路雪純，辛嘉英,,*，張 帥，王 艷，夏春谷

（1.哈爾濱商業(yè)大學，食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150028；2.中國科學院蘭州化學物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州 730000）

酶是一類具有高效性、專一性等特點的生物催化劑。酶可以在生物體內(nèi)和體外進行生物轉(zhuǎn)化，且具有優(yōu)良的立體選擇性、區(qū)域選擇性以及化學選擇性。脂肪酶作為一種綠色的生物催化劑廣泛應用在化工、食品、醫(yī)藥、能源、環(huán)境等領(lǐng)域[1?2]。游離脂肪酶在應用過程中存在穩(wěn)定性差、分離成本高、反應結(jié)束時難以從反應混合物中回收等問題，但這些問題可通過固定化技術(shù)來克服。脂肪酶的固定化，指在保留其催化活性的條件下將脂肪酶固定在一定的空間內(nèi)。固定化后不僅具有游離脂肪酶的高效性、專一性，還可以重復利用從而降低成本[3]。此外脂肪酶經(jīng)固定化后極易與底物、產(chǎn)物分開，還具有穩(wěn)定性高、使用壽命長、可實現(xiàn)連續(xù)操作等特點。固定化可以增加脂肪酶在不溶性疏水有機介質(zhì)中的分散度，提高對底物的選擇性，避免親水性蛋白顆粒的聚集[4]。

近年來固定化脂肪酶的研究主要集中在固定化材料的選擇、固定化載體的設(shè)計等方面。在固定化材料的選擇方面，主要傾向于熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性較好、與酶的結(jié)合能力強且抗生物降解性良好的材料。在載體的設(shè)計方面，主要研究了載體豐富的官能團、穩(wěn)定酶的構(gòu)象和豐富的結(jié)合位點等。因此，選擇固定化脂肪酶的方法、材料及載體的設(shè)計等方面對脂肪酶應用于食品領(lǐng)域也具有重要意義[5]。固定化脂肪酶因其優(yōu)良的性能在食品領(lǐng)域中被廣泛的用于油脂改性、酯類等香料合成、食品抗氧化劑及乳制品加工等方面[6]，脂肪酶的固定化研究已成為重要發(fā)展方向。本文主要綜述了近年來固定化脂肪酶的材料和方法，以及對固定化脂肪酶在食品加工領(lǐng)域中的應用進行闡述，為研究固定化脂肪酶在食品工業(yè)中的應用提供了一定的參考。

1 脂肪酶簡介

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一種甘油三酯水解酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中。它的基本功能是催化甘油三酯水解成脂肪酸和甘油、單甘酯或甘二酯。此外，脂肪酶還可以催化酯化、酯交換、酸解、醇解等反應[7?9]，可以作為一種工業(yè)用酶廣泛地參與到各個行業(yè)的生產(chǎn)活動中。

脂肪酶被廣泛應用于食品加工領(lǐng)域中，在食品行業(yè)中可用于促進油脂水解、改善食品風味等。脂肪酶作為綠色環(huán)保的催化劑具有很多優(yōu)良特性，是一種具有高效性、高選擇性、催化條件溫和以及酶活較高等特點的生物催化劑。此外，1,3-專一性脂肪酶可以用在特殊脂肪酸、單甘酯的合成及分解，對于食品領(lǐng)域的研究發(fā)展有著非常重要意義[10]。

2 脂肪酶固定化方法

Manecke 是最早將高分子作為載體來固定化酶的研究者之一[11]。此后，隨著生物催化技術(shù)的發(fā)展，學者們越來越關(guān)注脂肪酶固定化的研究。雖然固定化酶的方法有上百種，但是沒有一種固定化技術(shù)適用于每一種酶，所以固定化方法應該在保證酶活力損失減少及穩(wěn)定性增強的前提下，根據(jù)酶的特征和應用目的來選擇[12]。

根據(jù)酶與載體不同的結(jié)合方式，傳統(tǒng)的固定化方法主要分為吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價結(jié)合法。這些方法在使用過程中不易改變酶的空間結(jié)構(gòu)，因而能更好地保持酶的活性，提高酶的穩(wěn)定性。隨著固定化技術(shù)的不斷發(fā)展，還出現(xiàn)了疏水定向法、多酶固定法、親合法、輻射法等多種新型的固定化方法。不同的固定化酶方法及其分類如圖1 所示[13]。

