郭九標，張惠華，蔡 毅，楊倩婷，陳 騎，楊 帆，張明霞，鄧國防，陳心春

（1.廣東省組織器官區(qū)域免疫與疾病重點實驗室，深圳大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，廣東 深圳 518052；2.深圳市第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518112）

結(jié)核?。═uberculosis，TB）是由單一病原菌結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染導(dǎo)致的傳染性疾病，是全球十大死因之一［1-2］。作為一種古老的疾病，TB雖然不會像新型冠狀病毒肺炎那樣在短期內(nèi)造成全球性的災(zāi)難大流行，但仍然是人類健康的一個威脅。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2019年全球新增890~1 100萬例TB患者，死亡約140萬例［1］。結(jié)核的早期感染無明顯臨床癥狀，且卡介苗（bacille Calmette-Guérin，BCG）的保護效果欠佳，而短期內(nèi)新疫苗/藥物的研發(fā)也更難以實現(xiàn)突破。鑒于此，尋找和開發(fā)一種能夠早期、快速、準確的診斷結(jié)核病的生物標記物或方法，對早期預(yù)防、控制、治療具有重大意義。

目前，臨床上結(jié)核病診斷技術(shù)主要分為三大類：病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷及影像學(xué)診斷［3］。在病原學(xué)診斷方面，痰涂片和痰培養(yǎng)技術(shù)是傳統(tǒng)的金標準，但該技術(shù)具有敏感性低和周期長等缺點，而且約50%的患者找不到結(jié)核病診斷的病原學(xué)依據(jù)。GeneXpert是近年來發(fā)展起來的基于分子生物學(xué)的技術(shù)，盡管能夠?qū)崿F(xiàn)對結(jié)核菌的快速分子診斷和耐藥檢測，但價格昂貴、需要專用設(shè)備和試劑以及不適用于大規(guī)模人群主動篩查等制約因素限制了其發(fā)展和應(yīng)用［4］。在免疫學(xué)診斷方面，結(jié)核特異性γ干擾素釋放試驗（interferon-γrelease assay，IGRA）近年來有較快速的發(fā)展，具有良好的特異性和敏感性，但不能有效的區(qū)分活動性結(jié)核（active tuberculo?sis，ATB）和潛伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）［5］。在影像學(xué)診斷以及基于人工智能（artifi?cial intelligence，AI）的結(jié)核影像診斷技術(shù)方面，盡管該技術(shù)也獲得了廣泛的關(guān)注并且具有很好的發(fā)展前景，但尚需更多的臨床驗證和試驗數(shù)據(jù)證明。而隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，其也越來越多地被應(yīng)用到了結(jié)核病的快速診斷領(lǐng)域。SWEENEY TE及同事基于對14個數(shù)據(jù)庫中的2 572個樣品的薈萃分析并在臨床樣本中驗證后發(fā)現(xiàn)，GBP5、DUSP3和KLF2的三基因組合能夠很好地區(qū)分活動性結(jié)核（AUC為0.90）［6］。我們前期對健康對照（health con?trol，HC）、LTBI和ATB患者外周血單核細胞（periph?eral blood mononuclear cells，PBMC）中全基因轉(zhuǎn)錄組進行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，TB患者有77個高表達和50個低表達的差異表達基因，其中有12個差異表達基因在經(jīng)抗結(jié)核治療后顯著下調(diào)；并且進一步分析發(fā)現(xiàn)，其中有8個基因的組合能夠很好地用于區(qū)分結(jié)核［7］。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步在外周血樣本中對比分析了其中有潛力的、能夠用來區(qū)分結(jié)核的基因，并開發(fā)了單管同步檢測3個基因的實時熒光PCR技術(shù)，用于臨床上快速診斷結(jié)核患者。

1 材料與方法

1.1 樣本來源回顧性研究2019年8月至11月于深圳市第三人民醫(yī)院住院的TB患者250例、非結(jié)核樣本（Non-TB）380例。樣本分為三組數(shù)據(jù)集：第一組共247例，包括59例TB與188例Non-TB，用于SYBR Green檢測20個基因表達情況；第二組共315例，包括158例TB與157例Non-TB，用于模型訓(xùn)練；第三組共68例，包括33例TB與35例Non-TB，用于模型獨立測試。本研究所使用的病例經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準并取得所有患者知情同意并簽署同意書。實驗設(shè)計流程參考圖1。

