陸秀紅 黎達(dá)境 黃金玲 李紅芳 張禹 劉志明

摘 ?要：為明確廣西賀州市梔子根結(jié)線蟲(chóng)病病原種類，采集根部有明顯根結(jié)的梔子根系進(jìn)行根結(jié)線蟲(chóng)分離鑒定，通過(guò)觀察根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)、雌成蟲(chóng)、會(huì)陰花紋特征對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，并利用核糖體ITS區(qū)和28S rDNA D2D3區(qū)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析方法對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，該病原線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)形態(tài)特征及形態(tài)測(cè)量值與象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne enterolobii Yang ?Eisenback， 1983）相似;該病原線蟲(chóng)核糖體ITS區(qū)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)相應(yīng)序列的相似度為100%，28S rDNA D2D3區(qū)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)相應(yīng)序列的相似度為99%以上;該病原線蟲(chóng)核糖體ITS序列以99%的支持率與象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)聚為同一分支。綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果將廣西賀州市梔子根結(jié)線蟲(chóng)病病原種類鑒定為象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)，梔子（Gardenia jasminoides Eills）是該線蟲(chóng)的新寄主紀(jì)錄。

關(guān)鍵詞：梔子;象耳豆根結(jié)線蟲(chóng);種類鑒定

Abstract： In order to clarify the pathogen species of Gardenia jasminoides Eills root-knot nematode disease in Hezhou， Guangxi Province， the root samples with obvious root-knot of G. jasminoides were collected for isolating root-knot nematodes. The pathogenic nematodes were identified by observing the morphological characteristics of females， second-stage juveniles and perineal pattern， sequence alignments， phylogenetic analysis. The results showed that the morphological characteristics and morphometric values of the second-stage juveniles and females were similar to those of Meloidogyne enterolobii Yang ?Eisenback. The rDNA-ITS fragment and 28S rDNA D2D3 fragment of the nematode were highly similar to those M. enterolobii in NCBI database， with a similarity of 100% and over 99%， respectively. The rDNA-ITS sequences of the nematode were clustered within the same clade and M.enterolobii with support rate of 99%. Morphological and molecular identification methods identified the pathogen species of G. jasminoides root-knot nematode disease in Hezhou as M. enterolobii. M. enterolobii is the new host for G. jasminoides Eills.

Keywords： Gardenia jasminoides Eills; Meloidogyne enterolobii Yang ?isenback; identification

植物寄生線蟲(chóng)（plant parasitic nematodes， PPNs）是制約全球糧食生產(chǎn)的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界因植物寄生線蟲(chóng)造成的損失約800億美元，其中根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne spp.）廣泛分布于世界各地，是危害極大的一類植物寄生線蟲(chóng)[1-2]。目前根結(jié)線蟲(chóng)的防治措施包括種植抗病品種、使用化學(xué)殺線劑、輪作、生物防治等，其中線蟲(chóng)種類鑒定是各類防治措施實(shí)施的基礎(chǔ)[3]。

梔子（Gardenia jasminoides Eills）又名黃梔子，屬茜草科（Rubiaceae Juss）梔子屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，不僅可以直接入藥，其果實(shí)還是提取食用色素添加劑“黃色素”的天然優(yōu)質(zhì)材料。梔子分布于廣西、河南、浙江、江西、福建、湖北等地，種植梔子可促進(jìn)產(chǎn)地農(nóng)民增收，是目前廣西賀州、柳州等地產(chǎn)業(yè)扶貧的有效途徑[4]。然而，梔子生產(chǎn)面臨嚴(yán)重的病害問(wèn)題，其中根結(jié)線蟲(chóng)病是其中一種重要的病害，在不同地區(qū)均有不同程度發(fā)生。熊英等[5]、賈全全等[6]、李冬等[7]等相繼在廣西柳州、江西等地發(fā)現(xiàn)該病害，但多數(shù)研究集中于病害發(fā)生情況調(diào)查及藥劑篩選方面，病原相關(guān)報(bào)道較少，僅有廣西柳州[5]、福建福鼎[8]兩地對(duì)其病原進(jìn)行了鑒定。2018—2020年對(duì)廣西賀州市的梔子種植基地進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)梔子受到根結(jié)線蟲(chóng)的危害，呈現(xiàn)植株長(zhǎng)勢(shì)差，葉片黃化、萎蔫、根系形成大量根結(jié)等癥狀，嚴(yán)重制約當(dāng)?shù)貤d子種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究對(duì)采集到的梔子根系及其根際土壤進(jìn)行分離，對(duì)分離得到的根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)及雌蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定，旨在明確梔子根結(jié)線蟲(chóng)病病原種類，為該病的有效治理提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試線蟲(chóng)的采集及分離