圖1 酶固定化方法分類[13]Fig.1 Classification of enzyme immobilization methods [13]

2.1 脂肪酶吸附法固定化

吸附法是最簡單、最早的固定化方法，反應條件溫和，通常分為離子交換吸附和物理吸附。物理吸附是通過靜電作用力將酶固定在顆粒上，是反應過程的關(guān)鍵。Sagiroglu 等[14]在硅藻土上通過物理吸附法固定脂肪酶，經(jīng)過五次重復使用后，固定脂肪酶活力仍保留在20%左右。劉媛媛等[15]將硅藻土改性作為載體，采用吸附法來固定化脂肪酶。硅藻土在40 ℃下保存2 h 后可降低酶活力損失且增加重復利用率。Zhao 等[16]利用磁性Fe3O4@ MOF（金屬骨架有機材料）納米微球吸附脂肪酶，所得的固定化脂肪酶很快就有了較高的催化活性（圖2）。黃靜等[17]將改性后的蛭石作為載體，采用吸附-包埋法來固定脂肪酶。結(jié)果表明，固定化脂肪酶的酶活力回收率較高可達82.77%，固定化脂肪酶的重復使用穩(wěn)定性較好。

圖2 Fe3O4@MOF 固定化脂肪酶示意圖[16]Fig.2 Schematic diagram of Fe3O4@MOF immobilized lipase[16]

2.2 脂肪酶包埋法固定化

在包埋法中，酶包合發(fā)生在聚合物網(wǎng)絡中。聚合物網(wǎng)絡可以保留酶，但底物和產(chǎn)物可以通過。載體作為傳質(zhì)的屏障，具有重要的反應動力學意義。有幾種主要的包埋方法，例如大分子與多價陽離子（例如海藻酸鹽）的電致凝膠包埋法、溫度誘導的凝膠（例如瓊脂糖、明膠）包埋法、通過化學/光化學的有機聚合反應（例如聚丙烯酰胺）包埋法等[18]。Shi 等[19]通過共沉淀法制備得到納米尺寸的花狀蛋白-Cu3(PO4)2復合物，然后在其表面組裝魚精蛋白和二氧化硅，最后得到花狀魚精蛋白/二氧化硅雜化微囊固定化脂肪酶（圖3），具有較好的pH、溫度和貯存穩(wěn)定性。Okada 等[20]將殼聚糖、海藻酸鹽、CaC12進行復合作為載體，然后將脂肪酶包埋其中，制得的產(chǎn)物穩(wěn)定性較好。Zou 等[21]以介孔二氧化硅為載體，RTIL 為硅烷偶聯(lián)劑，制備了介孔二氧化硅吸附型豬胰脂肪酶（PPL），然后用海藻酸鈉凝膠微球包埋固定化酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化脂肪酶的穩(wěn)定性較高，活性保持在92%以上。

圖3 魚精蛋白/二氧化硅復合微膠囊固定化酶原理圖[19]Fig.3 Schematic diagram of immobilized enzyme in protamine/silica composite microcapsule[19]

2.3 脂肪酶交聯(lián)法固定化

交聯(lián)法是指在酶分子之間用多功能試劑進行化學交聯(lián)，進而形成交聯(lián)的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，酶分子既是催化主體又是載體。交聯(lián)法通常與其它方法同時存在，輔助其他固定化方法來固定化酶[22]。在這種固定化酶的方法中，酶分子與載體通過化學鍵連接形成三維結(jié)構(gòu)。Mateo 等[23]用戊二醛將吸附到介孔材料上的脂肪酶交聯(lián)，成功地改進了交聯(lián)法，形成的交聯(lián)酶可以阻止孔道內(nèi)酶分子的減少（圖4）。林海蛟等[24]以大孔吸附樹脂為載體，采用甘油醚為交聯(lián)劑來固定化海洋脂肪酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶具有良好的溫度穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。連續(xù)操作5 次后酶活力仍保持57.38%。王慧玲等[25]采用交聯(lián)吸附法以戊二醛為交聯(lián)劑來固定化青霉脂肪酶，結(jié)果顯示酯化酶活為22895 U/g，且回收率高達67.57%，表明該固定化酶酯化能力遠高于游離狀態(tài)的酶。

