楊 羽趙菊花黎官印李 達(dá)王 潔陳 穎李 燃

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院,四川 南充 637000)

銀屑病是一種具有強(qiáng)遺傳易感性和自身免疫性致病特征的慢性炎癥性皮膚病[1],對患者的身體健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響[1-3]?？缮仆?司庫奇尤單抗注射液,Cosentyx)是臨床上治療中度至嚴(yán)重斑塊性銀屑病的藥物,通過拮抗IL-17治療銀屑病[4]。最近有研究表明C5a/C5aR1通路在咪喹莫特(IMQ)誘導(dǎo)的小鼠銀屑病皮損中的重要性[5],提示可以通過調(diào)節(jié)C5a/C5aR1信號緩解炎癥反應(yīng),治療銀屑病。但迄今為止,可善挺是否通過C5a/C5aR1通路治療銀屑病尚無報道,因此本試驗(yàn)通過咪喹莫特制造銀屑病小鼠模型,探究可善挺通過C5a/C5aR1通路對銀屑病小鼠皮膚炎癥和自噬的調(diào)控作用,為臨床上治療銀屑病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

27只雄性8周齡BALB/c小鼠,SPF級,體重(25±2)g,購于成都達(dá)碩生物有限公司[SCXK(川)2020-030],實(shí)驗(yàn)在四川大學(xué)華西醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行[SYXK(川)2018-119],本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照3R原則進(jìn)行,并通過了四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會(IACUC)審批(IACUC 2020310A)。

1.2 主要試劑與儀器

可善挺?(1 mL:150 mg,司庫奇尤單抗注射液,Cosentyx,瑞士諾華公司);咪喹莫特(IMQ)乳膏(181201,四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司);兔抗LC3(ab48394)、兔抗Beclin(ab62557)、C1qB兔抗(ab92508)、C3兔抗(ab200999)、C5a兔抗(ab202039)、C5aR1兔抗(ab252435)均購自英國Abcam公司;酶標(biāo)儀(美國,賽默飛);ECL凝膠成像系統(tǒng)(美國,BIO-RAD公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將小鼠隨機(jī)分為3組,每組9只:分別為空白對照組(Blank group)、銀屑病模型組(Psoriasis-model group)、可善挺治療組(Cosentyx-treat group),分組具體處理如下:

空白對照組(Blank group):僅做備皮處理,使小鼠背部暴露出約4 cm×4 cm矩形無毛區(qū)域。如備皮過程中不慎劃傷小鼠皮膚,則立即使用百多邦軟膏外涂于患處避免感染并將受傷小鼠單籠飼養(yǎng)直至傷口痊愈。

銀屑病模型組(Psoriasis-model group):備皮,使小鼠背部暴露出約4 cm×4 cm矩形無毛區(qū)域,用0.06~0.07 g咪喹莫特乳膏均勻涂抹于小鼠背部無毛區(qū)域,厚度約為1~2 mm,充分涂抹以使藥物被皮膚吸收,早晚各一次,涂抹7 d。7 d后小鼠皮膚造模區(qū)域出現(xiàn)鱗屑、紅斑以及脫屑情況,表明造模成功。同時從造模開始的第1、6、13天在銀屑病造模部位附近進(jìn)行皮下注射生理鹽水,1 d兩次(早晚各一次),每次30 μL/kg,兩次則60 μL/kg,避免在銀屑病皮損部位進(jìn)行注射。

可善挺治療組(Cosentyx-treat group):治療組造模方式與模型組相同,然后分別從造模開始的第1、6、13天在銀屑病造模部位附近進(jìn)行皮下注射可善挺?(司庫奇尤單抗注射液),1 d兩次(早晚各一次),每次30 μL/kg,兩次則60 μL/kg,避免在銀屑病皮損部位進(jìn)行注射。

分別在造模第2、7、14天均采用脫頸椎法處死,每次3只,用無菌手術(shù)剪剪取小鼠背部靶皮損皮膚,并將該皮膚組織平均分為若干份保存于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HE染色

將小鼠皮損組織用4%中性甲醛溶液固定,濃度梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,成片,蘇木精與伊紅染色,在顯微鏡下觀察第14天各組小鼠局部皮損組織的病理學(xué)改變拍照并保存。

1.3.3 ELISA檢測

將皮損組織勻漿加入ELISA板中,室溫孵育,洗板5次后加入酶聯(lián)親和物,室溫孵育,洗板,加入底物溶液,室溫下避光孵育,最后加入終止液終止反應(yīng)。測定450 nm處吸光度(A)值。用IL-4、IL-8、TNF-α和IL-1β的標(biāo)準(zhǔn)品分別制備梯度濃度的工作液,測定標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算第2、7、14天局部皮損組織中促炎因子IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β的分泌情況。

