何曉妍，鄭宏毅，鄭永唐

（1.中國科學(xué)院昆明動物研究所，中國科學(xué)院動物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

艾滋病（Acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是一種由人類免疫缺陷病毒（Human immuno?deficiency virus，HIV）感染導(dǎo)致的慢性傳染?。?］，嚴(yán)重威脅HIV攜帶者（People live with HIV，PLWH）的健康狀況和生存質(zhì)量。截至2020年底，全球約有3 800萬人感染，其中2 750萬人接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（Antiretroviral therapy，ART）（https：//www.un?aids.org/en/resources/fact-sheet.）。20世紀(jì)90年代開始推廣的ART依然是目前最主要的AIDS治療手段，能夠讓絕大部分的HIV感染者免于發(fā)展為AIDS，并且提高預(yù)期壽命。由于被病毒潛伏感染的細(xì)胞亞群在組織中廣泛分布，以及病毒與藥物雙重作用引發(fā)的免疫器官病變和功能障礙等因素影響，PLWH即使接受ART治療后血漿病毒載量低于檢測下限，仍難以達(dá)到功能性治愈的目標(biāo)［2-4］。

了解HIV在PLWH體內(nèi)持續(xù)存在的機(jī)制及其對組織免疫微環(huán)境的影響，對于AIDS治療研究至關(guān)重要。非人靈長類動物的免疫學(xué)特征與人高度相似，是研究病毒感染機(jī)制以及治療方法的良好動物模型［5］。猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）感染的獼猴ADIS（Simian acquired immu?nodeficiency disease syndrome，SAIDS）模型是研究發(fā)病機(jī)制、藥物和疫苗評價、免疫治療策略等相關(guān)研究應(yīng)用最為廣泛的艾滋病動物模型［6-10］。組織免疫病理在模型研究中是重要的研究手段，比如基于獼猴ADIS模型的研究發(fā)現(xiàn)次級淋巴結(jié)的局部組織免疫微環(huán)境在AIDS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為治愈AIDS提供了免疫學(xué)證據(jù)和新思路［11］。

傳統(tǒng)的免疫熒光/免疫組織化學(xué)染色（Immuno?fluorescence/Immunohistochemistry，IF/IHC）技術(shù)能在保持福爾馬林固定石蠟包埋組織（Formalin fixed and paraffin embedded tissues，F(xiàn)FPET）完整性的前提下，對標(biāo)記物等進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的可視化研究［12-13］。隨著熒光染料和成像檢測技術(shù)的發(fā)展，多重免疫熒光染色（Multiple immunofluorescence stain?ing，MIS）技術(shù)越來越廣泛地被運(yùn)用［14-15］。以往的組織MIS方案通常需要不同種屬的一抗進(jìn)行間接標(biāo)記才能完成，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計受到限制。而近年來發(fā)展的酪胺信號放大技術(shù)（Tyramide signal amplification，TSA）很好地解決了這一問題［16-17］，該方法利用二抗上結(jié)合的辣根過氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）在過氧化氫的存在下催化熒光素標(biāo)記的酪胺分子共價偶聯(lián)到臨近蛋白的酪氨酸殘基，可在同一組織上獲得多達(dá)7～9種生物標(biāo)志物的表達(dá)及分布［18-23］，進(jìn)而對組織微環(huán)境進(jìn)行多維度分析［24］。然而該方法的復(fù)雜性也使獲得高質(zhì)量的染色結(jié)果需要大量的步驟優(yōu)化［21，25-26］，否則難以作為標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程應(yīng)用于病理研究。