線蟲(chóng)樣本采自賀州市八步區(qū)蓮塘鎮(zhèn)旗頭嶺（22°491.21 N，108°2159.55 E）文坡村、上寺村梔子種植基地，采用五點(diǎn)取樣法挖取呈現(xiàn)根結(jié)線蟲(chóng)病癥狀的梔子根系及其根際土壤帶回實(shí)驗(yàn)室。在解剖鏡下，從根結(jié)挑取單卵塊放置25?℃恒溫箱孵化成二齡幼蟲(chóng)，將二齡幼蟲(chóng)接種于預(yù)先培植于消毒土的梔子（賀梔1號(hào)）根部，進(jìn)行活體保存，待用。試驗(yàn)時(shí)挖取根結(jié)線蟲(chóng)病癥狀明顯的梔子根系及根際土壤，采用直接解剖法分離雌蟲(chóng)，將根系置于體視鏡（NIkon SMZ800N）下用3號(hào)昆蟲(chóng)針挑取雌蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;根際土壤采用改良貝曼漏斗法進(jìn)行分離，25?℃靜置24?h后，用小玻璃瓶收集約10?mL線蟲(chóng)懸浮液。在體視鏡下將根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)從線蟲(chóng)懸浮液中挑出，經(jīng)熱殺死（65?℃水浴3?min）后制成臨時(shí)玻片用于形態(tài)觀察。

1.2 ?形態(tài)學(xué)鑒定

二齡幼蟲(chóng)及雌蟲(chóng)主要形態(tài)特征：使用尼康顯微鏡（NIkon Ni-E）觀察其頭部、口針、尾部特征，并采用de Man公式對(duì)20條二齡幼蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)量，分別測(cè)量體長(zhǎng)、最大體寬、口針長(zhǎng)度、尾長(zhǎng)、透明尾長(zhǎng)和DGO（背食道腺開(kāi)口至口針基部球的距離）等形態(tài)指標(biāo)[9]。

會(huì)陰花紋的制作及觀察：參照張紹升[10]的方法，從梔子根組織挑取成熟雌蟲(chóng)，放置滴有10?μL 40%乳酸的載玻片上，在體視顯微鏡下用手術(shù)刀切取蟲(chóng)體后部約1/4并將體內(nèi)組織去除，用鑷子將會(huì)陰花紋轉(zhuǎn)移至滴有10?μL純甘油的載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察拍照。

1.3 ?分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 ?線蟲(chóng)DNA提取 ?線蟲(chóng)DNA抽提采用單條線蟲(chóng)DNA提取法。參照王江嶺等[11]的方法略有改動(dòng)，在經(jīng)滅菌的凹面皿上滴入16?μL ddH2O和2?μL 10×PCR Buffer混合液，用挑蟲(chóng)針將單條根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)挑入混合液中，取1號(hào)昆蟲(chóng)針將線蟲(chóng)切成2～3段，用移液器將含有線蟲(chóng)段的所有混合液轉(zhuǎn)移至200?μL PCR管中，加入2?μL（1?mg/mL）蛋白酶K，–80?℃超低溫冰箱放置20?min，65?℃溫育60?min，95?℃加熱10?min，獲得DNA提取液。DNA提取液可立即用于PCR擴(kuò)增或放入–20?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ?PCR擴(kuò)增 ?核糖體ITS區(qū)采用引物F194： 5-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3和PXB481： 5-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3進(jìn)行擴(kuò)增[11]，28S rDNA D2D3區(qū)采用通用引物D2A： 5-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3和D3B： 5-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3進(jìn)行擴(kuò)增[12]。PCR反應(yīng)體系（50?μL）：TaKaRa Taq?HS Perfect Mix （2×） 25?μL，上游引物（10?μm）2?μL，下游引物（10?μm）2?μL，模板DNA 2?μL，ddH2O 19?μL。擴(kuò)增條件：94?℃ 4?min;94?℃ 40?s，55?℃ 40?s，72?℃ 1?min，共35個(gè)循環(huán);最后72? 5?min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1% Agarose膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測(cè)序。

1.3.3 ?序列分析 ?PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果用NTI 11軟件進(jìn)行序列拼接，最終序列上傳至GenBank，序列號(hào)分別為MH756121、MH756122、MN648519、MN648520。根據(jù)近年來(lái)發(fā)表的根結(jié)線蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化文獻(xiàn)，從GenBank下載相關(guān)線蟲(chóng)rDNA-ITS和28S rDNA D2D3序列，采用NTI 11軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。

