王曉霞， 吳 昊， 聶智華， 馬力通， 崔金龍， 賽華征， 成建國

1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014010 2. 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 北京 100084 3. 生物煤化工綜合利用內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心， 內(nèi)蒙古 包頭 014010

引 言

黃腐植酸(fulvic acid， FA)為腐植酸中的一種， 其結(jié)構(gòu)中含有較多的活性基團(tuán)， 具有水溶性好， 分子量小等特點(diǎn)， 是一種良好的免疫佐劑[1]。 近年來， 在醫(yī)藥等領(lǐng)域表現(xiàn)突出， 如Winkler John[2]等研究黃腐植酸對(duì)于慢性疾病和糖尿病的療效； Jayasooriya Rajapaksha Gedara Prasad Tharanga[3]等研究黃腐植酸可能具有刺激免疫調(diào)節(jié)作用， 誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡等功效。 血清白蛋白是人和動(dòng)物的血漿中最豐富的蛋白質(zhì)， 作為血液緩沖劑、 維持血漿滲透壓和運(yùn)載藥物小分子， 生物體內(nèi)承擔(dān)重要作用。 牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)與人血清白蛋白在結(jié)構(gòu)上類似， BSA更容易獲得也更為廉價(jià)， 這些特點(diǎn)使得BSA常用來做研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的理想模型。 FA分子結(jié)構(gòu)中的含有多個(gè)具有活性的酚羥基和羧基， 可以與藥物載體血清白蛋白結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)相互作用。 本研究能為FA類新藥物的開發(fā)及未來對(duì)于研究FA藥物對(duì)人體的作用提供一定的數(shù)據(jù)參考。 同時(shí)通過本實(shí)驗(yàn)FA與BSA相互作用的探究也對(duì)FA的性能和其對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的影響具有重要理論價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器： 熒光分光光度計(jì)(LS-55,美國PerkinElmer公司)； 紫外-可見近紅外分光光度計(jì)(CARY 5000， AGILENT TECHNOLOGIES有限公司)； 圓二色譜儀(Chirascan plus， 英國應(yīng)用光物理公司)。 試劑： FA(純度≥98%)(合肥巴斯夫生物科技有限公司)； BSA(純度≥98%)(上海金穗科技有限公司)； 三羥甲基氨基甲烷(tris hydroxymethyl aminomethane， Tris， 分析純)(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.2 溶液配制

分別配制pH 7.40， 濃度為0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液、 0.5 mol·L-1的NaCl溶液、 5×10-5mol·L-1的BSA儲(chǔ)備液。 準(zhǔn)確移取BSA儲(chǔ)備液后加入濃度為0.5 mol·L-1NaCl溶液20 mL， 用pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容至100 mL， 得到濃度為5×10-6mol·L-1的牛血清白蛋白溶液； 配制濃度為1.5×10-3mol·L-1的黃腐植酸溶液： 用天平準(zhǔn)確稱取黃腐植酸藥品粉末0.049 3 g， 充分溶解后定容至100 mL， 得到濃度為1.5×10-3mol·L-1的黃腐植酸溶液。

1.3 方法

1.3.1 測定不同溫度下FA-BSA的熒光光譜

取9支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到試管內(nèi)BSA濃度為5×10-7mol·L-1， FA濃度從低到高依次為(0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2和4.8)×10-4mol·L-1， 搖勻后靜置20 min后放入恒溫水浴箱， 將溫度分別設(shè)置為298， 303和308 K， 在不同溫度下加熱20 min后取出,使用熒光光度計(jì)進(jìn)行測量。 設(shè)置熒光激發(fā)波長280 nm， 狹縫寬度均為10 nm， 掃描速度1 500 nm·min-1， 發(fā)射波長290～550 nm， 記錄相對(duì)應(yīng)的熒光值。

1.3.2 測定FA-BSA的同步熒光光譜

取9支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到比色管內(nèi)BSA濃度為5×10-7mol·L-1， FA濃度從低到高依次為(0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2和4.8)×10-4mol·L-1， 震蕩搖勻后待測。 在熒光光度計(jì)同步熒光激發(fā)波長280 nm， 狹縫寬度均為9 nm， 掃描速度1 500 nm·min-1條件下， 分別掃描測定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm下體系的同步熒光光譜。