本研究通過優(yōu)化TSA法多重免疫熒光的染色條件，旨在建立一種穩(wěn)定可靠的多色染色方法，并將免疫熒光圖像轉(zhuǎn)化為以細(xì)胞為基本單位的數(shù)字信號矩陣進(jìn)行流式分析，最后應(yīng)用于SAIDS模型的免疫病理研究，為艾滋病及其他疾病的免疫病理診斷和機(jī)制研究提供了一種良好的組織病理學(xué)研究手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料36份SIVmac239感染的雄性中國獼猴的淋巴結(jié)石蠟切片，其中包括快進(jìn)展模型組12份，慢進(jìn)展模型組12份和正常對照組12份，樣本來源于本實(shí)驗(yàn)室以往的實(shí)驗(yàn)［9-10］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑硼氫化鈉、硫酸葡聚糖鈉鹽、4-碘苯酚、蘇丹黑B、過氧化氫、EDTA（均購自Sigma公司）；二甲苯、無水乙醇、TRIS-HCl、檸康酸酐（購自阿拉丁公司）；QuickBlock免疫染色封閉液、QuickBlock免疫染色一抗稀釋液和QuickBlock免疫組化染色二抗稀釋液（購自碧云天公司）；DAPI染色液、抗熒光衰減封片劑（購自索萊寶公司）；山羊抗兔IgG-HRP、anti-CD4兔單抗、anti-Granzyme B兔單抗、anti-Bcl6兔單抗、anti-CD20兔多抗（購自Abcam公司）；anti-CD8兔單抗（購自CST公司）；酪胺-iFlu?or488、酪胺-Cy3、酪胺-Azido Cy5、酪胺-Pacificblue（購自AAT Bioquest公司）；anti-SIV gag P27兔多抗（由本實(shí)驗(yàn)室制備）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石蠟切片的染色前處理將二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后的石蠟切片浸于抗原修復(fù)液中（0.01 M TRIS-HCl，0.001 M EDTA，0.1%檸康酸酐，pH=8），高壓修復(fù)2~4 min。待冷卻至室溫后，取出切片，置入含0.1%硼氫化鈉的TBS中清洗30 min。自來水沖洗干凈后，在組織上滴上3%過氧化氫，室溫處理10~20min。TBST漂洗3次，封閉液封閉30min。

1.2.2 配制TSA反應(yīng)液首先配制基底液（0.1 M硼酸緩沖液，2%硫酸葡聚糖鈉鹽，0.1%Tween-20，pH=8.5），過濾除菌后－20℃儲存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r恢復(fù)到室溫，加入4-碘苯酚（50~500μg·mL-1）、H2O2（0.003%）和酪胺熒光素染料（5~20μg·mL-1）。

1.2.3 抗體孵育和染色甩掉切片上的封閉液，滴上稀釋好的一抗A，室溫孵育1~2 h。TBST漂洗3次后，室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗（1μg·mL-1）30 min。TBST再次漂洗3次，室溫孵育酪胺-iFluor488酪胺反應(yīng)液5~15 min。反應(yīng)結(jié)束后TBS漂洗1次，將切片置于檸檬酸（pH=6.0）溶液中，微波爐亞沸加熱10 min，洗脫掉一抗和二抗。加熱結(jié)束后將容器置于自來水中冷卻至室溫，取出切片用TBST漂洗3次，重復(fù)以上步驟3次，標(biāo)記一抗B、C、D和酪胺-Cy3、酪胺-Azido Cy5、酪胺-Pacificblue。

1.2.4 封片和拍照 所有抗體染色完成后孵育DAPI染液（5μg·mL-1）3~5 min，隨后滴上0.3%蘇丹黑B溶液室溫孵育3 min，TBS漂洗干凈后用抗熒光淬滅封片劑封片。檢查沒有氣泡后，采用徠卡DMI4000熒光顯微鏡或者尼康A(chǔ)1激光共聚焦顯微鏡拍攝所有熒光通道，獲得高質(zhì)量的熒光圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

1.3.1 圖像分析用ImageJ軟件的DnsMacro Example插件分析圖像中每個細(xì)胞的位置、大小和熒光信號，導(dǎo)出為數(shù)字矩陣文件。然后將該文件導(dǎo)入到R軟件中，通過已經(jīng)編輯好的程序自動進(jìn)行聚類分析，鑒定出陽性表達(dá)的細(xì)胞，分析完成的數(shù)據(jù)導(dǎo)出為包含每個細(xì)胞相對熒光信號信息的文件。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析使用Flowjo V10軟件按照流式細(xì)胞術(shù)的方法，對組織中每個細(xì)胞的空間位置和各種蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析和可視化，導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)的流式分析結(jié)果。兩組之間多個變量的比較采用post-hoc ANOVA的統(tǒng)計學(xué)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）的形式。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化TSA法提高多重免疫熒光染色質(zhì)量有多種因素會影響TSA法染色的效果，包括反應(yīng)溫度和時間，催化劑4-碘苯酚、氧化劑H2O2、底物酪胺分子以及一抗和二抗的類型（寡克隆、多克隆和多聚體）和濃度等。初期研究發(fā)現(xiàn)在按說明書使用一抗和二抗的情況下，室溫下0.003%的H2O2和5μg·mL-1酪胺熒光素染料足以獲得高亮度低背景的染色，影響染色效果的主要因素是反應(yīng)時間和4-碘苯酚的濃度。為獲得最佳反應(yīng)條件，在一抗和二抗孵育結(jié)束后，對CD4抗體標(biāo)記Cy3、CD8抗體標(biāo)記iFluor488、CD20抗體標(biāo)記Cy5，控制反應(yīng)時間分為5、10、20 min 3個變量，4-碘苯酚濃度分為20、150、450μg·mL-13個變量，不同變量組合成9種模式，每種模式染色3個樣本。熒光顯微鏡的拍照結(jié)果顯示在150μg·mL-14-碘苯酚催化10 min的條件下，熒光強(qiáng)度最接近中位值，既沒有染色過度也沒有不足，是最佳染色條件（圖1A）。在此條件下的圖像質(zhì)量高，細(xì)胞膜蛋白染色銳利清晰，每個目標(biāo)細(xì)胞都能呈現(xiàn)完整的形狀，殘缺或模糊的現(xiàn)象極少（圖1B）。