1.3.4 髓過氧化物酶(MPO)活性檢測

按照MPO檢測試劑盒說明書(中國,南京建成生物有限公司)將皮損組織與試劑二混合成5%勻漿,加入試劑三,37℃水浴15 min,分裝成兩管,均加入試劑四,然后其中一管加顯色劑,另一管加雙蒸水作為對照,37℃水浴30 min,加入試劑七,60℃水浴10 min,水浴后立即在460 nm處測其吸光度值。然后對第2、7、14天各組小鼠局部皮損組織中性粒細(xì)胞(MPO)的浸潤情況進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算活性值公式如下:

1.3.5 Western blot檢測

通過皮損組織組織蛋白提取、BCA法蛋白濃度確定、SAS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)模、蛋白免疫印跡、顯色反應(yīng)等步驟,顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像,Image-Pro Plus分析光密度,以β-actin為內(nèi)參,空白對照組目標(biāo)蛋白質(zhì)相對含量為1,計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量,以此檢測第2、7、14天各組小鼠自噬相關(guān)基因Beclin 1和自噬體的經(jīng)典標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白在各組小鼠局部皮損組織中的表達(dá)量。

1.3.6 免疫組化法檢測

將小鼠皮損組織切片后,選用3% H2O2阻斷5 min,PBS洗滌,選擇加入對應(yīng)的緩沖液,孵化10 min,洗滌,滴入5% BSA封閉液,室溫孵化30 min,滴入抗體進(jìn)行孵育,洗滌,生物素標(biāo)記,二抗孵育,洗滌,BAD顯色,蘇木素復(fù)染,在顯微鏡下觀察C5a、C3、C5aR1、C1qB的表達(dá)情況,并利用圖像分析利用成像自動分析系統(tǒng)Image-ProPlus進(jìn)行光密度掃描處理,求出各個標(biāo)本的積分光密度(IOD)與面積;平均光密度(AOD)即為積分光密度與面積的比值,代表各組標(biāo)本中細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)強(qiáng)度的變化。免疫組織化學(xué)染色圖片顯示棕黃色為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,分析方法為Duncan多重比較方法,P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 可善挺減緩銀屑病模型小鼠皮膚損傷程度

HE染色結(jié)果見圖1,空白對照組皮膚組織表皮結(jié)構(gòu)完整清晰,角化層明顯,復(fù)層扁平上皮層較薄,細(xì)胞排列較為整齊緊密;真皮內(nèi)膠原纖維交錯排列,胞質(zhì)紅染、均勻;結(jié)締組織與脂肪層結(jié)構(gòu)清晰可見;皮下肌層肌纖維排列整齊,體積大小均一,細(xì)胞核形態(tài)正常,核仁多分布四周;未見明顯病理變化。而通過咪喹莫特造模后,可見復(fù)層扁平上皮層增厚,細(xì)胞排列紊亂,表皮外層覆蓋一層痂皮;真皮淺層部分膠原纖維壞死,壞死區(qū)域內(nèi)可見少量的單個圓形深染的淋巴細(xì)胞浸潤,較多長橢圓形的成纖維細(xì)胞和長梭形的纖維細(xì)胞增生,真皮內(nèi)出血,可見較多紅細(xì)胞滲出于纖維組織之間。經(jīng)可善挺治療后,皮膚復(fù)層扁平上皮層增厚、細(xì)胞排列紊亂、真皮淺層部分膠原纖維壞死、真皮淺層部分內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤和真皮內(nèi)出血情況等均有所改善,表明可善挺能明顯抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病引起的小鼠局部皮膚損傷。

圖1 小鼠皮膚HE染色結(jié)果Figure 1 HE staining results of mouse skin

2.2 可善挺減輕銀屑病模型小鼠皮膚炎癥反應(yīng)

通過對小鼠皮損組織中IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO的分泌量檢測(見圖2)發(fā)現(xiàn),銀屑病模型組小鼠皮損組織中IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO分泌量在第2、7、14天均顯著高于空白對照組(P<0.05),表明咪喹莫特誘導(dǎo)了小鼠局部皮損組織的炎癥。經(jīng)可善挺治療后,第2天,與造模組相比,IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO分泌量均下降(P>0.05),治療第7天,可善挺治療組IL-4分泌量顯著低于造模組(P<0.05),IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO也低于造模組(P>0.05),治療第14天,可善挺治療組IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO分泌量均顯著低于造模組(P<0.05),這些結(jié)果提示可善挺可以降低皮損組織中促炎因子IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β的分泌和減輕中性粒細(xì)胞(MPO)的浸潤情況,從而減輕咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型小鼠皮膚炎癥反應(yīng)。