圖1 本研究實驗設(shè)計和樣本統(tǒng)計

患者診斷根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》標準。入組標準：（1）TB：年齡在18~65周歲；初次診斷為肺結(jié)核病并且尚未接受抗結(jié)核治療。（2）Non-TB：包括HC、肺炎患者（pneumonia，PN）和已治愈肺結(jié)核患者（cured TB，RxTB）。其中，HC：結(jié)核菌特異性γ干擾素ELISPOT檢測陰性；無結(jié)核臨床表現(xiàn)（胸部放射學(xué)檢查無異常）。PN：結(jié)核菌涂片和培養(yǎng)均為陰性，細菌學(xué)檢測證實有結(jié)核菌之外細菌或真菌，結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)及治療性診斷等不支持結(jié)核菌的診斷。RxTB：完成治療時間＞2年，并且沒有復(fù)發(fā)。上述入組人群均排除合并其他傳染病、慢性疾病及自身免疫疾病、妊娠等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集及處理使用肝素抗凝劑管抽取研究對象清晨空腹靜脈血5 mL。

1.2.2 分離提取PBMC與提取總RNA使用Ficoll淋巴分離液以1∶1∶1的比例（5 mL全血標本：5 mL 1×PBS：5 mL淋巴分離液）分離提取PBMC。并按照Trizol試劑盒（Invitrogen）說明書提取總RNA，具體操作流程為：加350μL TRK試劑重懸收集的PBMC，再加入350μL 70%的乙醇（DEPC水配制），充分混勻后轉(zhuǎn)移至特定分離柱中，10 000×g離心1 min；離心后棄去下層液體，添加500μL洗液Ⅰ試劑，10 000×g離心1 min；棄廢液再加500μL洗液Ⅱ試劑，10 000×g離心1 min，并重復(fù)2次，最高轉(zhuǎn)速空轉(zhuǎn)2 min，把分離柱轉(zhuǎn)到新的無RNase的1.5 mL EP管中，最后用50μL DEPC處理過的蒸餾水洗脫，最高轉(zhuǎn)數(shù)離心2 min。取1μL純化的RNA測定OD260/OD280吸光值，比值在1.8~2.1之間則表明核酸提取質(zhì)量較高，可以開展后續(xù)試驗。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄取8μL上述提取的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScripⅡReverse Transcriptase）把總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。去基因組DNA：在RNasefree離心管中配制混合液：模版RNA 8μL，4×gDNA wiper Mix 8μL，RNase-free ddH2O 16μL；輕輕吹打混勻，42℃2 min；逆轉(zhuǎn)錄：加入5×HiScripⅡqRT SuperMixⅡ8μL，輕輕吹打混勻，50℃15 min，85℃15 sec。保存于－80℃冰箱備用。

1.2.4 探針法實時熒光定量PCR（RT-qPCR）引物及對應(yīng)的探針序列參見表1。實驗儀器為ABI7500熒光定量PCR儀。反應(yīng)體系為20μL（2×qPCR probe master mix：10μL，特異性前、后向引物（10μM）各0.4μL，模版1μL，ROX Reference Dye 2試劑：0.4μL，probe 0.2μL，去離子水：7.6μL）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因。SYBR green熒光染料法RT-qPCR的方法同上，但反應(yīng)體系中不添加探針，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，55℃復(fù)性34 s，72℃延伸34 s，40個循環(huán)，溶解曲線為機器（ABI7500）默認（95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s），最后72℃延伸10 min。

