孫宏萊，劉 悅，劉德江，李麗麗，N.V.扎依湄科，申 健,*

（1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.中-烏農(nóng)林技術(shù)開(kāi)發(fā)與應(yīng)用國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯 154007；3.烏克蘭國(guó)家科學(xué)院M.M.格里什科國(guó)家植物園，烏克蘭基輔 01014）

隨著全球經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，人們的生活習(xí)慣、膳食方面發(fā)生了巨大的改變，紛至沓來(lái)的是糖尿病等多種慢性疾病發(fā)生率的不斷上升，極大地影響了人們的日常生活，危害了身體的健康[1]。糖尿病是一種由胰島素分泌量降低，生物作用受到損傷所導(dǎo)致的代謝性疾病。Ⅱ型糖尿病患者不可能被徹底治愈，生活中，飲食的控制、身體鍛煉的加強(qiáng)、防止相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生與惡化是控制這類(lèi)病人的病情發(fā)展的基本方式[2]。而蛋白尿、血尿等正是糖尿病并發(fā)癥的一種主要臨床特征，其發(fā)病機(jī)制與糖代謝紊亂、血脂異常和細(xì)胞因子表達(dá)異常等多種因素密切相關(guān)[3]。近年來(lái)研究表明，腎小球細(xì)胞炎癥因子的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腎小球血管及濾過(guò)膜通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致尿蛋白滲出增加，加劇糖尿病病理進(jìn)展[4]。因此對(duì)于糖尿病患者腎臟的保護(hù)也成為了輔助治療手段的一種。

目前，臨床上使用的一些降糖類(lèi)藥物雖然能改善Ⅱ型糖尿病患者的健康狀況，但都會(huì)產(chǎn)生低血糖、胃腸道疾病及心腦血管疾病等不同的不良反應(yīng)及毒副作用[5?6]。因此，天然的降糖活性物質(zhì)的研究開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)問(wèn)題成為了主要研究熱點(diǎn)之一。查閱大量文獻(xiàn)可知，從植物中提取出的多糖具有良好的降糖作用，這與加強(qiáng)機(jī)體抗氧化活性、降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷存在著密切的關(guān)系，如黨參多糖、黃芪多糖等[7?8]。因此，從植物中提取天然多糖并研究開(kāi)發(fā)出無(wú)不良反應(yīng)或毒副作用小的降糖類(lèi)藥物已經(jīng)成為了主要的發(fā)展趨勢(shì)。

毛水蘇（Stachys baicalensisFisch. ex Benth.）是唇形科水蘇屬多年生草本植物，喜歡生長(zhǎng)于濕潤(rùn)、微酸的肥沃土壤，原產(chǎn)于巴爾干半島、黑海沿岸至西亞，主要分布于我國(guó)東北三省、內(nèi)蒙、山東、陜西等濕地地區(qū)，具有祛風(fēng)解毒，止血之功效，可全株入藥，但目前針對(duì)其多糖等藥理活性成分的研究未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道[9?10]。本實(shí)驗(yàn)采用STZ 低劑量腹腔注射結(jié)合喂養(yǎng)高脂高糖飼料創(chuàng)建Ⅱ型糖尿病小鼠模型。通過(guò)研究毛水蘇多糖（polysaccharides fromStachys baicalensis,SBP）對(duì)糖尿病小鼠的生活狀態(tài)、體重、血糖、腎臟指數(shù)與腎臟功能的影響，檢測(cè)腎臟組織中的抗氧化指標(biāo)，觀察腎臟病理，以及測(cè)定腎臟組織中炎癥因子mRNA 的表達(dá)水平，對(duì)毛水蘇多糖在糖尿病患者腎臟的防治過(guò)程中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明小鼠SCXK（吉）-2020-0002 延邊大學(xué)；高糖高脂飼料 北京博愛(ài)港生物技術(shù)有限公司；丙二醛測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；毛水蘇采于佳木斯大學(xué)農(nóng)林實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地（46°46′58″N,130°21′6″E）；Animal Total RNA Isolation Kit Cat.No.RE-03011/03014，成都福際生物技術(shù)有限公司 ；2×F8 FastLong PCR Master Mix 北京艾德萊生物科技有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Code No.RR047A，TaKaRa ；SYBR Green qPCR Mix（with Rox） Cat. No P2091a，東盛生物科技有限公司 ；檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸二甲雙胍緩釋片 北京博愛(ài)港生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鏈脲佐菌素Sigma；氯化鈉注射液 吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司。