圖4 固定在介孔材料孔隙中的交聯(lián)酶示意圖[23]Fig.4 Schematic diagram of crosslinking enzymes fixed in the pores of mesoporous materials[23]

2.4 脂肪酶共價固定法固定化

在共價結(jié)合中，酶的固定化方法是酶上的官能團與載體之間形成共價鍵。脂肪酶分子表面一般含有特殊基團，如精氨酸或賴氨酸的氨基（-NH2）、谷氨酸或天冬氨酸的羧基（-COOH）、蘇氨酸或絲氨酸的羥基（-OH）和半胱氨酸的巰基（-SH）。Liu 等[26]將Fe3O4納米粒子采用乳化法交聯(lián)，然后對磁性粒子功能化來共價固定化脂肪酶，結(jié)果顯示固定化酶具有較好的穩(wěn)定性和催化活性。G1oria 等[27]通過共價吸附法將三種不同的脂肪酶固定在疏水載體辛基-瓊脂糖上，結(jié)果表明脂肪酶的選擇性和活性都有所增加，固定化脂肪酶性能略有改變。

每種酶固定化方法都各有其優(yōu)缺點。一般來說，一種酶可以通過多種方式固定，但沒有一種方法可以普遍適用于酶的固定，往往需要結(jié)合多種方法，來使酶的活性和穩(wěn)定性提高。

3 脂肪酶的固定化材料

固定化酶的性能主要由固定化方法和固定化材料所決定。然而，固定化酶穩(wěn)定性的提高往往是以酶活性降低為代價的。設(shè)計高效的固定化酶系統(tǒng)面臨的主要挑戰(zhàn)是同時獲得高的酶活力保留率以及增強酶的穩(wěn)定性和可重用性，這是一項復雜的任務，因為涉及的變量很多，可用的方法和材料也很多。載體是酶固定化過程中的關(guān)鍵因素，它為脂肪酶提供了優(yōu)良的生物相容性、穩(wěn)定的理化性質(zhì)和豐富的結(jié)合位點。在食品加工中，固定化載體對脂肪酶的活性、穩(wěn)定性和選擇性有重要的影響。優(yōu)良的載體材料具有豐富的官能團、良好的機械強度、較高的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性、高的酶結(jié)合能力和抗生物降解性，并能保持良好的酶活性、穩(wěn)定性和可操作性等。目前，在食品加工領(lǐng)域，優(yōu)良載體材料可提高脂肪酶的活性、穩(wěn)定性和重復利用率，已成為固定化脂肪酶研究的熱點之一[28]。

3.1 無機載體材料

無機載體材料是指可以直接從自然界中獲得的無機材料或可以通過簡單的無機材料固定酶或細胞的載體[5]。氧化鋁、活性炭、介孔氧化硅和硅藻土等都是常見的無機材料，它們具有原料易得、價格低廉、不易分解且對微生物無毒等特點。介孔材料比表面積較高且孔結(jié)構(gòu)有序，將酶固定化的方法主要有吸附法、共價結(jié)合法和交聯(lián)法。在食品加工領(lǐng)域中，許多學者利用有機高分子對無機載體進行修飾，研究其與脂肪酶的結(jié)合[12]。

Jin 等[29]合成了三種不同烴鏈長度（丙基、辛基和十八基）的烷基功能化介孔二氧化硅，采用吸附法來固定化脂肪酶r27RCL。結(jié)果表明，固定化脂肪酶r27RCL 的十八烷基功能化介孔二氧化硅生物催化活性較高，且重復使用5 次沒有明顯的活性損失。曹婕等[30]為了提高脂肪酶的催化性能，采用包埋法將酶負載在不同比例的殼聚糖/膨潤土載體上，研究表明脂肪酶負載量最高92.1%時，復合載體的質(zhì)量比為10%，在反應五批次后，酶活仍保持在68.2%，具有較好的酶穩(wěn)定性。李笑迎等[31]采用環(huán)氧樹脂聚合物為模板制備SiO2材料，通過吸附法來固定化脂肪酶，結(jié)果表明酶活及儲存穩(wěn)定性得到明顯提高。Mohadese 等[32]通過共價結(jié)合法固定化脂肪酶，對二氧化硅進行了修飾，增加了脂肪酶的穩(wěn)定性和活性。

