王 琪，徐文娟，石盼盼

（1.鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，河南鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450000）

食品安全問題是全世界人們共同關(guān)注的公共衛(wèi)生安全問題。近年來，由微生物引起的食源性疾病在食品安全事故中的比例不斷上升，對人類健康和生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E.coli, EHEC）是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病原體，主要通過受污染的食物傳播，如牛肉、奶制品、蔬菜和水果[2]，極易對人們的身體健康造成巨大危害。自1982 年在美國首次被分離出來，并被認(rèn)為是一種新型的腸道致病菌[3]，美國又發(fā)生了多起該病的暴發(fā)流行[4?5]。我國也受到腸出血性大腸桿菌O157:H7 的感染威脅，江蘇、安徽省于1999 年暴發(fā)流行腸出血性大腸桿菌O157:H7 感染性腹瀉，流行時(shí)間7 個(gè)月，患者超過2 萬例，死亡177 例[6]。腸出血性大腸桿菌引起散發(fā)性或暴發(fā)性出血性結(jié)腸炎的血清型主要為O157:H7，可產(chǎn)生志賀氏毒素樣細(xì)胞毒素[7]，可引起出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒癥綜合征和血小板減少性紫癜等[8]，嚴(yán)重者還可能導(dǎo)致死亡。

目前對腸出血性大腸桿菌 O157:H7 的檢測通常采用常規(guī)增菌培養(yǎng)、自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫檢測方法（ELISA）、免疫磁珠捕獲法、噬菌體分型技術(shù)、單重及多重PCR 快速檢測法等[9?12]。傳統(tǒng)檢測方法《GB 4789.36-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157:H7/NM 檢驗(yàn)》[13]中的常規(guī)培養(yǎng)法和免疫磁珠捕獲法應(yīng)用最為廣泛。該方法中常規(guī)培養(yǎng)法主要靠不發(fā)酵山梨醇、不發(fā)酵鼠李糖、不分解MUG（4-甲基傘形花內(nèi)酯-β--D-葡萄糖醛酸苷）的生化特性進(jìn)行血清學(xué)生化檢測試驗(yàn)，但是其做法繁瑣，檢出效率低，需要培養(yǎng)的時(shí)間長，需6～8 d 才能得到檢出結(jié)果，而且需有有一定的專業(yè)技術(shù)人員才能動(dòng)手操作。免疫磁珠技術(shù)利用了經(jīng)過修飾的磁性微球作為載體，它能對目標(biāo)物進(jìn)行捕獲及富集[14]。免疫磁珠捕獲法可重復(fù)性好、效率高、分離速度快，不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功能，但是國內(nèi)生產(chǎn)的磁珠在敏感性等方面還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，而進(jìn)口的免疫磁珠性能上更好，但是價(jià)格昂貴。這些方法工序繁瑣、檢測周期長、檢測靈敏度不高，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)使得假陽性率較高[15]，并不適合適合食藥監(jiān)及基層檢驗(yàn)部門推廣普及。因此，建立一種快速準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡單的檢測腸出血性大腸桿菌 O157:H7 的方法，對食品安全監(jiān)控有著重要意義。