臺(tái)式高速冷凍微量離心機(jī) Sigma；GA-3 型血糖儀、血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司；TDZ4-WS 低速臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；XDS-18 倒置顯微鏡 北京榮興光恒科技有限公司；FA2004 電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀 Bio Tek；HWS-250B恒溫恒濕箱 天津市泰斯特儀器有限公司；NanoDrop One Thermo Scientific；梯度PCR 儀 Eppendorf；LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 羅氏；?80 ℃超低溫冰箱 Thermo Scientific USA；微量移液器

Eppendorf；DYY-12 型電泳儀 北京六一。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SBP 的提取 在錐形瓶中加入3.00 g 烘干后的毛水蘇粉末，按22:1 mL/g 的液料比加入蒸餾水，超聲輔助提?。?2 min，350 W，70 ℃）的溶液冷卻至室溫，3500 r/min 條件下離心15 min，保留上清液，進(jìn)行抽濾，將得到的濾液減壓濃縮，定容至10 mL，按1:4 的比例加入無(wú)水乙醇，4 ℃冰箱醇沉24 h，醇沉液離心（3500 r/min，15 min），保留沉淀物，并將沉淀加蒸餾水溶解，再次減壓濃縮，冷凍干燥得到粗多糖粉末。稱(chēng)取適量的凍干粉末，加入一定的蒸餾水溶解，采用AB-8 大孔樹(shù)脂脫除色素，5%三氯乙酸脫除蛋白，使用3500 目透析袋除鹽，將得到的去雜溶液減壓濃縮，經(jīng)DEAE-52 纖維素層析柱分離得4 組分，取含量占比最高組分為樣品（多糖純度70.50%），凍干備用[11?12]。

1.2.2 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 挑選體重在（20±2）g 范圍內(nèi)的清潔級(jí)昆明小鼠，隨機(jī)平均分為7 組，每組10 只，共計(jì)70 只，均為雄性。將小鼠于恒定溫度18～22 ℃和濕度50%～60%的環(huán)境下飼養(yǎng)，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)抽取其中一組用普通飼料喂養(yǎng)，為空白組。其余6 組改用高脂高糖飼料持續(xù)喂養(yǎng)，每7 d 對(duì)小鼠的體重進(jìn)行一次測(cè)量并每天更換墊料，4 周后，小鼠禁食12 h 后，使用STZ 溶液對(duì)小鼠迅速進(jìn)行腹腔注射，注射劑量為80 mg/kg，注射后死亡率為4.29%?？瞻捉M小鼠注射相同劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，恢復(fù)小鼠飲食，空白組小鼠喂食普通飼料，其余6 組小鼠喂養(yǎng)高脂高糖飼料維持血糖，腹腔注射結(jié)束72 h 后，對(duì)小鼠做禁食12 h 處理后，斷尾取尾靜脈血用于測(cè)定小鼠空腹血糖值。以11 mmol/L 作為臨界值，當(dāng)測(cè)定的血糖值大于此數(shù)值時(shí)，則認(rèn)定為成功創(chuàng)建Ⅱ型糖尿病小鼠模型[8]。造模完成后，取造模成功小鼠50 只，將其隨機(jī)分為5 個(gè)組，每組10 只，分別為模型、多糖低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組?？瞻捉M和模型組小鼠每天灌胃0.1 mL/10 g 蒸餾水，多糖組小鼠按低、中、高順序每天分別用SBP 灌胃50、100、200 mg/kg，陽(yáng)性組小鼠每天用200 mg/kg 二甲雙胍進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃28 d。除空白組小鼠一直用普通飼料喂養(yǎng)，其他組小鼠從開(kāi)始造模至試驗(yàn)結(jié)束，以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，保證維持小鼠高血糖癥狀[13?15]。