表1 本研究涉及到的4個基因（含內(nèi)參基因）的引物和對應(yīng)的探針序列

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析特征篩選和診斷模型構(gòu)建采用R語言的caret包和pROC包，評價參數(shù)包括準確度、敏感性和特異性。特征選擇方法為支持向量機（support vector machine，SVM）；診斷模型為NNET，模型構(gòu)建過程中劃分10-折交叉驗證并重復(fù)5遍［8］。各組間比較采用單因素方差分析，并用Bonferroni進行校正，以校正P值（q value）＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選可區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核的潛在差異基因組合我們前期的一項對9例治療前TB患者、12例Non-TB樣本（包括6例LTBI和6例HC）的全基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TB患者中有77個高表達、50個低表達的差異表達基因［7］。為了進一步篩選出可以區(qū)分TB和Non-TB的差異基因，我們挑選了其中20個有明顯差異表達的基因，并在59個TB和188個Non-TB樣本（包括66個HC、61個RxTB和61個PN）中利用SYBR green RT-qPCR技術(shù)進行了檢測。為了能用于Taqman單管同步檢測，我們將特征選擇數(shù)量限制在3個基因內(nèi)。通過SVM我們篩選出來CD157、GSDMD和VAMP5的三基因組合效果最好。其準確度、靈敏度和特異性分別為0.84（95%CI：0.79，0.88）、0.85（95%CI：0.79，0.89）和0.81（95%CI：0.69，0.90）（圖2）。

圖2 利用SVM特征選擇選取三基因組合的診斷效果統(tǒng)計

2.2 CD157、GSDMD和VAMP5在結(jié)核患者中呈差異表達趨勢為了進一步評估CD157、GSDMD和VAMP5用于區(qū)分和診斷結(jié)核的效果，我們在上述人群中分別比較了這3個基因的表達差異性（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HC相比，TB患者中的CD157、GSDMD和VAMP5基因都呈差異表達趨勢（圖3），其中CD157的表達具有顯著性差異（圖3A）；另外，我們的數(shù)據(jù)還顯示與RxTB和PN相比，TB患者中的CD157、GSDMD和VAMP5基因的表達都呈顯著下降趨勢。這些數(shù)據(jù)提示CD157、GSDMD和VAMP5三基因可能具有區(qū)分和診斷結(jié)核以及衡量評價結(jié)核治療效果的潛力。

圖3 CD157（A）、GSDMD（B）和VAMP5（C）在不同人群中的差異表達情況

2.3 CD157、GSDMD和VAMP5基因的表達具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性考慮到后期擬開發(fā)的探針法RT-qPCR技術(shù)，在后續(xù)研究中，我們采用了Taqman RT-qPCR技術(shù)。為了檢驗CD157、GSDMD和VAMP5基因表達的穩(wěn)定性和重復(fù)性，我們隨機選取了100份外周血PBMC，并將每一個樣品平分為2份，1份凍存于－80℃冰箱1周作為凍存樣品，1份作為新鮮樣品，然后分別提取總RNA并進行RT-qPCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品凍存與否對CD157、GSDMD和VAMP5基因的表達沒有顯著性差異（圖4），并且這3個基因的CV值分別為0.05、0.01和0.02，顯示出單管同步檢測技術(shù)具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖4 CD157（A）、GSDMD（B）和VAMP5（C）基因表達的穩(wěn)定性和重復(fù)性分析Fresh，新鮮外周血PBMC；Frozen，凍存外周血PBMC。ns，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4基于CD157、GSDMD和VAMP5三基因組合的NNET模型用于區(qū)分和診斷結(jié)核為了測試和評估CD157、GSDMD和VAMP5基因組合用于區(qū)分和診斷結(jié)核的效果，我們重新收集了兩批樣本。第一批315樣本（TB病例158例，Non-TB樣本157例）作為訓(xùn)練集構(gòu)建NNET模型；并以第二批獨立樣本（TB病例33例，Non-TB樣本35例）作為測試集對模型進行測試，用于評估模型的區(qū)分效能。結(jié)果顯示，訓(xùn)練集的AUC面積為0.85（95%CI：0.80，0.89）（圖5A）；其準確度、靈敏度與特異性分別為0.77（95%CI：0.72，0.82）、0.80（95%CI：0.72，0.86）和0.75（95%CI：0.68，0.82）（圖5B）。測試集的AUC面積為0.84（95%CI：0.80，0.89）（圖6A）；其準確度、靈敏度與特異性分別為0.75（95%CI：0.63，0.85）、0.74（95%CI：0.57，0.88）和0.76（95%CI：0.58，0.89）（圖6B）。