等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)（Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification，IMSA）作為一種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)在食藥監(jiān)和基層檢測機(jī)構(gòu)中應(yīng)用較少，在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較多，如張夢等將其應(yīng)用到結(jié)核分枝桿菌的檢測，提高了陽性檢出率[16]。該技術(shù)是由馬學(xué)軍[17]、丁雄[18]等2015 年公開發(fā)明，其擴(kuò)增反應(yīng)是在等溫（60～65 ℃）條件下進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間在30～60 min 內(nèi)，產(chǎn)物濃度大于500 ng/μL，核酸產(chǎn)量比PCR 高100 余倍[19]。在引物設(shè)計(jì)上，IMSA 技術(shù)針對目標(biāo)基因設(shè)計(jì)6 條IMSA引物，6 條引物特異性地識別7 個(gè)位點(diǎn)，特異性更強(qiáng)、靈敏度更高[20?21]，并且靈敏度以及特異性受到廣泛認(rèn)可[22]。同時(shí)在反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控靶基因的擴(kuò)增情況，避免了人工判斷結(jié)果時(shí)主觀因素的影響。IMSA 技術(shù)作為一種新型的分子生物學(xué)檢測方法，不僅具有操作步驟簡單、檢測速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，還具有成本低、專業(yè)檢測能力要求低、耗時(shí)短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，適宜在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)普及和檢測應(yīng)用。IMSA 技術(shù)是我國自己開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一種新型的體外核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，并已申報(bào)了國家專利[22]（申請專利號為CN201310370202.0）。該技術(shù)一定程度上打破了日本環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)專利在我國的應(yīng)用限制，使等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)更好地服務(wù)于我國的食源性致病菌的防控、食品安全檢測等各個(gè)領(lǐng)域。

本研究針對腸出血性大腸桿菌O157:H7 特異性基因rfbE基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)一套IMSA 引物，建立EHEC O157:H7 的IMSA 檢測方法，實(shí)現(xiàn)對食源性EHEC O157:H7 的快速檢測，驗(yàn)證其靈敏度和特異性，并將該方法應(yīng)用于實(shí)際食品樣本的檢測。該方法相比較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，免去了高昂的成本，降低了操作難度以及對檢測人員的技術(shù)要求，為食藥監(jiān)及基層檢驗(yàn)部門快速檢測食品中EHEC O157:H7 提供有力的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157:H7 等20 株菌種 ATCC、CICC 菌種保藏管理中心（表1）；肉及肉制品樣品包括肥牛卷1、肥牛卷2、肥牛卷3、烏雞卷1、烏雞卷2、烏雞卷3、羊肉卷1、羊肉卷2、羊肉卷3、牛排1、牛排2、牛排3、牛肉火腿腸1、牛肉火腿腸2、牛肉火腿腸3、醬鹵牛肉1、醬鹵牛肉2、醬鹵牛肉3、生牛肉1、生牛肉2、生牛肉3、牛肉干1、牛肉干2、牛肉干3 附近大型超市；細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒、腸出血性大腸桿菌O157:H7 核酸檢測試劑盒（PCR 熒光探針法） 廣州迪澳生物科技有限公司；PCR SuperMix Buffer、Bst 聚 合 酶、熒 光 染 料SYTO-9 紐英倫生物（北京）有限公司；改良EC 肉湯（mEC+n）、改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）、大腸埃希氏菌O157 顯色培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基、HBI O157 菌生化鑒定條（GB） 青島海博生物科技有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株信息Table 1 The tested strains

CFX96 Touch 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測儀 美國伯樂公司；LED 數(shù)顯加熱金屬浴 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；CT15RE 高速冷凍離心機(jī) 日本日立HITACHI 公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genebank 發(fā)表的大腸桿菌O157:H7rfbE基因序列（Genbank S83460），利用在線設(shè)計(jì)軟件（http://primerexplorer.jp/e/index.html）設(shè)計(jì)之后手動(dòng)修飾出一套IMSA 特異性引物[23]（見表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.2 預(yù)增菌 在無菌環(huán)境中，無菌操作稱取25 g食品樣本，置于盛有225 mL 改良EC 肉湯（mEC+n）的無菌均質(zhì)袋中；將大腸桿菌O157:H7 純菌培養(yǎng)液稀釋成102、101、100、10?1CFU/mL，分別取1 mL 培養(yǎng)液加到上述無菌均質(zhì)袋中，以1000 r/min 均質(zhì)1～2 min，36 ℃培養(yǎng)，在第8、10、12 h 時(shí)各取1mL 增菌液加到1.5 mL 無菌離心管中待用[24]。