3.2 有機載體材料

有機載體材料是指能夠直接以天然有機物為載體材料或通過某些化學反應進行固定化和制備的一類載體材料，持水性較好而且有靈活的選擇性，可以滿足不同的要求。有機合成高分子化合物、天然多糖和農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物都是比較常用的載體材料。在食品加工過程中，經(jīng)過有機載體固定的脂肪酶，可作為食品反應的催化劑用于加工食品。

Shi 等[33]通過交聯(lián)法與仿生礦化結(jié)合制備復合微球來固定化脂肪酶（圖5）。結(jié)果表明，與游離酶相比，固定化酶保留了約85%的催化活性，穩(wěn)定性和重復使用性較高。Hyun 等[34]用纖維素納米晶（CNCS）來固定假絲酵母脂肪酶，結(jié)果顯示，其活性和穩(wěn)定性均高于游離酶。Nadia 等[35]以聚氨酯泡沫塑料（PU）為載體，采用固定化方法固定南極假絲酵母B（Calb）脂肪酶。結(jié)果表明，脂肪酶衍生物活性提高了535%且穩(wěn)定性較好，催化合成的丙酸香葉酯和油酸乙酯的轉(zhuǎn)化率分別在97%和83%左右，可作為食品工業(yè)反應的催化劑。徐珊等[36]采用包埋交聯(lián)法固定化脂肪酶，以羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉復合作為載體。實驗表明，酶活較高且耐熱性較好，不易脫落。盧佳偉等[37]采用交聯(lián)法將脂肪酶固定在聚丙烯腈（PAN）中空膜中，并且把海藻酸鈉加入到其中。結(jié)果表明，重復使用15 次后酶活仍為58.77%，耐溫性和耐酸性與游離酶相比都較高。虞鳳慧等[38]通過包埋法用復合載體來固定化畢赤酵母高溫堿性脂肪酶，考察不同因素對固定化酶的影響。結(jié)果表明，最優(yōu)條件下酶活率高達99.5%。

圖5 花狀殼聚糖/焦磷酸鈣雜化及酶的固定化示意圖[33]Fig.5 Schematic diagram of flower-like chitosan/calcium pyrophosphate hybridization and enzyme immobilization [33]

3.3 復合載體材料

隨著研究的發(fā)展，脂肪酶固定化材料性能單一的缺陷限制了固定化技術(shù)的發(fā)展。漸漸出現(xiàn)了兩種或兩種以上性能優(yōu)異的復合材料，這種復合材料成為了酶固定材料的新方向[28]。復合材料在適當?shù)奈h(huán)境中提高了機械性能，如強度、彈性、可塑性和化學鍵。它不僅具有有機材料的柔韌性和良好的可成型性，還具有強度高、熱穩(wěn)定性好、耐化學性好等無機材料的優(yōu)點。

Cheng 等[39]將皺褶假絲酵母脂肪酶（CRL）固定在大孔二氧化硅上，用聚多巴胺（PDA）進行了改性。結(jié)果表明，PDA/MMS 復合材料為提高直接固定化酶的催化活性提供了一種簡單、經(jīng)濟有效的途徑。CRL-PDA/MMS 的活力回收率為201%，固定化脂肪酶的活性和穩(wěn)定性都顯著提高。白文靜等[40]通過原位聚合將二氧化硅大孔材料（PDA/SiO2）作為載體來固定脂肪酶（PFL），實驗表明得到的固定化酶比游離酶有更好的熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性且具有良好的親和性。黃孟云等[41]將磁性納米復合材料Fe3O4@GO、Fe3O4@MIL-100（Fe）、Fe3O4@P（GMA-DVB-MAA）通過碳二亞胺/N-羥基琥珀釀亞胺活化，將脂肪酶固定到復合材料上。結(jié)果表明，固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性良好，重復使用五次后，生物柴油轉(zhuǎn)化率較高。劉磊磊等[42]制備了三種新的磁性復合載體來固定化脂肪酶。研究結(jié)果表明，固定化酶的穩(wěn)定性和抗污染性有顯著提升，實現(xiàn)了脂肪酶的快速分離回收和重復使用。韓秀麗等[43]將脂肪酶固定在徑為40～60 μm 的磁性殼聚糖微球上，實驗顯示該方法可以用于固定化脂肪酶，并且實際載酶量為64.4 mg/g。Liang 等[44]將脂肪酶固定在金屬有機框架復合材料上，發(fā)現(xiàn)金屬-有機骨架殼中受保護的脲酶和辣根過氧化物酶分別煮沸后仍保留生物活性，這種結(jié)果為生物大分子的開發(fā)提供了新的可能性。