1.3.4 ?系統(tǒng)進(jìn)化分析 ?采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于rDNA-ITS及28S rDNA D2D3區(qū)的Neighbor- joing系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。分別選擇GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）rDNA-ITS序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969）和28S rDNA D2D3區(qū)序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969），南方根結(jié)線蟲(chóng)（M. incognita）rDNA-ITS序列（LC030363），花生根結(jié)線蟲(chóng)（M. arenaria）rDNA-ITS序列（KJ572384、AF387092）和28S rDNA D2D3區(qū)序列（AF435803、KJ598135），爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M. javanica）rDNA-ITS序列（AY438555、KX646187）和28S rDNA D2D3區(qū)序列（MT3412999、MN096736），巴拉那根結(jié)線蟲(chóng)（M. paranaensis）28S rDNA D2D3區(qū)序列（AF435800、KY911103），擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)（M. graminicola）28S rDNA D2D3區(qū)序列（MG273441、MG273443），分別以朱頂紅短體線蟲(chóng)（Pratylenchus hippeastri， FJ712935）和玻利維亞短體線蟲(chóng)（P. crenatus， MH973647）作為外類群，rDNA-ITS共計(jì)15條序列，28S rDNA D2D3區(qū)共計(jì)17條序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以自展法（bootstrap）進(jìn)行1000次循環(huán)檢測(cè)[13-14]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?梔子根結(jié)線蟲(chóng)病癥狀

調(diào)查發(fā)現(xiàn)賀州市梔子種植基地部分梔子出現(xiàn)植株矮小，葉片黃化失綠，生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重的整株枯死等癥狀。受害植株根部形成大小不一的根結(jié)，根部表面壞死呈疏松孔狀（圖1）。取根組織在體視顯微鏡下觀察可見(jiàn)大小不一的卵囊，切開(kāi)卵囊見(jiàn)橢圓形卵塊，根結(jié)組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)梨形的雌蟲(chóng)。采用改良貝曼漏斗分離根際土壤可分離到大量根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)。

2.2 ?形態(tài)學(xué)特征

雌蟲(chóng)：蟲(chóng)體乳白色，梨形;頸部突出，與體分界明顯;陰門和肛門位于末端;會(huì)陰部為指狀花紋;側(cè)尾腺口點(diǎn)狀，位于肛門兩側(cè)靠前位置;口針細(xì)長(zhǎng)，椎體部向背面略彎曲與桿部等長(zhǎng);口針基部球較小，形成兩個(gè)球狀。中食道球卵圓形，瓣門近似圓形;排泄孔位于中食道球前口針基部稍后位置（圖2A）。會(huì)陰花紋近卵圓形或橢圓形;背弓較高，線紋較細(xì)且平滑，外側(cè)線紋呈波浪狀;具1～2條不太明顯側(cè)線;陰門裂較長(zhǎng)，陰肛區(qū)無(wú)線紋;腹面線紋纖細(xì)光滑，尾部較明顯（圖2B）。

二齡幼蟲(chóng)：線形，身體體環(huán)清晰明顯，頭架骨化弱，唇區(qū)縊縮不明顯;排泄孔位于半月體后;口針細(xì)長(zhǎng)，基部較大且為圓球形;中食道球卵圓形;尾部透明區(qū)分界明顯，尾部縊縮明顯，尾尖鈍圓或細(xì)圓（圖3），其測(cè)量值見(jiàn)表1。

本研究中廣西賀州種群形態(tài)特征和測(cè)量值與象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）原始報(bào)道基本一致，故定為象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)[15]。

2.3 ?分子特征

利用通用引物F194/PXB481和D2A/D3B分別對(duì)二齡幼蟲(chóng)核糖體ITS區(qū)域及28S rDNA D2D3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，得到約700?bp的片段，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增如圖（圖4）。經(jīng)雙向測(cè)序和拼接獲得ITS片段大小為757?bp，GenBank登錄號(hào)為MH756121、MH756122，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的福建、湖南、海南及越南象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）群體的序列相似度是100%;與近似種南方根結(jié)線蟲(chóng)（M. incognita）ITS（MH113856）的序列相似度為90%，與花生根結(jié)線蟲(chóng)（M. arenaria）ITS序列（LC030356、LC030350）的序列相似度分別為88%和90%;與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M. javanica）ITS序列（AY438555、KX646187）的序列相似度均為88%。擴(kuò)增的28S rDNA D2D3區(qū)片段大小分別為764?bp和716?bp，GenBank登錄號(hào)為MN648519和MN648520，其中MN648520與國(guó)內(nèi)報(bào)道的廣東、福建，及美國(guó)、泰國(guó)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）群體的序列相似度為100%，MN648519與美國(guó)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）群體的序列相似度為100%，和中國(guó)福建、廣東及泰國(guó)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）群體的序列相似度為99%;MN648519與近似種花生根結(jié)線蟲(chóng)（M. arenaria）和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M. javanica）D2D3區(qū)片段（AF435803、MT3412991）的序列相似度均為94%;MN648520與花生根結(jié)線蟲(chóng)（M. arenaria）和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M. javanica）D2D3區(qū)片段（AF435803、MN096736）的序列相似度分別為95%和94%。該結(jié)果進(jìn)一步表明該病原線蟲(chóng)為象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）。

