不同的半衰期,mRNA和蛋白質(zhì)水平有時(shí)不能直接相關(guān),有時(shí)會(huì)有相反的結(jié)果。

從基因敲除大鼠表型上觀察,我們很難判斷TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠之間的區(qū)別。觀察其生長(zhǎng)1~6月齡體重變化過程中,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠并沒有顯示出明顯的不同,出生也沒有出現(xiàn)致死現(xiàn)象,其腦、心、肝、腎、肺、脾等臟體系數(shù)的比較也無明顯區(qū)別(數(shù)據(jù)未列出)。這與我們同期所構(gòu)建的TauT全身性敲除大鼠會(huì)體重減輕有所不同[30]。對(duì)TauTloxP/loxP/Cre+大鼠的核磁共振檢測(cè),也未發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)大鼠腦部無明顯病變,核磁波譜也顯示ROI區(qū)的Tau水平無明顯差異(數(shù)據(jù)未列出)。但HE染色顯示:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠腦皮質(zhì)、海馬DG區(qū)細(xì)胞數(shù)量和致密度有所減低,這可能是由于TauT的敲除會(huì)導(dǎo)致Tau供給不足,使腦組織細(xì)胞體積調(diào)節(jié)能力降低,從而影響了腦組織細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量的變化。此外,TauT敲除在腦中可能出現(xiàn)時(shí)間累積效應(yīng)。與年老的WT大鼠相比,年老大鼠TauTloxP/loxP/Cre+大鼠腦皮質(zhì)和海馬DG區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)極性消失,結(jié)構(gòu)排列疏松、紊亂以及細(xì)胞核胞漿分界模糊等現(xiàn)象,這些結(jié)果表明TauT敲除會(huì)加速大鼠的衰老。

利用我們所構(gòu)建的TauTloxP/loxP/Cre+大鼠模型,我們初步研究了腦組織線粒體的mtDNA和線粒體呼吸鏈復(fù)合酶I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性。發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的TauT的條件性敲除會(huì)抑制腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合酶I、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性,而復(fù)合酶Ⅱ的活性沒有收受到影響。我們分析,這可能與Tau的抗氧化特性和阻止線粒體滲透性的轉(zhuǎn)變有關(guān)[11],TauT敲除抑制了Tau的攝取,從而導(dǎo)致線粒體抵抗細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和滲透性轉(zhuǎn)變能力降低,線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性降低,ATP合成的減少。而大鼠腦組織mtDNA的拷貝數(shù)可能是對(duì)其線粒體ATP減少所做的代償性的增加[31]。后期我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。

綜上所述,我們用CRISPR/Cas9和Cre-loxp技術(shù)成功構(gòu)建了中樞神經(jīng)系統(tǒng)TauT敲除大鼠模型,發(fā)現(xiàn)TauT的敲除對(duì)腦組織的形態(tài)、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性及mtDNA拷貝數(shù)都有著較顯著影響,為研究Tau及TauT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用提供一種有效的實(shí)驗(yàn)平臺(tái),為進(jìn)一步研究Tau治療神經(jīng)疾病的機(jī)理提供了一種穩(wěn)定而有力的工具。