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖2 皮損組織中IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO的檢測結(jié)果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 2 Results of IL-4,IL-8,TNF-α,IL-1β,and MPO in lesion tissue

2.3 可善挺增強(qiáng)銀屑病模型小鼠皮膚組織自噬活性

Beclin 1和LC3-Ⅱ/LC3-I檢測結(jié)果如圖3所示,銀屑病模型組小鼠Beclin 1相對蛋白表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值在第2、7、14天均顯著低于空白對照組(P<0.05),提示咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病降低了細(xì)胞自噬活性?？缮仆χ委煹?天,治療組Beclin 1相對蛋白表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值均高于模型組,但差異不顯著(P>0.05),治療第7天和治療第14天,治療組Beclin 1相對蛋白表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值顯著高于模型組(P<0.05),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可善挺能增強(qiáng)銀屑病模型小鼠皮膚組織自噬活性。

2.4 可善挺對銀屑病模型小鼠C5a/C5aR1通路的影響

2.4.1 可善挺對銀屑病模型小鼠C1qB分子表達(dá)的影響

免疫組化法檢測小鼠皮損組織C1qB分子表達(dá)結(jié)果圖4所示,結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)的第2天,第7天和第14天咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型組小鼠皮損組織C1qB分子均被廣泛活化。在實(shí)驗(yàn)的第7天和第14天,與銀屑病模型組相比,可善挺治療組小鼠皮損組織中C1qB分子活化被抑制,其中第7天C1qB分子表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

2.4.2 可善挺對銀屑病模型小鼠C3分子表達(dá)的影響

免疫組化法檢測小鼠皮損組織C3分子表達(dá)結(jié)果如圖5所示,結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)的第2天,第7天和第14天咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型組小鼠皮損組織C3分子均被廣泛活化。在實(shí)驗(yàn)的第2天和第7天,與銀屑病模型組相比,可善挺治療組小鼠皮損組織C3分子活化被明顯抑制(P<0.05),表明可善挺抑制了C3分子的表達(dá)。

2.4.3 可善挺對銀屑病模型小鼠C5a分子表達(dá)的影響

免疫組化法檢測小鼠皮損組織C5a分子表達(dá)結(jié)果如圖6所示,結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)的第2天,第7天和第14天咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型組小鼠皮損組織C5aR1分子均被廣泛活化。在實(shí)驗(yàn)的第2天、第7天和第14天,與銀屑病模型組相比,可善挺治療組小鼠皮損組織C5aR1分子活化被抑制,第7天和第14天C5a分子的表達(dá)被顯著抑制(P<0.05)。

2.4.4 可善挺對銀屑病模型小鼠C5aR1分子表達(dá)的影響

免疫組化法檢測小鼠皮損組織C5aR1分子表達(dá)結(jié)果如圖7所示,結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)的第2天,第7天和第14天咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型組小鼠皮損組織C5aR1分子均被廣泛活化。在實(shí)驗(yàn)的第2天和第7天,與銀屑病模型組相比,可善挺治療組小鼠皮損組織C5aR1分子活化被明顯抑制(P<0.05),結(jié)果與C3分子檢測結(jié)果一致。

3 討論

咪喹莫特(IMQ)是銀屑病模型常用的誘導(dǎo)劑,符合銀屑病模型的多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)[6-8],并且IMQ造模簡單,成本低,因此本實(shí)驗(yàn)采用IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型[9]。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果顯示,IMQ誘導(dǎo)的銀屑病模型組小鼠局部損傷皮膚出現(xiàn)了復(fù)層扁平上皮層增厚,細(xì)胞排列紊亂,淋巴細(xì)胞浸潤,纖維細(xì)胞增生等銀屑病組織典型病變,表明IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型建立成功?？缮仆χ委熃MHE染色結(jié)果表明,可善挺一定程度上抑制了小鼠皮膚組織復(fù)層扁平上皮層增厚,淋巴細(xì)胞浸潤,纖維細(xì)胞增生等現(xiàn)象,提示可善挺減緩了銀屑病模型小鼠皮膚損傷程度,MPO檢測結(jié)果也表明,可善挺降低了銀屑病皮損組織中炎性細(xì)胞浸潤。