1.2.3 細(xì)菌DNA 的提取 取1.2.2 中的待用增菌液，13000 r/min 離心3 min 后棄上清液，沉淀中加入細(xì)菌核酸提取液50 μL，渦旋混勻后，100 ℃處理10 min，13000 r/min 離心10 min，小心吸取上清至潔凈的EP 管中，作為后續(xù)檢測的模板[24]。若長時(shí)間不用，可置于?20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 IMSA 法擴(kuò)增反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 以提取的細(xì)菌DNA 為模板，使用設(shè)計(jì)的引物對rfbE基因片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，PCR SuperMix Buffer（2×）12.5 μL，Bst 聚合酶（8 U）1 μL，10 μmol/L DsF/DSR各0.5 μL，40 μmol/L FIT /RIT 各1 μL，40 μmol/L SteF/SteR 各1 μL，DNA 模板2 μL，補(bǔ)超純水至25 μL。密封液20 μL。將配制好的體系漩渦混合后，放入PCR 儀中，反應(yīng)程序：63.0 ℃ 30 s, 63.0 ℃15 s, 63.0 ℃ 45 s。將 63.0 ℃ 15 s, 63.0 ℃ 45 s 作為一個(gè)循環(huán)，于63.0 ℃ 45 s 處收集熒光信號，設(shè)置45 個(gè)循環(huán)[24]。

1.2.5 qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 按說明書進(jìn)行qPCR 反應(yīng)體系配制，加DNA 模板5 μL。qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃45 s，40 個(gè)循環(huán)；并于60 ℃ 45 s 處采集熒光[25]。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 復(fù)蘇表1 中20 株不同菌株，提取核酸，利用引物大腸桿菌O157:H7 特異性rfbE基因，進(jìn)行IMSA 檢測，用滅菌的去離子水作為對照實(shí)驗(yàn)。以此評估該方法的特異性[24]。

1.2.7 靈敏度試驗(yàn) 大腸桿菌O157:H7 純菌種置于LB 肉湯中復(fù)蘇培養(yǎng)（(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h），復(fù)蘇后的菌種取1 mL 用磷酸鹽緩沖液制備成菌懸液備用，按10 倍梯度稀釋至10?8。選擇3 個(gè)適宜稀釋度，取200 μL 進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，同一稀釋度做3 個(gè)平行。(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h，即可推算出菌種原液含有的菌落數(shù)。同時(shí)，各稀釋度菌液取1 mL進(jìn)行提取核酸，進(jìn)行IMSA 檢測,檢測該方法的靈敏度[24]。

1.2.8 IMSA 法與qPCR 法的對比試驗(yàn) 取1.2.7 經(jīng)平板計(jì)數(shù)方法確定菌落數(shù)值后的各稀釋度菌液取1 mL，進(jìn)行提取核酸，用qPCR 法進(jìn)行檢測，從而評價(jià)IMSA 法和qPCR 法兩種方法的差異[23]。

1.2.9 樣本的最短增菌時(shí)間和最低含菌量檢出限確定試驗(yàn) 在無菌的環(huán)境中，將經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法和IMSA 檢測過的大腸桿菌O157:H7 為陰性的牛肉卷25 g，加入225 mL 改良EC 肉湯（mEC+n）的無菌均質(zhì)袋中。培養(yǎng)后經(jīng)平板計(jì)數(shù)確定濃度為9.1×103CFU/ mL 的大腸桿菌O157:H7 純菌菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至10?1，各稀釋度菌液取1 mL 加入到改良EC 肉湯（mEC+n）培養(yǎng)基中，于36 ℃培養(yǎng)8、10、12 h，提取DNA 核酸，進(jìn)行IMSA 檢測，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定檢測IMSA 方法的最短培養(yǎng)時(shí)間和最低含菌量[24]。

