王清蕓 侯天澤 徐詩濤 余文剛 邢孔惠 王健

摘 ?要：花粉和柱頭特性的研究是蘭花雜交育種的重要基礎(chǔ)。本研究以多花指甲蘭（Aerides rosea）為實驗材料，利用掃描電子顯微鏡觀察多花指甲不同開花時期的花粉微觀形態(tài)用TTC（氯化三苯基四氮唑）、I2-KI和醋酸洋紅染液并結(jié)合花粉離體培養(yǎng)檢測不同開花時期的花粉活力，利用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭的可授性。結(jié)果表明， 多花指甲蘭花粉隨著開花時間的延長，花粉表面顏色變深，質(zhì)地更硬，花粉粒結(jié)合更加緊密，花粉團(tuán)體積變小，表面變得更加平滑致密。 多花指甲蘭花蕾期花粉染色為粉紅色，盛花期的花粉染色最明顯，染色率最高，而衰敗期的花粉幾乎無法被染色，在整個開花過程中，花粉活力呈先上升后下降的趨勢。柱頭可授性的結(jié)果顯示，盛花期柱頭氣泡最多最迅速，可授性最強。該研究結(jié)果為多花指甲蘭的引種栽培、遷地保護(hù)提供理論基礎(chǔ)，在花卉資源利用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展上具有重要指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：多花指甲蘭（Aerides rosea ）;花粉形態(tài);花粉活力;柱頭可授性

Abstract： The study on the characteri stics of pollen and stigma is an important basis for orchid cross breeding. In this study， Aerides rosea was used as the experimental materi al to observe the micro-morphol ogy of pollen at different flowering stages by scanning electron microscope. The pollen viabil ity at different flowering stages was detected by TTC （triphenyltetrazolium chloride）， I2-KI and magenta acetate staining solution combined with pollen culture in vitro， and benzidine-hydrogen peroxide method was used to determine the receptivity of stigma. The resul ts showed that with the extension of flowering time， the surface col or of A. rosea pollen became darker， the texture became harder， the pollen grains combined more closely， the pollen mass became smaller， and the surface became smoother and denser. A.s rosea pollen staining was pink in the bud stage， the pollen staining in the full flowering stage was the most obvious， and the staining rate was the highest， while the pollen in the decline stage could hardly be stained. In the whole flowering process， the pollen viabili ty increased at first and then decreased. The resul ts of stigma receptivity showed that the stigma bubbles were the most rapid and the receptivity was the strongest at flowering stage. The results of ?this study would provide a theoretical basis for the introduction， cultivation and ex-situ protecti on of A. rosea， and have important guiding signi ficance in the util ization of flower resources and industrial development.

Keywords： Aerides rosea; pollen morphology; pollen vitality; stigma receptivity

多花指甲蘭（Aerides rosea）為蘭科（Orchidaceae）指甲蘭屬附生草本植物，花型奇特，狀似“狐尾”，花序密集，花大部白色，稍有紫色點綴其間，觀賞價值高[1]。更重要的是，多花指甲蘭極具芳香，獨特的芳香性狀也是多花指甲蘭的重要價值之一。其含有醛類、芳香族類、酯類、酮類以及萜類化合物等多種揮發(fā)性物質(zhì)，可廣泛應(yīng)用于化妝品、美容等行業(yè)[2]，近年，一家日本公司公布了其香水專利，構(gòu)成其產(chǎn)品成分的一種主要香味物質(zhì)便來自于此[3]。同時，多花指甲蘭也是重要的藥用蘭花，在印度東北部當(dāng)?shù)夭柯渚用裼惺褂弥讣滋m屬植物治療常見疾病的習(xí)俗，孟加拉國和泰國也有相關(guān)報道[4]，國內(nèi)研究人員也發(fā)現(xiàn)指甲蘭屬植物有作為抗癌藥物潛能[5]。多花指甲蘭不僅擁有花型、花色和香味等眾多優(yōu)良性狀，是不可多得的優(yōu)秀親本資源[6]，而且在醫(yī)藥業(yè)、化工業(yè)也廣泛運用，具有重大開發(fā)潛能。多花指甲蘭常附生于喬木上，由于過度的資源開采、旅游開發(fā)等生態(tài)破壞行為，以及對其附生樹種的亂砍濫伐、野生植物非法貿(mào)易，導(dǎo)致多花指甲蘭野生種群的生存面臨極大威脅。CITES（《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》）將指甲蘭屬的所有種列入其附錄Ⅱ的保護(hù)對象。我國也將其列入國家重點野生植物保護(hù)名錄（第二批次）。我們應(yīng)積極對其采取相關(guān)保護(hù)措施[6]。但由于種質(zhì)資源匱乏等原因，國內(nèi)目前較少見到多花指甲蘭的相關(guān)報道，花粉形態(tài)觀察和花粉活力測定以及柱頭可授性更是鮮有報道，還有極大的挖掘空間。