注:A:Western blot結(jié)果條帶。(1):空白對照組;(2):銀屑病模型組;(3):可善挺治療組;B:Western blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果。組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖3 Western blot檢測皮膚組織中Beclin 1蛋白相對表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)量比值Note.A,Results of Western blot band.(1),Blank group.(2),Psoriasis-model group.(3),Cosentyx-treatment group.B,Statistics of Western blot.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 3 Results of Beclin 1 and LC3-Ⅱ/LC3-I in lesion tissue

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖4 皮損組織C1qB免疫組化檢測結(jié)果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 4 Immunohistochemical result of C1qB in skin lesions

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖5 皮損組織C3免疫組化檢測結(jié)果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 5 Immunohistochemical result of C3 in skin lesions

補(bǔ)體系統(tǒng)作為抵御外來病原體的第一道防線,是先天免疫最重要的分支之一[5]。補(bǔ)體通過經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑匯集到C3分子水平發(fā)揮作用[10]。C1qB是補(bǔ)體經(jīng)典途徑重要分子,通路激活后,補(bǔ)體C3分子活化,然后C3分子通過活化下游C5a/C5aR1通路進(jìn)而參與疾病的發(fā)生[11],此外,補(bǔ)體活化過程產(chǎn)物C3a(C3裂解產(chǎn)物)和C5a也會參與炎癥反應(yīng)[12]。有研究表明補(bǔ)體系統(tǒng)參與了銀屑病炎癥過程,C5a/C5aR1通路可以調(diào)節(jié)銀屑病小鼠皮損組織中TNF-α,IFN-α/γ,IL-17A,IL-22,IL-23A等促炎因子的表達(dá)[5]。而銀屑病是一種以Th1、Th2和Th17炎癥軸失衡為特征的疾病[13],可善挺是IL-17A拮抗劑[14],研究表明可善挺可以通過拮抗IL-17治療銀屑病[4],但尚無人研究可善挺是否通過C5a/C5aR1信號通路調(diào)節(jié)銀屑病炎癥。因此,本研究準(zhǔn)備補(bǔ)上這個空白,我們實(shí)驗(yàn)證明可善挺可能通過抑制C5a/C5aR1通路,降低IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β炎癥因子的表達(dá),提示靶向抑制C5a/C5aR1信號通路可能是一種新的治療銀屑病的方法。

自噬是細(xì)胞受到應(yīng)激時消除受損或有害成分,從而使細(xì)胞存活的細(xì)胞過程[15-17]。Beclin1(也稱為Atg6)是自噬初始階段雙膜自噬體形成所必需的因子[18],主要通過與其他自噬相關(guān)蛋白如Bcl-2、Vps34等結(jié)合形成巨大的蛋白復(fù)合物來促進(jìn)自噬的啟動[19]。LC3與自噬空泡的數(shù)量成正比,LC3-I向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是自噬活化的標(biāo)志[20-22]。補(bǔ)體系統(tǒng)與細(xì)胞自噬也具有相關(guān)性,自噬過程中,C3可以通過C3/ATG16L1通路激活細(xì)胞自噬[23]。有研究表明,在糖尿病條件下,C3蛋白維持自噬,防止β細(xì)胞死亡[23]。在生理?xiàng)l件下,補(bǔ)體蛋白C3沉積在細(xì)菌上,通過直接的C3/ATG16L1相互作用使細(xì)菌被靶向自噬,導(dǎo)致自噬依賴的細(xì)菌生長受限[24]。在本研究中可善挺抑制了C5a/C5aR1信號通路,但卻提高了銀屑病皮損組織中的自噬活性,表明C3在銀屑病模型中可能不是參與調(diào)控銀屑病細(xì)胞自噬的主要途徑,可善挺可能通過其它通路對細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此,針對可善挺活化銀屑病皮損組織細(xì)胞自噬的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖6 皮損組織C5a免疫組化檢測結(jié)果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 6 Immunohistochemical result of C5a in skin lesions

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖7 皮損組織C5aR1免疫組化檢測結(jié)果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 7 Immunohistochemical result of C5aR1 in skin lesions

本研究表明,可善挺增強(qiáng)了銀屑病小鼠皮損組織自噬活性,并通過調(diào)節(jié)C5a/C5aR1信號通路緩解了IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠皮損組織炎癥,為臨床上使用可善挺治療銀屑病提供了理論依據(jù)。同時也表明靶向抑制C5a/C5aR1信號通路是一種可行的治療銀屑病的方法。此外,可善挺是否通過C5a/C5aR1通路調(diào)節(jié)銀屑病皮損組織細(xì)胞自噬效果還需進(jìn)一步研究。