1.3.3 測定FA-BSA三維熒光光譜

選用兩支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到兩支試管內(nèi)溶液濃度為： BSA為2.5×10-7mol·L-1， FA為 3.0×10-5mol·L-1。 震蕩搖勻后待測。 在三維熒光激發(fā)波長200 nm， 狹縫寬度7.0 nm條件下， 設(shè)置發(fā)射波長200～500 nm， 掃描速度為1 500 nm·min-1， 分別測量40組發(fā)射波長間隔為5 nm的三維熒光光譜。

1.3.4 測定FA-BSA的紫外-可見光吸收光譜

分別移取適量BSA和FA至比色管， 定容后試管內(nèi)BSA濃度為5×10-7mol·L-1， FA濃度從低到高依次為(0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2和4.8)×10-4mol·L-1， 震蕩搖勻后待測。 用紫外分光光度計(jì)掃描紫外-可見吸收光譜， 掃描波長190～450 nm， 波長間隔1 nm的條件下測量紫外-可見吸收光譜。

1.3.5 測定FA-BSA結(jié)合距離

取3支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到三個(gè)試管溶液濃度為： BSA為5×10-7mol·L-1； FA為5×10-7mol·L-1； BSA為5×10-7mol·L-1， FA為5×10-7mol·L-1。 震蕩搖勻后靜置待測。 在熒光光譜儀激發(fā)波長280 nm， 狹縫寬度8.0 nm條件下， 掃描波長范圍為290～550 nm， 設(shè)置掃描速度500 nm·min-1， 測量并得到FA和FA-BSA的熒光光譜。 在紫外分光光度計(jì)掃描波長190～450 nm， 參數(shù)波長間隔1 nm的條件下， 測量并得到FA的紫外-可見吸收光譜。

1.3.6 測定FA-BSA圓二色譜

取2支10 mL比色管， 分別移取適量BSA和FA， 得到溶液濃度為： BSA濃度為1×10-5mol·L-1； BSA濃度為1×10-5mol·L-1， FA濃度為4×10-5mol·L-1。 圓二色譜儀掃描波長范圍為180～260 nm， 狹縫寬度8.0 nm， 時(shí)間0.5 s， 用Tris-HCl作為參比， 記錄BSA與FA-BSA體系的圓二色譜。

1.3.7 分子對(duì)接模擬

使用ChemDraw Professional 15.1軟件繪制FA的分子結(jié)構(gòu)式， 選取蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫RCSB Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/bdb/home/home.do)中BSA晶體結(jié)構(gòu)， 使用分子對(duì)接軟件Accelrys Discovery Studio 3.5進(jìn)行分子對(duì)接模擬。

2 結(jié)果與討論

2.1 FA與BSA作用的熒光猝滅光譜

由于BSA分子含有酪氨酸(Tyr)、 色氨酸(Trp)、 苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基能使得BSA分子具有強(qiáng)烈的內(nèi)源性熒光， FA溶液加入BSA溶液后， 出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象。 圖1(a,b,c)是在溫度分別為298,303和308 K下， BSA與不同濃度的FA溶液所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度變化情況。 由圖1分析對(duì)比可知， 激發(fā)波長280 nm， BSA最大發(fā)射波長為346 nm， 隨著FA溶液濃度增加， BSA熒光強(qiáng)度呈規(guī)律下降， 發(fā)射峰的位置與峰型卻沒有明顯改變， 因此可得出FA對(duì)BSA產(chǎn)生熒光猝滅作用， 兩者發(fā)生相互作用。

圖1 不同溫度下BSA-FA體系相互作用的熒光發(fā)射光譜圖(a): 298 K； (b): 303 K； (c): 308 K; c(BSA)=5×10-7 mol·L-1；c(FA)(1—9): (0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2， 4.8)×10-4 mol·L-1; pH 7.40Fig.1 Fluorescence emission spectra of BSA-FA interaction system under different temperature(a): 298 K； (b): 303 K； (c): 308 K; c(BSA)=5×10-7 mol·L-1；c(FA)(1—9): (0， 0.6， 1.2， 1.8， 2.4， 3.0， 3.6， 4.2， 4.8)×10-4 mol·L-1; pH 7.40