1.2.10 肉及肉制品樣品O157:H7 檢測試驗(yàn) 將24 份代表性肉制品樣本加入225 mL 改良EC 肉湯（mEC+n）中36 ℃培養(yǎng)10 h，取1 mL 增菌液提取細(xì)菌DNA 并進(jìn)行IMSA 檢測；同時(shí)按照GB 4789.36-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7/NM 檢驗(yàn)》中的常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行檢驗(yàn)，比較兩種方法的檢測結(jié)果，評估其一致性[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)

利用IMSA 技術(shù)方法對20 株不同菌株（表1）經(jīng)培養(yǎng)后的培養(yǎng)液提取核酸進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，僅大腸桿菌O157:H7（EHEC）均出現(xiàn)了S 型擴(kuò)增曲線，判定為陽性擴(kuò)增結(jié)果。而其他19 株菌種沒有出現(xiàn)S 型擴(kuò)增曲線，判定為陰性擴(kuò)增結(jié)果。由此可知，建立的大腸桿菌O157:H7 IMSA 法所用的引物具有良好的特異性。

圖1 腸出血大腸桿菌O157 IMSA 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 IMSA specificity test results of Escherichia coli O157

2.2 靈敏度試驗(yàn)

對大腸桿菌O157:H7 菌種純培養(yǎng)后，經(jīng)平板計(jì)數(shù)確定，原始大腸桿菌O157:H7 菌種菌液的濃度為8.9×109CFU/mL,10 倍梯度稀釋至10?2，各稀釋梯度菌液取1 mL 進(jìn)行IMSA 檢測，檢測結(jié)果如圖2 所示，IMSA 方法對大腸桿菌O157:H7 的靈敏度為8.9×102CFU/mL。

圖2 大腸桿菌O157:H7 IMSA 靈敏性檢測結(jié)果Fig.2 Sensitivity of Escherichia coli O157:H7 detected by IMSA assay

2.3 qPCR 法與IMSA 法的對比試驗(yàn)

O157:H7 純菌種培養(yǎng)后，經(jīng)平板計(jì)數(shù)確定菌落數(shù)值為8.9×109CFU/mL，用qPCR 法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖3 所示，qPCR 法對大腸桿菌O157:H7 的最低檢出限為8.9×103CFU/mL。結(jié)合圖2 表明，IMSA 法對大腸桿菌O157:H7 的檢測限達(dá)到102CFU/mL，qPCR 法對大腸桿菌O157:H7 檢測限達(dá)到103CFU/mL，說明IMSA 法比qPCR 法靈敏度更好。

圖3 大腸桿菌O157:H7 qPCR 法檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of Escherichia coli O157:H7 qPCR assay

2.4 樣本的最短增菌時(shí)間和最低含菌量檢出限確定試驗(yàn)

檢測結(jié)果如圖4 所示，增菌時(shí)間不少于 10 h 時(shí)，加標(biāo)濃度為9.1 CFU /mL 以上的樣品均能夠被穩(wěn)定檢測出大腸桿菌O157:H7，加標(biāo)濃度為 9.1×10?1CFU /mL 的樣品延長增菌時(shí)間依然無法檢測出大腸桿菌O157:H7。由此證明，該 IMSA 方法檢測大腸桿菌O157:H7 的最短增菌時(shí)間為 10 h，檢出限為9.1 CFU/25 g。

圖4 人工污染培養(yǎng)8 h（A）、10 h（B）、12 h（C）IMSA 檢測結(jié)果Fig.4 Artificial contamination culture 8 h（A），10 h（B），12 h（C）IMSA test results

2.5 肉及肉制品樣品添加大腸桿菌O157:H7 試驗(yàn)

將24 份食品樣本加入225 mL 改良EC 肉湯（mEC+n）中培養(yǎng)后，用IMSA 法與國標(biāo)法（GB 4789.36-2016）中的常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行試驗(yàn)，評估兩種檢驗(yàn)方法的一致性。通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)：2 份肉制品利用建立的IMSA 方法檢測出腸出血性大腸桿菌O157:H7，與國標(biāo)法中常規(guī)培養(yǎng)法檢測結(jié)果一致，說明IMSA 法能夠準(zhǔn)確檢測出腸出血性大腸桿菌O157:H7，與常規(guī)培養(yǎng)法一致性高達(dá)100%，證明兩種檢測方法一致性非常好（表3、圖5、圖6）。