1.2.3 糖尿病小鼠體重與血糖的測(cè)定 每天給藥前先記錄小鼠死亡情況，觀察并記錄毛發(fā)、氣味、精神狀況及“三多一少”狀，造模成功后，每周稱(chēng)量一次小鼠體重。給藥后每7 d 取小鼠尾靜脈血一次，用于測(cè)定小鼠空腹血糖值，測(cè)定前小鼠做禁食12 h 處理，連續(xù)測(cè)量4 次。

1.2.4 腎功能指標(biāo)的測(cè)定 灌胃28 d 后，末次給藥24 h 后，無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行脊椎脫臼處死，用酒精球擦拭小鼠腹部，手術(shù)剪開(kāi)腹，腹腔主動(dòng)脈取血0.5 mL，3500 r/min 離心15 min，取上清液，分離血清，注明標(biāo)簽于?20 ℃保存[16]。試驗(yàn)結(jié)束后，按照血液分析儀操作規(guī)程，測(cè)定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿蛋白含量。

1.2.5 腎臟指數(shù)的測(cè)定 小鼠處死取腹主動(dòng)脈血后，解剖小鼠觀察腎臟情況，并摘取小鼠雙側(cè)腎臟，用生理鹽水沖洗粘連組織，濾紙吸干血水，將雙腎筋膜剝離后稱(chēng)濕重，按以下公式計(jì)算腎臟指數(shù)。取兩部分組織分別浸泡在4%福爾馬林固定液中和冰浴的生理鹽水溶液中保存待用，進(jìn)行腎臟組織病理學(xué)檢測(cè)和抗氧化酶活力的測(cè)定。

式中，N 為腎臟指數(shù)；m0為腎臟重量，g；m 為小鼠體重，g。

1.2.6 腎臟抗氧化酶活力的測(cè)定 剪取生理鹽水溶液中的腎臟組織0.2 g，加入1.5 mL 預(yù)冷的生理鹽水，冰浴下充分研磨，勻漿，3000 r/min 離心15 min，取上清液，迅速轉(zhuǎn)移到新的離心管中，分離出組織勻漿注明標(biāo)簽，置于?20 ℃保存待測(cè)。試驗(yàn)結(jié)束后，按檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力、過(guò)氧化氫酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）的含量。

1.2.7 組織病理學(xué)觀察 固定液中的腎臟組織經(jīng)脫水，石蠟包埋，制片，HE 染色（蘇木素-伊紅染色）后，在電子顯微鏡下觀察各組小鼠組織形態(tài)學(xué)差異。

1.2.8 qRT-PCR 法檢測(cè)腎臟組織中VCAM-1、IL-1β及IL-6 的mRNA 水平 取腎臟組織20 mg 在液氮中研磨，Animal Total RNA Isolation Kit 試劑盒提取總RNA。使用Nanodrop 2000 檢測(cè)RNA 濃度及純度。取適量RNA 溶液按照2×F8 FastLong PCRMasterMix試劑盒合成cDNA 第一鏈。對(duì)cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，并以GAPDH 為內(nèi)參。PCR 循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火并延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線(xiàn)65 ℃到95 ℃，每15 s 升溫0.3 ℃。

引物使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成，見(jiàn)表1。所得數(shù)據(jù)采用2?△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of fluorescent quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)（average）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）形式表示，采用SPSS 16.0 軟件分析所得數(shù)據(jù)，P<0.05 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠外觀形態(tài)的觀察

在試驗(yàn)期間每天觀察小鼠狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)空白組小鼠進(jìn)食、飲水及排尿量基本正常，活潑好動(dòng)，毛色潔白鮮亮且順滑，體重持續(xù)增長(zhǎng)并且增長(zhǎng)較快，墊料更換時(shí)基本無(wú)異味；模型組小鼠體重持續(xù)下降，毛色粗糙、暗淡且有泛黃的表現(xiàn)，精神狀態(tài)萎靡，攝食量、進(jìn)水量及排尿量增加，典型的“三多一少”癥狀，墊料異味加重。與模型組相比較，SBP 高、中、低劑量組及二甲雙胍組治療，小鼠狀態(tài)均有所改善。