2.2 FA與BSA相互作用的熒光猝滅類型

熒光猝滅過程分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅， 動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑FA與熒光激發(fā)態(tài)分子BSA之間相互碰撞， 使得熒光強(qiáng)度降低， 不會(huì)影響到BSA的構(gòu)象； 熒光猝滅過程中靜態(tài)猝滅則是基態(tài)下熒光分子與猝滅分子形成不發(fā)光的基態(tài)配合物， 使得熒光減弱,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[4]。 實(shí)驗(yàn)采用Stern-Volmer方程[5]進(jìn)行處理來判斷猝滅類型

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式(1)中，F(xiàn)A溶液作為猝滅劑， F0為不加入FA溶液時(shí)體系的熒光強(qiáng)度； F為加入FA溶液后體系的熒光強(qiáng)度； [Q]為實(shí)驗(yàn)測量最終FA溶液的濃度， KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)， Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)； τ0為當(dāng)猝滅劑FA不存在時(shí)， 熒光分子的平均熒光壽命， 通常取值10-8s。 以[Q]為橫軸， F0/F為縱軸， 作298， 303和308K溫度下該體系的Stern-Volmer曲線,并擬合得到方程與相關(guān)系數(shù)， 見表1。

由表1可知， 在298， 303和308K下計(jì)算得到Kq值均遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s[6]。 證明FA主要通過靜態(tài)猝滅來降低BSA的熒光強(qiáng)度， 且猝滅常數(shù)在298， 303和308K下的數(shù)值隨著溫度升高而降低， 進(jìn)而更表明FA與BSA作用為靜態(tài)猝滅。

表1 Stern-Volmer線性方程以及相關(guān)系數(shù)Table 1 Stern-Volmer linear equations and correlation coefficients

2.3 FA與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

已證明FA與BSA相互作用的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅， 則靜態(tài)猝滅雙對(duì)數(shù)公式[7]適用于該反應(yīng)體系

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式(2)中， KA為FA和BSA的結(jié)合常數(shù)； n為FA與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)； F0為不加入FA溶液時(shí)體系的熒光強(qiáng)度； F為加入FA溶液后體系的熒光強(qiáng)度。 以lg[(F0-F)/F]的值作為縱坐標(biāo)， 以lg[Q]的值作為橫坐標(biāo)作圖， 其直線斜率即為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n， 結(jié)合常數(shù)KA為直線截距的負(fù)對(duì)數(shù)值， 見表1。 從表1可知， 三個(gè)溫度下結(jié)合常數(shù)KA都較大， 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)在1附近， 證明FA與BSA結(jié)合力較強(qiáng)， 且該體系相互作用所形成的復(fù)合物為1∶1型。 同時(shí)， 結(jié)合常數(shù)數(shù)值隨著溫度的上升而減小， KA(298K)>KA(303K)>KA(308K)， 與猝滅常數(shù)隨溫度變化規(guī)律一致， 進(jìn)一步證明了FA與BSA體系猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

2.4 FA與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和主要作用力

藥物小分子與蛋白質(zhì)相互之間通過不同的作用力相互作用形成配合物， 相互作用力的表現(xiàn)形式主要有氫鍵、 疏水作用力、 靜電引力和范德華力。 通過Van’t Hoff公式[8]計(jì)算得到反應(yīng)體系的熵變?chǔ)與焓變?chǔ)， Van’t Hoff公式與反應(yīng)的吉布斯自由能公式如式(3)—式(5)

lnKA=-ΔH/RT+ΔS/R

(3)

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKA

(5)

式(3)—式(5)中，ΔG反應(yīng)的吉布斯自由能； KA是結(jié)合常數(shù)； R為摩爾氣體常數(shù)(取R=8.314J·mol-1·K)； T為試驗(yàn)溫度。 根據(jù)式(3)—式(5)求得ΔH=-33.48KJ·mol-1，ΔS=-40.78J·mol-1·K和ΔG=-20.95kJ·mol-1(298K)， -21.12kJ·mol-1(303K),-20.92kJ·mol-1(308K)。 根據(jù)Ross[9]理論可知，F(xiàn)A與BSA體系的熱力學(xué)參數(shù)ΔH<0，ΔS<0表明體系中兩者之間的作用力為氫鍵和范德華力；ΔG<0表明反應(yīng)為自發(fā)反應(yīng)， 同時(shí)本反應(yīng)為放熱反應(yīng)(ΔH<0)。