3.4 納米載體材料

隨著納米技術(shù)的進步，各種納米結(jié)構(gòu)材料由于具有超高的比表面積，作為酶固定化載體受到了人們的關(guān)注。相比于傳統(tǒng)材料在載酶量和單位體積的酶活性方面具有顯著的提高[45]。納米結(jié)構(gòu)材料的優(yōu)點之一是能夠在納米尺度上控制尺寸，如納米孔中的孔徑、納米纖維或納米管的厚度以及納米顆粒的尺寸[46]（圖6）。各種納米材料通常提供較大的比表面積、體積比和較低的傳質(zhì)阻力，這使得其能夠更好地與酶相互作用，提高效率的同時增強了酶的長期儲存和回收穩(wěn)定性[47]。常見納米材料包括：氧化石墨烯、碳納米管和納米纖維、納米顆粒、納米花等。納米顆粒由于其最小的擴散限制、最大的單位質(zhì)量表面積和高載酶量而被認為是酶固定化的理想載體。

圖6 利用各種納米/微米材料進行酶固定化[46]Fig.6 Enzyme immobilization using various nano/micron materials[46]

Liu 等[48]采用靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維膜來共價固定脂肪酶。納米纖維載體的高孔隙率和互連性使它們具有低的傳質(zhì)障礙，有利于酶的構(gòu)象穩(wěn)定，促進脂肪酶的活力和穩(wěn)定性的提高。Li 等[49]在月桂酸和十二烷醇的酯化過程中，利用Cu3（PO4）2與碳納米管復合成花狀結(jié)構(gòu)來固定化脂肪酶，循環(huán)使用8 次酶活仍較高。因為花狀結(jié)構(gòu)可以提高載體的比表面積，而且碳納米管有利于降低傳質(zhì)阻力，提高酶負荷，并具有廣闊的工業(yè)應用前景。Zheng 等[50]在磁性多壁碳納米管上固定假絲酵母脂肪酶（CLL），結(jié)果表明，與游離酶相比，固定化脂肪酶具有更好的熱穩(wěn)定性、生物催化活性，并且更易于回收利用。I?ik等[51]以電紡納米纖維為載體，將聚乙烯醇（PVA）/Zn2+聚合物包埋在雜化纖維中，通過吸附和交聯(lián)的方法將脂肪酶固定在納米纖維上。結(jié)果顯示，納米纖維提高了脂肪酶的熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性和可重用性。在重復使用14 次后，活性仍保持在90%以上。

4 固定化脂肪酶在食品中的應用

4.1 合成芳香化合物

帶有水果香味的短鏈酯作為芳香劑在食品工業(yè)中廣受歡迎，這些芳香化合物可通過化學合成或從天然來源獲得[52]。風味化合物通常是短鏈脂肪酸和醇類，如類似菠蘿或蘋果口味的丁酸甲酯、丁酸丁酯、異丁酸異戊酯、類似菠蘿或草莓口味的丁酸乙酯、類似香蕉口味的乙酸異戊酯/丁酸異戊酯。固定化脂肪酶在溫和的條件下催化合成天然香料，而且其比化學合成更安全可靠，從而在芳香化合物的合成方面表現(xiàn)出廣泛的應用前景[53]。