花粉和柱頭具有較高的活性是雜交育種成功的關(guān)鍵，目前，國內(nèi)外主要使用花粉染色法和花粉離體培養(yǎng)測定花粉活力。常見染色方法有醋酸洋紅染色法、I2-IK染色法和TTC染色法。據(jù)文獻(xiàn)報道，最符合真實值的方法為TTC染色法[7-9];而花粉離體培養(yǎng)是最能反映真實值的方法[10]。柱頭可授性均利用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定[11]。當(dāng)前，僅有少數(shù)研究人員以市場上常見的幾種蘭花為材料進(jìn)行了花粉形態(tài)、花粉活性以及柱頭可授性的研究。褚怡等[11]研究了大花蕙蘭和幾種國蘭的花粉活力和柱頭可授性，喻蘭等[12]對蝴蝶蘭的花粉活力和柱頭可授性進(jìn)行了測定。羅遠(yuǎn)華等[13]以20個文心蘭種質(zhì)為材料，對花粉活力進(jìn)行測定。這些研究明確了各材料最佳的授粉時機(jī)，為蘭花的雜交育種、引種栽培提供了理論指導(dǎo)。本文在前人的基礎(chǔ)上對多花指甲蘭的花粉形態(tài)、花粉活力以及柱頭可授性開展研究，以期為多花指甲蘭的雜交引入、遷地保護(hù)以及后續(xù)的應(yīng)用開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

材料來源于云南省瀾滄縣（99°29′?E～ 100°35′?E、22°01′?N～23°16′?N之間），為野生種，目前種植于海南大學(xué)育苗基地（20°03′?N，110°19′?E）。使用試劑為氯化三苯基四氮唑（TTC）、I2-KI以及醋酸洋紅染液。試驗器材為鑷子、解剖針、解剖刀、蓋玻片、載玻片、10?mL離心管、恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡（BA210-T）等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?多花指甲蘭花粉電鏡掃描 ?采集花蕾期、盛花期、衰敗期的多花指甲蘭花粉（圖1），經(jīng)離子濺射儀噴金后，置于場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察（S-4800）。選取各時期花粉在30×、100×、500×的視野下觀察并對各開花時期花粉塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拍照記錄。

1.2.2 ?花粉活力染色測定 ?結(jié)合胡適宜[14]與羅遠(yuǎn)華等[13]的方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，具體為用pH為7.2～7.4的10 × 0. 01?mol/L磷酸緩沖液配成0.5%的TTC溶液、I2-KI以及醋酸洋紅染液取不同開花時期新鮮花粉團(tuán)，將花粉搗碎于載玻片上，用鑷子與解剖針使之充分分散，然后滴加適量新鮮配制的TTC染色液、I2-KI以及醋酸洋紅染液，蓋上蓋玻片，用錫箔紙包裹黑暗處理置于35?℃恒溫箱中。24?h后在光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計花粉活力，每張片子隨機(jī)計數(shù)5個視野的染色率，染成紅色的為活力強的花粉，淡紅色為活力弱的花粉，無活力或不育的花粉無法被染色。

1.2.3 ?花粉離體萌發(fā) ?以錢鑫等[15]、郭麗霞等[16]的研究為基礎(chǔ)對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，預(yù)實驗結(jié)果表明，最適培養(yǎng)基為：20%蔗糖+20?mg/L硼酸+ 10?mg/L?CaCl2，在25?℃恒溫中暗培養(yǎng)48?h之后于光學(xué)顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，以花粉管長度超過花粉粒直徑的2倍為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，并選擇3個視 野進(jìn)行計數(shù)。

1.2.4 ?柱頭可授性檢測 ?用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定多花指甲蘭柱頭活性。聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液用1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。取不同開花時期的新鮮雌蕊柱頭，放入培養(yǎng)皿中，加入檢測液使之沒過柱頭，反應(yīng)10 min。在體視顯微鏡下觀察氣泡產(chǎn)生情況以及柱頭變色情況。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft office 2010及GraphPad Prism 8分析軟件進(jìn)行分析作圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?多花指甲蘭花粉電鏡掃描結(jié)果

與其他形態(tài)和生理特征相比，花粉形態(tài)保持相對穩(wěn)定，因此花粉形態(tài)可以作為更好的分類和系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記[14-15]。多花指甲蘭花粉團(tuán)附著于有柄的粘盤上，花粉呈黃色，蠟質(zhì)，2個。在掃描電鏡下可以清晰的觀察到每個具半裂的裂隙，表面稍有凹陷，無紋飾，近球形（圖2A），粘盤柄狹長，粘盤較寬（圖3A）。每個花粉團(tuán)均由大量形狀不規(guī)則花粉粒通過類脂質(zhì)粘合而成。由圖2～圖4和表1可知，隨著開花時間延長，花粉粒皺縮，體積變小，整個花粉團(tuán)體積也相應(yīng)變小，花粉團(tuán)表面變得更加緊密平滑。尤其是開花10?d后時，即衰敗期，花粉粒表面致密平滑。