2.5 FA與BSA體系結(jié)合距離的計(jì)算

按照F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理[10-11]， 該體系滿足以下關(guān)系式

J=∑FD(λ)εA(λ)λ4Δλ/∑FD(λ)Δλ

(8)

式(6)—式(8)中： F為在BSA與FA體系中FA與BSA濃度比為1∶1時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度， F0為只有蛋白質(zhì)BSA時(shí)測得的熒光強(qiáng)度， r為BSA與FA之間的結(jié)合距離； R0為E=50%時(shí)的臨界距離； k2為偶極空間取向因子， 取平均值2/3； n為介質(zhì)的折射指數(shù)， 取水和有機(jī)物的平均值1.336； φ為BSA的熒光量子產(chǎn)率， 取色氨酸(Trp)殘基量子產(chǎn)率φ=0.15； J為BSA的熒光發(fā)射光譜與FA紫外吸收光譜間的光譜重疊積分； FD(λ)為BSA在波長λ處的熒光強(qiáng)度； εA(λ)為受體FA在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。

BSA的熒光光譜曲線與FA的紫外吸收光譜曲線的重疊圖見圖2， 圖2重疊部分說明FA與BSA之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移。 根據(jù)式(6)—式(8)計(jì)算得到重疊積分J=2.021×10-15cm3·mol·L-1， E=18.30%， R0=4.79nm， r=6.340nm。 結(jié)果表明，F(xiàn)A與BSA相互作用的結(jié)合距離r<7nm， 同時(shí)0.5 R0

圖2 BSA的熒光發(fā)射光譜(a)與FA的 紫外吸收光譜(b)的重疊圖Fig.2 Overlapping of the fluorescence emission spectra (a) of BSA and with the absorption spectra (b) of FA c(BSA)=c(FA)=5.0×10-7 mol·L-1

2.6 FA與BSA分子對(duì)接模擬

分子對(duì)接技術(shù)可以更清晰地了解BSA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變和FA與BSA相互作用體系中的作用力類型。 利用分子對(duì)接模擬軟件繪制出FA與BSA相互作用體系的分子對(duì)接模擬圖， 如圖3所示。 圖3(a)和(b)中， BSA立體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)心型且FA分子位于BSA的活性中心， FA與BSA結(jié)合位點(diǎn)靠近BSA亞結(jié)構(gòu)域ⅢB(Subdomain ⅢB)site Ⅱ點(diǎn)。 為進(jìn)一步觀察FA與BSA相互作用的微環(huán)境， 列出FA結(jié)合位點(diǎn)附近對(duì)結(jié)合作用影響較為明顯的氨基酸殘基， 見圖3(c)。 圖3(c)中， FA與BSA的氨基酸殘基之間存在范德華力(Van der waals)的有： HIS534， GLN579， LEU582， LYS535， LEU531， THR578， PHE508， PHE553， GLY571和PRO572。 FA與GLU503和THR507氨基酸殘基之間為氫鍵作用力(Conventional Hydrogen Bond)， FA與GLU503氫鍵鍵長為5.45 ?， FA與THR507氫鍵鍵長為3.19 ?。 FA與BSA中PHE501， VAL575和PHE506氨基酸殘基之間存在不利于碰撞作用力(Unfavorable Bump)， FA與PHE501鍵長為4.69 ?， FA與VAL575不利于碰撞鍵長為3.64 ?， FA與PHE506鍵長為5.34 ?。 FA與BSA中PHE506和LEU574殘基存在疏水作用力(以Pi-alkyl與Pi-Pi Stacked形式存在)， FA與PHE506鍵長為4.60 ?， FA與LEU574疏水作用力鍵長為6.26 ?。 上述結(jié)果證明了FA與BSA相互作用使二者可穩(wěn)定結(jié)合， 表明了BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)微環(huán)境的變化。