2.4 ?系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)基于核糖體ITS和28S rDNA D2D3區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，基于ITS基因序列的進(jìn)化樹(shù)中，梔子根結(jié)線蟲(chóng)種群MH756121、MH756122與海南（KF418369、MT0675599）、越南（MG773551、MG773550）、福建（MT209951、KX823380）、湖南（MT456216）7個(gè)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）群體位于同一分支，支持率為99%。基于28S rDNA D2D3基因序列的進(jìn)化樹(shù)中，梔子根結(jié)線蟲(chóng)種群MN648519、MN648520與泰國(guó)（MT648507）、中國(guó)福建（MT193450、MT193449）、中國(guó)廣東（MN017119、MN017115）、美國(guó)（MH800969）6個(gè)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）群體位于同一分支上，支持率為85%。此外，基于核糖體ITS和28S rDNA D2D3區(qū)域構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，梔子根結(jié)線蟲(chóng)種群均與南方根結(jié)線蟲(chóng)（M. incognita）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M. arenaria）、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M. javanica）、擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)（M. graminicola）等近似種聚類在不同的分支，能明顯與近似種區(qū)分開(kāi)（圖5，圖6）。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該病原線蟲(chóng)為象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）。

3 ?討論

本研究對(duì)廣西賀州市梔子種植基地的根結(jié)線蟲(chóng)病進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)梔子根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)生較嚴(yán)黑體為新獲得的序列標(biāo)記。本研究采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法，將其病原鑒定為象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii），為梔子根結(jié)線蟲(chóng)病的診斷及防治奠定了基礎(chǔ)。

根結(jié)線蟲(chóng)病是梔子生產(chǎn)面臨的一種重要病害，廣東[16]、福建[8]、江西[6-7]等地相繼報(bào)道了該病害，但多數(shù)研究集中于病害發(fā)生情況調(diào)查及藥劑篩選方面，病原相關(guān)報(bào)道較少，僅有廣西、福建兩地對(duì)其病原進(jìn)行了鑒定。2008年，熊英等[5]采用形態(tài)學(xué)的方法將廣西柳州市鹿寨縣黃梔子種植基地根結(jié)線蟲(chóng)病的病原鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)（M. incognita）。福建省林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院和福建省林業(yè)科學(xué)院將該省梔子根結(jié)線蟲(chóng)病的病原鑒定為花生根結(jié)線蟲(chóng)（M. arenaria）[8]。根結(jié)線蟲(chóng)分布廣且種類繁多，該屬有近100個(gè)有效種，同種作物不同地區(qū)其優(yōu)勢(shì)種群有差異[1]。許天委等[17]研究發(fā)現(xiàn)海南省土沉香根結(jié)線蟲(chóng)病的病原為南方根結(jié)線蟲(chóng)（M. incognita）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M. arenaria）、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M. javanica ），其中南方根結(jié)線蟲(chóng)（M. incognita）是優(yōu)勢(shì)種群;而蘇圣淞等[18]對(duì)海南澄邁土沉香根結(jié)線蟲(chóng)病病原鑒定發(fā)現(xiàn)其病原為象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）。本研究對(duì)廣西賀州市梔子根結(jié)線蟲(chóng)病的病原進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)其病原為象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii），這樣的結(jié)果并不矛盾。本研究在之前形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上結(jié)合了分子生態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分析，其結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性。

1983年，Yang等[15]在我國(guó)海南省儋州市象耳豆樹(shù)上首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii），此后許多國(guó)家相繼報(bào)道了該線蟲(chóng)的發(fā)生，到目前為止發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）廣泛分布于四大州的熱帶地區(qū)[19]。在我國(guó)，海南省[20]的三亞、瓊海、定安，廣東省[21]的番禺、遂溪，福建省[22]的福州、漳州，湖南永州[23]等地均發(fā)現(xiàn)了該線蟲(chóng)。研究發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)可危害中藥材、蔬菜、果樹(shù)等經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，本研究發(fā)現(xiàn)的茜草科梔子是該線蟲(chóng)的寄主新記錄。卓侃等[21]認(rèn)為該線蟲(chóng)寄主范圍廣、毒性強(qiáng)、危害大，是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的病原線蟲(chóng)。廣西地屬亞熱帶地區(qū)，廣泛種植的西瓜、番茄、番石榴等作物均是象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)的寄主，開(kāi)展該線蟲(chóng)的調(diào)查，了解其分布情況及新的潛在寄主，可為有效采取檢疫和防治措施，防止該病原線蟲(chóng)的傳播擴(kuò)散及危害提供必要的依據(jù)。

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