Garlapati 等[54]研究了固定化米根霉NRRL3562脂肪酶在無溶劑條件下催化酯化合成丁酸甲酯和乙酸辛酯。考察了醇摩爾比、反應時間、溫度等不同的酯化反應參數(shù)對摩爾轉(zhuǎn)化率（%）的影響。結(jié)果表明，固定化酶對丁酸甲酯和乙酸辛酯的相對活性保持在95%以上，分別達到5 次和6 次，脂肪酶活性較高。Ghamgui 等[55]用非商品化的模擬葡萄球菌固定化脂肪酶在純底物條件下催化乙酸和異戊醇的酯化反應合成乙酸異戊酯（香蕉味），考察了脂肪酶用量、乙酸與異戊醇的摩爾比等反應參數(shù)對反應的影響。結(jié)果表明，乙酸和異戊醇在8 h 內(nèi)轉(zhuǎn)化率可達64%。固定化酶制劑經(jīng)4 次循環(huán)使用后，固定化酶活性未見明顯下降，固定化酶穩(wěn)定性和活性都較高。Matte 等[56]將羊毛熱霉菌脂肪酶（TLL）固定在天然和改性的Immobead 150 上，通過使用乙二胺進行多點共價連接來合成丁酸丁酯和丁酸異戊酯。結(jié)果表明，天然Immobead 150（EMULTI）上的多點共價固定化脂肪酶在70 ℃下的半衰期為5.32 h，比其TLL 溶液的穩(wěn)定性高約30 倍，在丙酮、正己烷和異辛烷中表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性。酯化反應在24 h 內(nèi)酯化率可達60%以上，在所有固定化方法中，EMULI 的熱穩(wěn)定性、溶劑穩(wěn)定性和離子液體穩(wěn)定性都表現(xiàn)最好。

4.2 油脂改性加工

固定化脂肪酶在油脂工業(yè)中有著廣闊的應用前景。主要用于油脂加工，油脂改性在食品加工過程中是非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。固定化脂肪酶優(yōu)于游離酶，因為固定化可以提高酶的穩(wěn)定性和活性。在固定化形式中，酶可以重復使用。固定化方法大多采用非共價相互作用[53]。天然油脂由于支鏈較長、脂肪酸的飽和度不同的弊端，導致穩(wěn)定性較差，利用脂肪酶的位置特異性和脂肪酸特異性[57]，可以作為生物催化劑對油脂進行改性。經(jīng)過脂肪酶改性的油脂，具有更高的營養(yǎng)價值、穩(wěn)定性和品質(zhì)，在食品加工領(lǐng)域具有較大的市場潛力。

Paula 等[58]將商業(yè)非區(qū)域選擇性假絲酵母脂肪酶（Novozym 435）和1,3-區(qū)域選擇性米根霉脂肪酶固定在有機無機聚硅氧烷-聚乙烯醇雜化基質(zhì)中，作為反應器的生物催化劑，通過酶促酯交換反應來調(diào)整乳脂的物理性質(zhì)，獲得了適合工業(yè)生產(chǎn)的健康的酯交換脂肪混合物。Tecel?o 等[59]在60 ℃的無溶劑介質(zhì)中，將三棕櫚素與油酸或ω-3 多不飽和脂肪酸在酶催化酸解條件下合成人乳脂肪（HMFs），對4 種固定化脂肪酶Lipozyme RM IM、Theromyces Lanuginosa脂肪酶、Lipozyme TL IM 和Novozym 435 進行了測試，結(jié)果表明，生物催化劑的活性和操作穩(wěn)定性取決于所使用的?；w。

4.3 提高食品添加劑脂溶性

在食品工業(yè)中異抗壞血酸被作為抗氧化劑廣泛應用，但是由于其親水性較高，很難應用在脂類食品中。利用固定化脂肪酶催化抗壞血酸轉(zhuǎn)化為抗壞血酸酯類物質(zhì)，可以有效提高產(chǎn)物的親脂性，能更好地應用于脂類食品中。

Santibá?ez 等[60]采用不同載體固定化斯氏假單胞菌脂肪酶TL，在有機介質(zhì)中以棕櫚酸和抗壞血酸為原料，酶法酯化合成抗壞血酸棕櫚酸酯，與商業(yè)Novozym 435 脂肪酶進行了性能比較。結(jié)果表明，假單胞菌脂肪酶TL 在55 ℃時轉(zhuǎn)化率達57%，高于商業(yè)Novozym 435 脂肪酶在70 ℃的底物轉(zhuǎn)化率。Sun 等[61]通過固定化脂肪酶將異抗壞血酸轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸棕櫚酸酯，改善了異抗壞血酸在有機介質(zhì)中的油溶性，且轉(zhuǎn)化率較高，產(chǎn)率高達95.32%。湯魯宏等[62]將庚烷和叔戊醇等多種反應媒體和數(shù)種脂肪酶對L-抗壞血酸棕櫚酸酯合成反應的影響進行了研究，結(jié)果表明，叔丁醇適用于酯合成反應，且Novozym 435 脂肪酶具有良好的催化活性。