圖3 FA-BSA分子對(duì)接結(jié)果(a)： FA-BSA分子對(duì)接模擬圖； (b)： FA-BSA分子對(duì)接模擬飄帶圖； (c)： FA-BSA的氨基酸殘基的2D、 3D示意圖Fig.3 The molecular docking result of FA with BSA(a)： Molecular docking simulation of FA and BSA； (b)： Streamer shape molecular docking model diagram of FA and BSA；(c)： 2D and 3D schematic diagram of amion residues of FA and BSA

2.7 FA對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.7.1 FA與BSA相互作用的紫外-可見吸收光譜

用紫外光譜可以探索FA對(duì)BSA的結(jié)構(gòu)改變， 模擬生理?xiàng)l件下， 分別測定BSA和FA與BSA體系的紫外-可見吸收光譜， 見圖4。 由圖4可知， 體系的紫外吸收峰在280 nm左右出現(xiàn)， 隨FA濃度的不斷增大， 最大吸收峰紅移了3 nm， 分析認(rèn)為由于FA與BSA堿基對(duì)發(fā)生了電子堆積， FA的空軌道與堿基的電子軌道發(fā)生耦合， 發(fā)生了躍遷， 吸收光波的能量減小[12-13]， 使BSA周圍微環(huán)境極性增大， 疏水性減小， 親水性增大， 證明FA使BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖4 FA-BSA作用體系的紫外吸收光譜圖

2.7.2 FA與BSA相互作用的同步熒光光譜分析

同步熒光光譜可以明確反映出蛋白質(zhì)氨基酸殘基周圍微環(huán)境的變化， 對(duì)體系進(jìn)行了同步熒光光譜測定， 見圖5。 由圖5可知， 在BSA的濃度保持不變的情況下， 隨著FA濃度梯度的升高， 圖5(a)中Δλ=15 nm下對(duì)應(yīng)表征的酪氨酸(Tyr)殘基同步熒光光譜的最大發(fā)射波長基本維持不變， 峰型無明顯變化， 熒光強(qiáng)度猝滅程度較弱； 而圖5(b)中Δλ=60 nm下對(duì)應(yīng)表征的色氨酸(Trp)殘基同步熒光光譜的最大發(fā)射波長紅移了3 nm， 且熒光猝滅程度較強(qiáng)， 這說明FA使BSA中的色氨酸(Trp)殘基周圍的微環(huán)境極性增強(qiáng)， 疏水性減弱， 親水性增強(qiáng)， 使得BSA的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的改變， 證明FA作用在BSA的色氨酸(Trp)殘基上， 使BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖5 FA-BSA作用體系的同步熒光光譜圖

2.7.3 FA與BSA相互作用的三維熒光光譜分析

為進(jìn)一步研究FA與BSA的結(jié)合對(duì)BSA產(chǎn)生結(jié)構(gòu)及在微環(huán)境的影響， 對(duì)體系進(jìn)行三維熒光光譜測定， 見圖6、 圖7。 由圖6、 圖7可知， 峰1(peak 1)與峰2(peak 2)的熒光強(qiáng)度都發(fā)生了較大程度的降低， 且兩峰都在最大發(fā)射波長處出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象， 峰1(peak 1)最大發(fā)射波長峰紅移了1 nm， 峰2(peak 2)最大發(fā)射波長峰紅移了4 nm， 證明FA與BSA發(fā)生了相互作用， FA使BSA周圍環(huán)境的極性增大， 疏水性減弱， 親水性增強(qiáng)， 使BSA的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。 圖6(a,b)、 圖7(a,b)中， 呈現(xiàn)“山脊”形狀的峰a(peak a)、 峰b(peak b)稱為瑞利散射峰(λex=λem)； 呈現(xiàn)“駝峰”形狀的峰1、 峰2為典型的熒光峰(2λex=λem)， 其中峰1表征酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基,峰2涉及多肽骨架結(jié)構(gòu)， 表征BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[14-15]。 當(dāng)BSA溶液未加入FA時(shí)， 兩峰的特征參數(shù)(λex/λem， F)分別為peak 1(280/343,271.8)， peak 2(225/340,664.3)， 峰1與峰2的熒光強(qiáng)度比為1∶2.44； 當(dāng)加入FA溶液后， FA與BSA相互作用體系的兩熒光峰特征參數(shù)(λex/λem， F)為peak 1(280/344,220.5)， peak 2(225/344,503.9)， 峰1與峰2的熒光強(qiáng)度比為1∶2.28。 從峰1和峰2的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析， 加入FA溶液后， BSA的瑞利散射峰peak a和peak b和熒光峰的強(qiáng)度都發(fā)生明顯下降， 表明BSA與FA發(fā)生相互作用后， BSA的分子表面被破壞， 蛋白質(zhì)分子更加分散， 即發(fā)生解聚作用， 進(jìn)而使蛋白質(zhì)粒徑減小， 熒光強(qiáng)度減弱， 進(jìn)一步證明FA使BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖6 BSA溶液的三維熒光光譜圖(a)和等高線圖(b)c(BSA)=2.5×10-7 mol·L-1； pH 7.40； T=298 KFig.6 Three-dimensional fluorescence spectrumand contour map of BSAc(BSA)=2.5×10-7 mol·L-1； pH 7.40； T=298 K