2.2 SBP 對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

體重變化是評(píng)價(jià)是否患糖尿病指標(biāo)之一，它能直觀的反應(yīng)出能量攝入與消耗之間的動(dòng)態(tài)變化。造模成功后，小鼠體重均無(wú)明顯差異，將給藥7、14、21、28 d 的體重列于表2。由表中數(shù)據(jù)可知：給藥期間，空白組食用常規(guī)飼料，體重漲幅均在正常變化范圍內(nèi)，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組食用高脂高糖飼料結(jié)合STZ 注射破壞體內(nèi)激素水平，致使小鼠體重均顯著低于空白組（P<0.05）；與模型組小鼠相比，給藥組小鼠體重逐漸上升，但仍低于空白組，說(shuō)明SBP 對(duì)糖尿病小鼠體重減輕狀況有所改善。結(jié)束給藥后，與灌胃初期（7 d）相比SBP 低、中、高劑量及陽(yáng)性組體重分別提升了19.85%、23.98%、30.52%、33.48%，其中，高劑量組小鼠體重與陽(yáng)性組小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明SBP 高劑量組在改善糖尿病小鼠體重方面與二甲雙胍陽(yáng)性組效果相當(dāng)。

表2 SBP 對(duì)糖尿病小鼠體重的影響（g, ±s，n=10）Table 2 Effect of SBP on body weight of diabetic mice（g, ±s, n=10）

表2 SBP 對(duì)糖尿病小鼠體重的影響（g, ±s，n=10）Table 2 Effect of SBP on body weight of diabetic mice（g, ±s, n=10）

注：與空白組相比，*：P<0.05；與模型組相比，#：P<0.05；與陽(yáng)性組相比，▲：P>0.05；表3～表6同。

分組 0 d 7 d 14 d 21 d 28 d空白組 45.34±0.34 48.67±0.76 52.17±0.58 55.33±1.04 60.00±1.50模型組 46.09±0.61 43.33±1.26* 40.00±0.50* 36.33±1.04* 33.00±0.50*低劑量組 45.11±0.14 42.83±0.76* 45.50±1.00* 49.67±0.76*#▲ 51.33±1.04*#中劑量組 47.02±0.52 44.50±0.87* 48.00±0.50*#▲ 50.33±1.04*#▲ 55.17±0.76*#高劑量組 46.34±0.39 43.67±1.04* 48.00±0.50*#▲ 50.50±1.32*#▲ 57.00±0.50*#▲陽(yáng)性組 45.92±0.58 42.83±2.24* 47.50±1.00*# 49.50±1.50*# 57.17±0.58*#

2.3 SBP 對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響

根據(jù)每周對(duì)小鼠空腹血糖的監(jiān)測(cè)，如表3 可知，模型組小鼠血糖明顯高于空白組，存在顯著性差異（P<0.05），且一直維持高血糖水平，說(shuō)明高糖高脂飼料結(jié)合低劑量STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型成功。給藥期間，高劑量組和陽(yáng)性組的降血糖效果明顯優(yōu)于低、中劑量組，且給藥組小鼠血糖持續(xù)降低，說(shuō)明多糖對(duì)糖尿病小鼠有降血糖作用且較穩(wěn)定，無(wú)自我恢復(fù)現(xiàn)象。在結(jié)束給藥后，高劑量組血糖水平的調(diào)節(jié)效果已經(jīng)較為明顯并接近于陽(yáng)性組，與模型組相比SBP 低、中、高劑量及陽(yáng)性組分別降低了18.76%、23.17%、43.31%、49.92%，其中，高劑量組小鼠血糖值和陽(yáng)性組血糖值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明SBP 高劑量組在治療糖尿病小鼠體內(nèi)激素紊亂現(xiàn)象具有一定的調(diào)節(jié)作用，其治療效果與二甲雙胍陽(yáng)性組相當(dāng)。