圖1 TSA法熒光染色最佳條件摸索

2.2 免疫熒光圖像轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號矩陣進(jìn)行分析典型免疫熒光四色染色包括DAPI染料標(biāo)記的細(xì)胞核和iFluor488、Cy3、Cy5標(biāo)記的抗體（圖2A）。對該圖像進(jìn)行分析，首先根據(jù)DAPI信號標(biāo)記出每個細(xì)胞的位置（X，Y）和面積（Area）。再計算每個細(xì)胞區(qū)域內(nèi)各個熒光信號的最大值（Max）、最小值（Min）、平均值（Mean）和中位值（Median），根據(jù)這些信號參數(shù)對細(xì)胞進(jìn)行迭代自組織聚類（ISOData）。隨后再進(jìn)行一次K-均值聚類，將陽性細(xì)胞區(qū)分出來，根據(jù)聚類分析的結(jié)果計算每個細(xì)胞陽性信號的閾值（Threshold）。每個細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度即為：（Mean-Threshold）*Area（圖2B）。最后導(dǎo)出數(shù)字信號矩陣由流式細(xì)胞術(shù)軟件進(jìn)行可視化和數(shù)據(jù)分析，不僅可以單獨(dú)分析每個通道，也可以分析通道間的共表達(dá)狀態(tài)（圖2C）。

圖2 多重免疫熒光切片的細(xì)胞水平分析方法

2.3 TSA法研究組織空間結(jié)構(gòu)的病理特征為了驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)方法的可行性，選取了24份SIVmac239感染獼猴模型（SAIDS慢進(jìn)展者和快進(jìn)展者各12份）和12份健康對照獼猴的淋巴結(jié)石蠟切片，檢測整個淋巴結(jié)組織上CD20、Bcl-6、CD4和CD8的表達(dá)情況（圖3A）。CD4+/CD8+細(xì)胞比值與AIDS及非AIDS相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)，并能有效預(yù)測長期ART療效，是評估PLWH疾病進(jìn)程和治療情況的良好的預(yù)后指標(biāo)［27-29］。根據(jù)B細(xì)胞標(biāo)志物CD20圈定濾泡（Follicle）區(qū)域、Bcl-6圈定生發(fā)中心（Germinal center，GC）區(qū)域，本研究將整個淋巴結(jié)組織劃分為濾泡區(qū)、非濾泡（Non-follicle）區(qū)和GC區(qū)3個區(qū)域，分別統(tǒng)計和分析CD4+/CD8+細(xì)胞比值（圖3B）。

統(tǒng)計結(jié)果表明在淋巴結(jié)濾泡區(qū)域，SAIDS快進(jìn)展者［（1.29±0.63）%，P＜0.000 1］和慢進(jìn)展者［（1.54±0.73）%，P=0.000 2］的CD4+/CD8+細(xì)胞比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是顯著低于健康對照［（4.23±2.66）%］。在生發(fā)中心區(qū)域，相較于健康對照［（6.61±5.92）%］的CD4+/CD8+細(xì)胞比值，快進(jìn)展者［（2.34±3.11）%，P＜0.000 1］和 慢 進(jìn) 展 者［（3.59±2.89）%，P＜0.000 1］都更低（圖3C）。熒光圖像顯示SIV感染導(dǎo)致CD8+細(xì)胞大量浸潤這兩個區(qū)域（圖3B），SAIDS快進(jìn)展者生發(fā)中心的CD4+/CD8+細(xì)胞比值還要顯著低于慢進(jìn)展者（P=0.019 0）。