圖7 FA-BSA溶液的三維熒光光譜圖(a)和等高線圖(b)c(BSA)=2.5×10-7 mol·L-1；c(FA)=3.0×10-5 mol·L-1； pH 7.40； T=298 KFig.7 Three-dimensional fluorescence spectrumand contour map of FA-BSAc(BSA)=2.5×10-7 mol·L-1；c(FA)=3.0×10-5 mol·L-1； pH 7.40； T=298 K

2.7.4 FA與BSA相互作用的圓二色光譜分析

為進(jìn)一步研究FA對(duì)BSA構(gòu)象的影響， 掃描并記錄BSA與FA濃度比1∶0和1∶4體系的圓二色譜圖,見圖8。 從圖8可得BSA在208 nm處和224 nm處出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)峰， 負(fù)峰代表BSA中α-螺旋(α-Helix)結(jié)構(gòu)的特征峰。 將圓二色譜值導(dǎo)入CDNN setup v2.1軟件， 軟件自動(dòng)計(jì)算得出BSA與FA-BSA相互作用體系特征二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量值。 在BSA與FA濃度比1∶0和1∶4體系中， α-螺旋占比由22.25%降至19.9%， β-折疊占比由25.8%增至33.55%， β-轉(zhuǎn)角占比由17.85%增至18.45%， 無規(guī)則結(jié)構(gòu)占比由34.8%降至33.6%。 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量值的變化表明， FA與BSA發(fā)生了相互作用， FA改變了BSA周圍的微環(huán)境， 使BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖8 BSA和FA-BSA體系的圓二色譜圖

3 結(jié) 論

采用熒光光譜法、 紫外光譜法、 圓二色譜法、 三維熒光光譜法、 同步熒光光譜法與分子對(duì)接模擬法研究黃腐植酸與牛血清白蛋白相互作用的反應(yīng)機(jī)理。 熒光光譜表明FA與BSA相互作用猝滅過程為靜態(tài)猝滅。 根據(jù)Ross理論計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)與FA-BSA作用力類型得出， FA和BSA之間的主要作用力為氫鍵和范德華力， 作用過程自發(fā)放熱。 通過F?rster’s共振能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算得出BSA與FA結(jié)合距離為6.340 nm， 表明FA與BSA之間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。 分子對(duì)接模擬結(jié)果表明FA與BSA之間結(jié)合作用力除了氫鍵、 疏水作用力和范德華力， 兩者之間還存在不利于碰撞的作用力。 紫外—可見吸收光譜， 同步熒光光譜， 三維熒光光譜和圓二色譜都表明FA使BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變， FA使BSA中的色氨酸(Trp)殘基周圍的微環(huán)境極性增強(qiáng)， 減弱其疏水性， 增強(qiáng)其親水性。 這些結(jié)果闡明了在分子水平上黃腐植酸對(duì)于血清白蛋白的作用機(jī)理， 對(duì)未來深入研究黃腐植酸在體內(nèi)的作用和黃腐植酸在醫(yī)藥用途上的研究和開發(fā)， 具有重要的參考價(jià)值與實(shí)際意義。