2.2 ?不同開花時期花粉的活力測定

研究發(fā)現(xiàn)，多花指甲蘭最佳染色時長為12?h。實驗結(jié)果表明，TTC染色液和醋酸洋紅染色效果最接近離體萌發(fā)結(jié)果，而I2-KI染液會使整個視野變紅，不利于觀測;開花4～6?d的花粉染色效果最好，顏色最深，染色率最高（圖5），花蕾期染色較淺，呈粉紅色，且染色數(shù)目較少，開花10?d的花粉幾乎無法染色，染色極淺。整個花期花粉活力先上升到達(dá)最高值，之后下降，呈先升后降趨勢。

2.3 ?不同開花時期柱頭可授性研究結(jié)果

利用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定多花指甲蘭柱頭可授性（表2），結(jié)果顯示3個時期的柱頭在檢測液中均冒出氣泡，其中盛花期過氧化氫酶含量最高，氣泡量最大，冒出最迅速，可授性最強。花蕾期次之;衰敗期最少最緩慢，可授性最弱;但3個時期的柱頭均未變色。

3 ?討論

花粉為植物的生殖細(xì)胞，它能反映物種演化的一般規(guī)律，花粉的性狀相對穩(wěn)定，其微觀態(tài)結(jié)構(gòu)具有種間特異性，是植物分類的重要依據(jù)之一[17-20]。

蘭科植物花粉不同于其他植物，蘭科植物花粉由成千上萬的花粉粒通過類脂質(zhì)集合而成。花粉粒由四分體組成的，四分體是構(gòu)成花粉的基本單位。不同種屬蘭花花粉形態(tài)、表面紋飾不一。如蝴蝶蘭花粉塊為梨形，中間有大縫隙，花粉塊可分為兩半[12];杓蘭屬花粉表面都有圓形凹陷，外壁結(jié)構(gòu)呈光滑或褶皺狀[21]。多花指甲蘭花粉近球形，表面具裂隙，無紋飾，類似蜂巢，未見萌發(fā)孔。由于花粉粒結(jié)合緊密，相互擠壓，花粉粒呈不規(guī)則狀。隨著開花時間的延長，花粉粒粘合得更加緊密，花粉團(tuán)體積也相應(yīng)變小?；ǚ刍钚耘c柱頭可授性是影響雜交結(jié)實率的關(guān)鍵因素，本研究發(fā)現(xiàn)，花粉染色在開花4～6?d效果最好，花蕾期次之，衰敗期幾乎無法染色?；ǚ刍钚耘c自身遺傳特性有關(guān)，羅遠(yuǎn)華等[13]研究發(fā)現(xiàn)不同的文心蘭種質(zhì)花粉活力不同。同時還與環(huán)境溫度、花期長短等多種因素有關(guān)，且蘭花花粉團(tuán)是由花粉粒依靠類脂質(zhì)聚合而成的，分離困難，一定程度上增加了實驗難度。結(jié)果表明，最接近真實值的花粉染色方法為TTC染色法和醋酸洋紅染色法，I2-KI的測量值遠(yuǎn)大于其他3種方法。這是由于I2-KI是根據(jù)花粉粒積累淀粉的量來判斷花粉活力，而三核期退化的花粉已有淀粉積累，遇碘呈藍(lán)色反應(yīng)另外，含有淀粉而被殺死的花粉粒遇I2-KI也呈藍(lán)色，因此，此法不能準(zhǔn)確表示花粉的活力。

開花10?d以后TTC染液和醋酸洋紅染液幾乎無法將花粉染色，而花粉萌發(fā)率依然較高，這很可能是因為開花后期花粉粒結(jié)合過于緊密，類脂質(zhì)阻礙了染色液的進(jìn)入，導(dǎo)致染色困難。蘭花花粉屬于二核型花粉，有厚實的外壁，壽命很長，易于保存[17]，不會輕易失活。兜蘭、蝴蝶蘭等花粉活力均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢[4，12]，這與我們的研究結(jié)果一致。柱頭可授性的結(jié)果顯示多花指甲蘭開花5?d可授性最好，但3個時期的柱頭在檢測液中均未變色，該現(xiàn)象在其他植物中也有出現(xiàn)，如蘇蕓蕓[22]用同種方法研究了藿香的柱頭可授性，亦只見氣泡，未見柱頭變色。多花指甲蘭花粉活力最高時期與柱頭可授性時期一致，可選擇開花4～6?d時對多花指甲蘭進(jìn)行人工授粉。

洋蘭的野生種大都艷而無香，因而培育有香味的洋蘭品種是今后洋蘭育種的主要目標(biāo)之一[23-24]。黃金小神童是花香引入的典范，為大花蕙蘭與四季蘭素心的雜交種[25]，氣味幽香。多花指甲蘭花香清幽、花型美麗，后期可大力開展該種與其近緣種屬之間的雜交育種研究。

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