健康對照樣本生發(fā)中心區(qū)域的CD4+/CD8+細(xì)胞比值［（9.85±6.70）%］與非濾泡區(qū)［（2.93±2.86）%，P＜0.000 1］和濾泡區(qū)［（4.30±2.70）%，P=0.000 2］相比差異顯著。SIV感染后，慢進(jìn)展者生發(fā)中心區(qū)域的CD4+/CD8+細(xì)胞比值［（3.57±2.91）%］依然高于非濾泡區(qū)［（1.64±1.08）%，P=0.006 8］和濾泡區(qū)［（1.54±0.73）%，P=0.004 2］，但是3個區(qū)域間的差異已經(jīng)有所縮小。而隨著AIDS疾病進(jìn)展，CD8+細(xì)胞大量浸潤淋巴結(jié)的濾泡和生發(fā)中心區(qū)域，快進(jìn)展者的3個區(qū)域CD4+/CD8+細(xì)胞比值無顯著差異（圖3D）。

圖3 SIV感染獼猴模型淋巴結(jié)主要空間結(jié)構(gòu)的CD4和CD8表達(dá)特征

2.4 TSA法在組織水平研究蛋白的共表達(dá)特征為了進(jìn)一步探究浸潤次級淋巴濾泡的CD8+細(xì)胞對SIV感染的影響，設(shè)計了以下兩組染色：一組檢測濾泡區(qū)的CD8與顆粒酶B表達(dá)，另外一組檢測整個淋巴結(jié)水平上SIVgag p27、CD8和CD4的表達(dá)（圖4A）。統(tǒng)計結(jié)果表明，快進(jìn)展者淋巴濾泡的CD8+細(xì)胞［（16.32±7.22）%，P＜0.000 1］和表達(dá)顆粒酶B的CD8+細(xì)胞［（6.80±3.26）%，P=0.003 7］，以及整個淋巴結(jié)的CD8+細(xì)胞［（18.75±7.06）%，P=0.009 4］、病毒感染細(xì)胞［（19.88±9.22）%，P＜0.000 1］和病毒感染的CD4+細(xì)胞［（15.86±8.44）%，P＜0.000 1］相對于 慢 進(jìn)展者［（9.10±6.56）%；（3.21±3.33）%；（11.05±6.89）%；（3.37±2.98）%；（1.69±1.27）%］顯著增加（圖4B）。結(jié)果表明，隨著疾病進(jìn)展，淋巴結(jié)組織的CD4+細(xì)胞受到更為嚴(yán)重的感染，CD8+細(xì)胞大量浸潤濾泡并且異常高表達(dá)分泌顆粒酶B。

圖4 SIV感染獼猴模型淋巴結(jié)和淋巴濾泡的免疫病理特征

3 討論

本研究優(yōu)化TSA多色熒光染色方法，開發(fā)配套的定量分析算法，并應(yīng)用于SAIDS模型淋巴結(jié)的免疫病理研究。染色分析結(jié)果表明SIV感染導(dǎo)致CD8+細(xì)胞浸潤次級淋巴濾泡，SAIDS快進(jìn)展者的CD8+細(xì)胞浸潤相比慢進(jìn)展者更為嚴(yán)重。同時相比于慢進(jìn)展者，高表達(dá)顆粒酶B的濾泡CD8+細(xì)胞和感染SIV病毒的CD4+細(xì)胞在快進(jìn)展者淋巴結(jié)也更多，顯示出更為嚴(yán)重的免疫病理。

與先前的研究相一致，本研究也發(fā)現(xiàn)病理性的SIV感染誘導(dǎo)具有更強(qiáng)殺傷潛力的CD8+細(xì)胞大量浸潤淋巴濾泡［30-31］，以及SIV感染顯著降低了外周血和淋巴結(jié)中CD4+細(xì)胞的比例和CD4+/CD8+細(xì)胞比值［32］。然而，也有研究表明，從急性到慢性感染的過渡過程中，血液和組織病毒庫部位的SIV特異性CTL的復(fù)制活性更低并且失去溶細(xì)胞功能［33］。次級淋巴結(jié)組織中CD8+細(xì)胞的免疫活化在病毒復(fù)制和CD4+/CD8+細(xì)胞比值倒置中的作用尚未清楚［32］，需更進(jìn)一步的研究和探索。未來的AIDS治療策略，旨在逆轉(zhuǎn)淋巴組織中CD4+細(xì)胞的耗竭，優(yōu)化CTL的抗病毒活性，最終減少或消除潛伏的HIV［34］。本研究的染色結(jié)果顯示淋巴結(jié)的免疫病理特征與SIV感染的疾病進(jìn)展相一致，應(yīng)用TSA法研究SIV感染獼猴模型的免疫病理機(jī)制研究有助于新一代AIDS藥物開發(fā)。