圖6 不同食品樣本大腸桿菌0157:H7 國標(biāo)法的檢測結(jié)果Fig.6 Results of Escherichia coli O157:H7 detected in different food samples by national standard method

表3 不同肉制品樣品腸出血大腸桿菌0157:H7 的檢測結(jié)果Table 3 Detection results of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157: H7 in different meat Products

圖5 不同食品樣本大腸桿菌O157:H7 的檢測結(jié)果Fig.5 Results of Escherichia coli O157:H7 detected in different food samples

3 討論與結(jié)論

腸出血性大腸桿菌O157:H7 感染具有傳染性高、發(fā)病高、病死率高等特點(diǎn)[27]，嚴(yán)重影響人們的身體健康安全，因此建立有關(guān)腸出血性大腸桿菌O157:H7 的快速檢測技術(shù)有重大意義。應(yīng)用IMSA技術(shù)可以快速準(zhǔn)確地從食品樣品中檢測出目標(biāo)食源性致病菌,并應(yīng)用到各種實(shí)驗(yàn)室檢測工作中，為控制食品的衛(wèi)生安全提供技術(shù)支持。近年來，為了快速得到有關(guān)食源性致病菌的檢測結(jié)果，分子生物技術(shù)逐漸被更多的專業(yè)人員了解并應(yīng)用到食源性致病菌的檢測中。IMSA 作為一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，只需要一步預(yù)增菌操作，使腸出血性大腸桿菌O157:H7 大量增殖以達(dá)到檢出限，即可提取樣本核酸、上機(jī)檢測，只需要11～12 h 即可得到腸出血性大腸桿菌O157:H7 的檢測結(jié)果。

本研究運(yùn)用IMSA 技術(shù)建立快速檢測大腸桿菌O157:H7 的方法，需要解決的難點(diǎn)是其IMSA 引物的設(shè)計(jì)。引物的設(shè)計(jì)對其建立IMSA 法的成敗至關(guān)重要。鑒于微生物基因結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，通常會(huì)選擇血清群特異性基因、血清型特異性基因和屬特異性基因這三類靶基因用于設(shè)計(jì)特異性引物[28]。大腸桿菌O157:H7 是出血性大腸桿菌的主要血清型，能引起血性結(jié)腸炎等嚴(yán)重性疾病，而rfbE基因是大腸桿菌O157:H7 的高度保守基因[29?30]，因此選擇rfbE基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行IMSA 快速檢測方法的研究。本次研究建立的IMSA 法對大腸桿菌O157:H7 特異性強(qiáng)，靈敏度達(dá)到8.9×102CFU/mL，而qPCR 法的靈敏度在103CFU/mL 水平，IMSA 法比qPCR 就靈敏度上提高了10 倍；人工污染食品樣本在經(jīng)過10 h 增菌后，檢出限達(dá)到9.1 CFU/25 g，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.36 的要求。本研究選擇24 份不同類型的肉制品，進(jìn)行IMSA 法和國標(biāo)法的檢測，發(fā)現(xiàn)IMSA 法與國標(biāo)法的結(jié)果一致性達(dá)100%，說明兩種方法一致性非常好。

本次研究建立的快速檢測大腸桿菌O157:H7 的IMSA 方法，特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡單，不需要昂貴的儀器，耗時(shí)短，僅在11～12 h 內(nèi)得到檢測結(jié)果。為疾控部門和各種檢測機(jī)構(gòu)提供可靠、方便、快速、經(jīng)濟(jì)的技術(shù)思路與選擇，具有很高的應(yīng)用推廣價(jià)值。