表3 SBP 對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響（mmol/L, ±s，n=10）Table 3 Effect of SBP on fasting blood glucose of diabetic mice（mmol/L, ±s, n=10）

表3 SBP 對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響（mmol/L, ±s，n=10）Table 3 Effect of SBP on fasting blood glucose of diabetic mice（mmol/L, ±s, n=10）

分組 7 d 14 d 21 d 28 d空白組 5.28±0.14 5.87±0.08 5.40±0.25 5.64±0.25模型組 23.38±1.16* 26.70±0.74* 28.17±0.76* 29.64±0.60*低劑量組 24.89±1.42* 23.16±2.02*# 22.03±0.39*# 20.22±0.39*#中劑量組 24.69±4.12* 23.04±1.50*# 19.90±0.61*# 18.97±0.59*#高劑量組 23.60±2.57* 22.52±1.51*# 19.05±0.96*#▲ 13.38±1.26*#▲陽(yáng)性組 25.16±1.25* 22.74±1.55*# 18.08±1.58*# 12.60±2.29*#

2.4 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟功能的影響

肌酸在體內(nèi)進(jìn)行代謝分解，其產(chǎn)物主要就是血肌酐（Scr），蛋白質(zhì)在體內(nèi)進(jìn)行分解代謝后的末端產(chǎn)物即為尿素氮（BUN）。目前，臨床上一般將Scr 和BUN 作為腎衰竭的常用檢測(cè)項(xiàng)目。通常情況下健康的生物體的尿液中是不能夠檢測(cè)出蛋白質(zhì)，對(duì)人類(lèi)而言，一旦在尿常規(guī)中檢測(cè)出小分子蛋白，那么就可以初步判定該患者腎臟濾過(guò)功能不完全。本試驗(yàn)將解剖時(shí)所取的腹主動(dòng)脈血經(jīng)血液分析儀檢測(cè)，從而間接地反映出糖尿病小鼠腎功能情況。由表4 可知，與空白組相比，模型組、SBP 低、中、高劑量組及陽(yáng)性組小鼠的Scr、BUN 和尿蛋白含量均顯著升高（P<0.05），說(shuō)明糖尿病小鼠的腎功能均表現(xiàn)出損傷情況。但經(jīng)SBP 灌胃治療28 d 后，SBP 低、中、高劑量組的Scr 較模型組相比均存在有下降趨勢(shì)（P<0.05），且隨著SBP 濃度的增加，下降幅度越大；SBP 低、中、高劑量組中的高劑量組BUN 下降趨勢(shì)最為明顯，且藥效與陽(yáng)性組接近，二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；此外，數(shù)據(jù)顯示，糖尿病小鼠在進(jìn)行SBP 治療后，較模型組而言，尿蛋白含量均顯著降低，且隨著SBP 濃度的增加，尿蛋白含量呈遞減趨勢(shì)。

表4 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎功能的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of SBP on kidney function of diabetic mice（±s, n=10）

表4 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎功能的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of SBP on kidney function of diabetic mice（±s, n=10）

分組 Scr（μmol/L） BUN（mmol/L） 尿蛋白（g/μmol）空白組 45.54±1.11 8.06±0.33 0.81±0.02模型組 88.85±0.49* 18.75±0.35* 12.54±0.86*低劑量組 71.87±1.68*# 17.62±0.55*# 8.40±0.24*#中劑量組 61.12±0.98*# 16.74±0.52*# 7.70±0.48*#高劑量組 56.55±0.52*# 14.05±0.81*#▲ 6.69±0.49*#陽(yáng)性組 51.15±1.51*# 13.96±0.76*# 4.48±0.47*#