傳統(tǒng)IHC/IF多重免疫熒光染色存在許多局限性，需使用不同種屬來源的一抗，因而很難進(jìn)行多標(biāo)志物的檢測和相關(guān)性分析。此外，病理研究者通過肉眼觀察和半定量地判讀圖像結(jié)果具有較強(qiáng)的主觀性。而TSA法多重免疫熒光染色優(yōu)勢在于：（1）對一抗的種屬來源沒有限制，因而可以全部使用效果最好的兔單克隆抗體；（2）可識別傳統(tǒng)IHC/IF難以檢測和評估的弱表達(dá)抗原［14，35］；（3）良好的染色質(zhì)量和信噪比；（4）可對組織特異性結(jié)構(gòu)和感興趣的區(qū)域進(jìn)行定量分析［36］；（5）多通路復(fù)用可高效利用組織，節(jié)省有限的病理資源［37］；（6）通過多參數(shù)分析對組織有更深層次的洞察，揭示隱藏的生物學(xué)信息［38］。然而該方法步驟繁瑣，對一抗要求高，最好是選擇單克隆抗體進(jìn)行染色［39］。熒光光譜的重疊也可能導(dǎo)致多個靶標(biāo)的熒光信號混合，很難用肉眼分辨染色信號，更依賴于專業(yè)的圖像分析算法［40-41］。目前新型熒光染料的開發(fā)及光譜成像系統(tǒng)的改進(jìn)，將更加有利于發(fā)揮TSA法的優(yōu)勢［35，42］。當(dāng)然，該方法也適用于其他疾病的病理研究，尤其適合在發(fā)病早期階段進(jìn)行預(yù)測，高靈敏和高數(shù)據(jù)維度的優(yōu)勢有利于關(guān)鍵信號蛋白的分析［43］。

相比原始的TSA法多重?zé)晒馊旧椒ǎ?6-17］，本研究從抗原修復(fù)、TSA反應(yīng)液成分配比、染色步驟到封閉自發(fā)熒光等步驟對整套染色過程進(jìn)行了系統(tǒng)性改良。不同于標(biāo)準(zhǔn)的組織修復(fù)步驟［40，44］，本研究在抗體修復(fù)液中添加檸康酸酐成分，能更深度地對抗原進(jìn)行修復(fù)，適用于狀態(tài)不理想的組織。甚至已經(jīng)在4%多聚甲醛中浸泡5年以上的組織，使用該修復(fù)方法依然能夠獲得良好的染色效果。本研究對TSA反應(yīng)液的成分進(jìn)行了長期的探索，確定了最佳的配方成分和比例，經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)液配比具有穩(wěn)定可靠、低成本的優(yōu)點(diǎn)，只需要不到1/5的成本就能獲得不亞于商品化試劑的染色效果?；赑erkinElmer公司的“Opal Multiplex IHCAssay Development Guide”中推薦的抗體洗脫策略，在保持FFPE樣本的組織完整性和抗原活性的前提下，通過微波加熱亞沸的檸檬酸緩沖液（pH6.0）能高效完整地洗脫殘留的抗體。通過設(shè)置陽性對照和陰性對照以避免組織自發(fā)熒光的干擾［40，45］，獲得更清晰的信號，同時通過蘇丹黑B處理組織切片，可以有效封閉組織中脂褐質(zhì)的自發(fā)熒光［46-47］，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。最后本研究還開發(fā)了配套的定量分析算法，利用開源軟件進(jìn)行科學(xué)準(zhǔn)確的數(shù)字圖像分析。

綜上所述，本研究新建立的TSA法多重免疫熒光染色和標(biāo)準(zhǔn)化圖像分析平臺可客觀地檢測和定量分析多種標(biāo)記物在組織中的空間表達(dá)和共表達(dá)特征，提供了更多維度的病理分析數(shù)據(jù)，將成為發(fā)現(xiàn)疾病病理特征的有力工具，在AIDS及其他疾病發(fā)病機(jī)制的研究應(yīng)用中具有廣闊前景。