圖5 NNET模型訓(xùn)練結(jié)果

圖6 NNET模型測試結(jié)果

3 討論

隨著芯片技術(shù)與高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，更多的RNA表達譜被發(fā)現(xiàn)并廣泛運用于解釋其在人體內(nèi)導(dǎo)致或?qū)辜膊〉陌l(fā)展機制，以及探索用來作為疾病診斷的分子標識［9-10］。對結(jié)核而言，早期診斷是結(jié)核患者得到及時治療以及預(yù)防傳播的關(guān)鍵，但目前結(jié)核病診斷手段不足，迫切需要鑒定出更有效的診斷標識，為開發(fā)更加快速、簡便的診斷方法提供基礎(chǔ)。SWEENEY TE及同事基于對14個數(shù)據(jù)庫中的2 572個樣品的薈萃分析并在臨床樣本中驗證后發(fā)現(xiàn)，GBP5、DUSP3和KLF2的三基因組合能夠很好地區(qū)分ATB（AUC為0.90）。進一步的多數(shù)據(jù)庫的診斷效果分析發(fā)現(xiàn)，該三基因組合在鑒別診斷TB患者和HC或LTBI的效果較好，AUC分別為0.9（敏感性85%，特異性93%）和0.88（敏感性80%，特異性86%）；但在區(qū)分其他疾病時效果稍差，AUC只為0.84（敏感性81%，特異性74%）［6］。本研究中，我們也同步評估了GBP5、DUSP3和KLF2的三基因組合，但區(qū)分結(jié)核的診斷效果遠達不到文獻的水平（數(shù)據(jù)未展示）。我們認為主要原因是實驗對象人群和實驗分組不同：本項目的實驗?zāi)康氖悄M全真臨床下，診斷標識在ATB診斷的效率。因此，診斷標識不僅能區(qū)分于HC與LTBI，更重要的是區(qū)分TB以及RxTB。另外，PANKHURSTLJ及同事在多中心對比了全基因組學(xué)和常規(guī)檢測技術(shù)對檢測Mtb標本的效果，發(fā)現(xiàn)全基因組測序（WGS）的Mtb預(yù)測準確率達93%，藥物敏感性為93%，不過該基于WGS的結(jié)核檢測卻需要長達9天的時間，難以滿足及時快捷的診斷要求［11］。

我們前期的一項基于芯片技術(shù)對受試者外周血進行全轉(zhuǎn)錄組表達譜分析研究中篩選出了127個差異表達基因，其中77個基因在TB患者高表達，50個基因在TB患者低表達；進一步在治療前后TB患者中分析發(fā)現(xiàn)有12個基因經(jīng)抗結(jié)核治療后表達量顯著下降（比如HBA1、HBA2和血紅蛋白-α等）［7］。本研究是前期研究的延續(xù)，在本研究中我們首先利用特征選擇（SVM）策略，篩選鑒定出了CD157、GSDMD和VAMP5的三基因組合能夠用于診斷和區(qū)分TB患者與HC。進一步開發(fā)了單管同步檢測實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)用于同步檢測分析該3個基因；穩(wěn)定性和重復(fù)性分析證明，該三基因的表達在新鮮和凍存外周血（PBMC）中的表達量沒有顯著性變化，具有很好的表達穩(wěn)定性和重復(fù)性。進而利用建模策略，搭建了基于CD157、GSDMD和VAMP5的三基因NNET模型，該模型在獨立的測試集上區(qū)分和診斷TB的準確率、敏感性與特異性分別為0.75（95%CI：0.63，0.85）、0.74（95%CI：0.57，0.88）和0.76（95%CI：0.58，0.89），AUC為0.84（95%CI：0.80，0.89）。在構(gòu)建NNET的同時，我們也構(gòu)建了SVM和隨機森林（random forest，RF）模型，以比較三種不同模型間的分類效能。在準確率、敏感性和特異性上，NNET的效能最好（數(shù)據(jù)未展示）。但目前所用訓(xùn)練集數(shù)量還不足夠多，且仍存在部分感染或非感染性疾病引起的炎癥產(chǎn)生的非特異性影響。下一步，我們將收集更多的樣本對模型進行優(yōu)化，以提高模型的泛化能力和魯棒性。

綜上所述，本研究鑒定出了能夠用于區(qū)分和診斷結(jié)核的三基因組合標識及單管同步檢測技術(shù)，為結(jié)核病的診斷提供了新的策略。