2.5 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的影響

糖尿病患者的腎臟損傷是常見(jiàn)的高血糖慢性并發(fā)癥之一，由于體內(nèi)激素分泌紊亂，致使腎臟負(fù)擔(dān)加重，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致腎臟損傷或者腫大等現(xiàn)象的發(fā)生。將計(jì)算后的腎臟指數(shù)列于下表，由表5 數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠腎臟指數(shù)顯著增加（P<0.05），說(shuō)明STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟功能存在一定損傷。與模型組相比，SBP 低、中、高劑量及陽(yáng)性組的腎臟指數(shù)均顯著下降（P<0.05），分別降低了6.01%、15.74%、20.37%、24.07%，表明SBP 對(duì)于糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的改善效果存在量效關(guān)系，且SBP 高劑量組與陽(yáng)性組的腎臟指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表5 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of SBP on the viscera index of diabetic mice（±s, n=10）

表5 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of SBP on the viscera index of diabetic mice（±s, n=10）

分組 腎臟指數(shù)（%）空白組 1.60±0.03模型組 2.16±0.06*低劑量組 2.03±0.11*中劑量組 1.82±0.04*#高劑量組 1.72±0.03*#▲陽(yáng)性組 1.64±0.04#

2.6 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織抗氧化能力的影響

超氧酸氫酶（SOD）是一種防止機(jī)體體內(nèi)氧化的重要金屬酶。它是唯一一個(gè)將超氧陰離子作為反應(yīng)底物的酶。讓超氧陰離子直接分解成水和氧，阻礙過(guò)氧化脂質(zhì)的生產(chǎn)，能夠減少對(duì)機(jī)體的傷害，使機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)[17?19]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）是一種廣泛存在于身體中的分解酶，分解過(guò)氧化物（有毒）轉(zhuǎn)化生成為羥基化合物（無(wú)毒），促進(jìn)過(guò)氧化氫的分解，進(jìn)而促使過(guò)氧化物無(wú)法損壞細(xì)胞膜的功能及構(gòu)造[20?21]。過(guò)氧化氫酶（CAT）是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫分解的酶。為了保護(hù)防止過(guò)氧化氫破壞抗氧化酵素系統(tǒng)的功能，不產(chǎn)生有的氫氧自由基，在機(jī)體部分組織中廣泛存在于紅細(xì)胞和過(guò)氧化體中[22?23]。由表6中數(shù)據(jù)可知，成功建立模型后，與空白組相比，模型組小鼠腎臟組織的SOD、GSH-Px 和CAT 含量均迅速下降，分別下降了49.12%、51.29%和55.06%（P<0.05）。給藥后，給藥組小鼠的SOD、GSH-Px、CAT 含量均有所上升，且隨濃度的增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，與模型組相比，SBP 高劑量組SOD、GSH-Px 和CAT 含量分別上升了45.59%、52.99%和50.24%（P<0.05），其中CAT 含量變化與陽(yáng)性組接近，二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明SBP 能改善糖尿病小鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px 和CAT 活力下降的癥狀，且其中對(duì)于CAT 活力的改善效果SBP 高劑量組等同于陽(yáng)性組。

表6 SBP 對(duì)糖尿病小鼠抗氧化指標(biāo)的影響（±s，n=10）Table 6 Effect of SBP on antioxidant indicators of diabetic mice（±s, n=10）

表6 SBP 對(duì)糖尿病小鼠抗氧化指標(biāo)的影響（±s，n=10）Table 6 Effect of SBP on antioxidant indicators of diabetic mice（±s, n=10）

分組 SOD（U/mg） GSH-Px（U/mg） CAT（U/mg） MDA（nmol/mg）空白組 26.61±0.74 1314.51±78.78 45.66±0.45 1.22±0.10模型組 13.54±0.53* 640.35±65.94* 20.52±0.97* 3.04±0.10*低劑量組 15.91±0.93*# 801.05±25.29*# 26.62±0.76*# 2.89±0.05*中劑量組 18.70±0.49*# 878.43±35.11*# 27.75±0.80*# 2.18±0.08*#高量組 19.70±0.59*# 979.65±40.74*# 30.83±0.34*#▲ 1.95±0.05*#陽(yáng)性組 21.92±0.75*# 1151.82±58.35*# 30.66±0.41*# 1.56±0.17*#