4.4 合成食品乳化劑糖酯

糖酯是一種非離子表面活性劑，其親水基團為糖基，疏水基團為脂肪酸，同時具有兩親性?？梢杂弥久冈趩我坏拿复俜磻襟E中合成，其基礎(chǔ)是盡可能使用可更新、廉價且容易獲得的原料，糖酯類食品乳化劑因其可被生物降解，對環(huán)境無毒無害，被廣泛應用于食品工業(yè)中[57]。

Zaidan 等[63]通過共價鍵和物理吸附將脂肪酶交聯(lián)到納米反應器（即NER-CRL），將皺紋假絲酵母（CRL）脂肪酶固定化在氨基活化的云母上，來催化合成乳糖酯。結(jié)果表明，NER-CRL 和Amino-CRL 具有較高的操作穩(wěn)定性，半衰期分別超過13 和10 次，比活力比游離酶分別提高了2.4 和2.6 倍。Adnani等[64]模擬木糖醇和硬脂酸的脂肪催化酯化反應，將Novozym 435（大孔樹脂固定化南極假絲酵母脂肪酶）在正己烷中催化合成木糖醇脂肪酸酯。結(jié)果表明，脂肪酸酯實際收率為96.10%。Kapoor 等[65]以南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）的交聯(lián)酶聚集體（CLEAS）為原料，在低水條件下催化甘油與棕櫚酸的酯化反應。結(jié)果表明，反應24 h，轉(zhuǎn)化率可達90.3%，其中單甘酯和雙甘酯的產(chǎn)率分別為87%和3.3%。

4.5 合成類可可脂

可可脂的熔點為37 ℃，具有入口即化的熔融特性，含有棕櫚酸和硬脂酸，是食品工業(yè)中加工巧克力的重要原料。但是天然可可脂的產(chǎn)量較低且價格較為昂貴，因此固定化脂肪酶被用來催化油脂間酯交換生產(chǎn)可可脂替代品，在食品工業(yè)中應用較為廣泛。

Dutt 等[66]用從土壤中分離到的芽孢桿RK-3 菌株來生產(chǎn)1,3-區(qū)域特異性脂肪酶，以棕櫚油和硬脂酸甲酯為原料進行酯交換反應。結(jié)果表明，最終產(chǎn)物與CB 類似，且在24 h 內(nèi)的轉(zhuǎn)化率為83.17%。龔欣等[67]研究了利用固定化脂肪酶 Lipozyme TLIM 催化制備低熱量烏桕類可可脂，發(fā)現(xiàn)在溫度為65 ℃、Aw為0.06、催化時間15.5 h 時，交換率最高為34.9%，產(chǎn)物的SI 值為0.55，熔點為37 ℃，研究表明可以利用烏桕脂制備低熱量的類可可脂。胡芳等[68]用脂肪酶 Lipozyme TLIM 來催化酯交換反應合成類可可脂，結(jié)果類可可脂得率高達85.586%，高級結(jié)構(gòu)分析表明產(chǎn)物中甘油三酯的組成和結(jié)構(gòu)與天然可可脂類似。

5 結(jié)論與展望

將脂肪酶固定化來進行生物催化已經(jīng)成為熱點研究方向，近年來，脂肪酶的固定化技術(shù)在迅速發(fā)展，固定化方法也在不斷地完善，新型的高性能材料和新方法不斷被發(fā)現(xiàn)。固定化技術(shù)可以使酶的穩(wěn)定性和可重復利用率提高，克服了游離酶不易回收且不易與底物分離等缺陷，純化程序更方便、操作成本相對較低，有利于食品加工的工業(yè)化生產(chǎn)。隨著對脂肪酶研究的不斷深入，脂肪酶固定化方面的研究將會有新的突破。利用固定化技術(shù)提高脂肪酶的穩(wěn)定性、酶活力、選擇性以及重復利用率等性能可以使脂肪酶更好地應用于食品加工領(lǐng)域，前景十分廣闊。