丙二醛（MDA）是人體脂質(zhì)過(guò)氧化傷害的重要標(biāo)志，其含量降低可提高機(jī)體抗氧化能力[24?25]。由下表數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠腎臟組織的MDA 含量迅速升高（P<0.05），說(shuō)明模型組小鼠處于脂質(zhì)過(guò)氧化現(xiàn)象。給藥結(jié)束后，與模型組相比，SBP 低、中、高劑量組及陽(yáng)性組MDA 含量均顯著下降（P<0.05），說(shuō)明SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織中的MDA 具有一定程度的抑制作用，且隨著濃度的增高，效果更加明顯。

2.7 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織影響的病理學(xué)觀察

為了更加直觀檢驗(yàn)糖尿病小鼠的腎臟存在的損傷情況，驗(yàn)證SBP 可以有效緩解糖尿病小鼠的腎臟損傷情況，在給藥28 d 后，將各組小鼠的腎臟組織切片經(jīng)HE 染色后，結(jié)果如圖1 所示。從圖中可以看出，空白組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰正常，外形細(xì)胞規(guī)則飽滿(mǎn)，血管充盈，腎小管形態(tài)、管腔正常，腎間質(zhì)清晰可見(jiàn)，細(xì)胞核排列緊密均勻較為圓滿(mǎn)。與空白組相比，模型組腎臟結(jié)構(gòu)、腎小球結(jié)構(gòu)不清晰且被破壞，組織出現(xiàn)病變情況，外形細(xì)胞形狀不規(guī)則且分布不均勻，內(nèi)部浸潤(rùn)著大量的炎性細(xì)胞，腎小管形態(tài)畸變腫脹肥大、管腔被擠壓或撕扯，腎間質(zhì)模糊，纖維

圖1 各組小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察（HE100×）Fig.1 Histopathology of renal hetle in mice of each group（HE100×）

化程度高，細(xì)胞核排列雜亂無(wú)章，且形狀多為橢圓形，個(gè)別為扁狀形態(tài)，細(xì)胞核多為空核狀態(tài)，個(gè)別出現(xiàn)溶解、破碎情況。與模型組相比，SBP 各劑量組糖尿病小鼠的腎臟病變情況有所改善，其中高劑量組治療效果較為明顯，腎小球形狀有所緩解，形狀較為規(guī)則清晰，腎間質(zhì)纖維程度與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況稍有改善，腎小管形態(tài)和管腔孔道有所恢復(fù)，細(xì)胞核形態(tài)也在逐步恢復(fù)，發(fā)生溶解和破碎數(shù)量較少，表明SBP 高劑量組對(duì)腎臟組織損傷具有一定的改善作用。

2.8 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織炎癥反應(yīng)的抑制作用

糖代謝的障礙紊亂可能會(huì)引起一系列病理學(xué)變化，其中炎癥反應(yīng)與腎小球硬化癥的發(fā)生密切相關(guān)，是促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)病和發(fā)展的重要機(jī)制之一[26?27]。藥理學(xué)研究表明，微炎癥是初期糖尿病腎癥病理學(xué)變化的特點(diǎn)之一。因此，靶向炎癥反應(yīng)是用于抑制糖尿病腎病惡化的一項(xiàng)有力手段。VCAM-1 是通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)和纖維化而參與糖尿病腎病發(fā)病的一種重要血管細(xì)胞粘結(jié)分子，其水平與患者的尿蛋白和浸潤(rùn)細(xì)胞的數(shù)量存在著密切的關(guān)系，可以用于患者的臨床評(píng)價(jià)[28?29]。IL-1β及IL-6 可以改變血管通透性，增加了趨化蛋白因子的表達(dá)，導(dǎo)致腎小球膜細(xì)胞外基質(zhì)部分的增殖和合成。是誘發(fā)血管病變的關(guān)鍵炎癥因子之一[30?31]。由圖2 可知，與空白組相比，模型組小鼠中VCAM-1、IL-1β及IL-6 的mRNA 水平顯著升高（P<0.05），SBP 高劑量干預(yù)能夠有效抑制糖尿病小鼠VCAM-1、IL-1β及IL-6 的mRNA 水平（P<0.05）。

圖2 SBP 對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織中VCAM-1、IL-1β 和IL-6mRNA 表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of SBP on mRNA levels of VCAM-1,IL-1β and IL-6 of in kidney of diabetic mice

3 討論與結(jié)論

采用STZ 低劑量腹腔注射結(jié)合喂養(yǎng)高脂高糖飼料建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，研究了毛水蘇多糖對(duì)糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用。結(jié)果表明，在高脂高糖的飼養(yǎng)條件下，小鼠出現(xiàn)體重減輕、血糖升高、腎臟器官腫脹、腎功能以及腎臟結(jié)構(gòu)損傷等癥狀。經(jīng)過(guò)毛水蘇多糖28 d 灌胃干預(yù)后，可顯著降低糖尿病小鼠的血糖和腎臟指數(shù)（P<0.05），改善小鼠體重下降的情況，使小鼠的精神狀態(tài)趨于正常。與模型組相比，高劑量組的毛水蘇多糖降低了小鼠體內(nèi)血肌酐、尿素氮含量，緩解糖尿病尿糖、尿蛋白等癥狀的發(fā)生，修復(fù)腎臟的腫大和損傷，緩解腎臟組織發(fā)生的病理學(xué)改變，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)而造成的腎小球畸變和細(xì)胞核空核、腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊混亂等癥狀都有所改善。

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毛水蘇多糖能夠顯著改善糖尿病小鼠的抗氧化能力減弱癥狀（P<0.05）。較空白組而言，模型組小鼠腎臟組織的抗氧化酶活力系統(tǒng)中SOD、GSH-Px 和CAT 活力均下降，MDA 含量上升。但在毛水蘇多糖各劑量組連續(xù)灌胃干預(yù)28 d后，小鼠腎臟組織的抗氧化酶活力系統(tǒng)中SOD、GSHPx 和CAT 活力有所回升，MDA 含量較模型組也明顯降低。因此，可以初步判定毛水蘇多糖對(duì)糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)可能與抗氧化損傷有關(guān)。毛水蘇多糖高劑量組的效果最為明顯，雖與空白組水平仍存在一定差距，但從總體上分析可以得出，毛水蘇多糖確實(shí)具有增強(qiáng)小鼠抵抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的能力，有效抑制機(jī)體過(guò)氧化和脂質(zhì)過(guò)氧化情況的發(fā)生。并且從檢測(cè)的VCAM-1、IL-1β及IL-6 的mRNA 水平中可以看出毛水蘇多糖具有調(diào)節(jié)糖尿病小鼠腎臟組織的炎癥作用，本實(shí)驗(yàn)以與糖尿病患者腎臟惡化的相關(guān)炎癥因子VCAM-1、IL-1β及IL-6 為指標(biāo)，評(píng)價(jià)了毛水蘇多糖對(duì)改善腎臟炎癥損傷的效果，發(fā)現(xiàn)毛水蘇多糖高劑量組能夠調(diào)節(jié)炎癥因子，明顯降低其mRNA 的表達(dá)水平，進(jìn)而間接性的抑制糖尿病腎臟組織的損傷。

綜上所述，毛水蘇多糖具有明確的降血糖活性，能夠明顯改善糖尿病小鼠的腎臟損傷情況。其保護(hù)機(jī)制可能與下調(diào)VCAM-1、IL-1β及IL-6 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，上調(diào)SOD、GSH-Px、CAT 并下調(diào)MDA 抗氧化通路減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，但由于所用多糖成分為粗提物，其重復(fù)性、穩(wěn)定性尚未可知，雖然經(jīng)歷了除雜的過(guò)程但仍然是一種復(fù)合物，其確切機(jī)制、藥物的具體作用成分以及作用靶點(diǎn)尚不明確，因此有待進(jìn)行更深一步研究。