雷美康，候建波，彭 芳，張文華，祝子銅，章應(yīng)俊，陳玉嬌，謝 文,*

（1.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江杭州 310016；2.衢州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江衢州 324003）

蜂蠟是一種由工蜂腹部下面四對蠟腺分泌的物質(zhì)，其主要成分是烷醇和烷酸形成的酯類，在食品工業(yè)、化妝品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)上應(yīng)用廣泛[1?4]。蜂農(nóng)在養(yǎng)殖蜜蜂過程中使用氯霉素類藥物用于預(yù)防和治療蜜蜂的幼蟲腐爛病等疾病，有可能造成蜂蠟中氯霉素類藥物或其代謝物的殘留。由于蜂蠟的循環(huán)使用導(dǎo)致巢脾中藥物殘留種類、殘留量不斷增加，直接影響了蜂蠟的質(zhì)量安全[5?7]。同時(shí)通過蜂蜜與巢脾的接觸，氯霉素類藥物及其代謝物能夠轉(zhuǎn)移至其他蜂產(chǎn)品中，進(jìn)而造成蜂蜜、蜂王漿和蜂膠的污染[8?10]。氯霉素類藥物及其代謝物在蜂蠟中的殘留不僅關(guān)系到人們身體健康，也將對我國蜂產(chǎn)品出口貿(mào)易產(chǎn)生巨大的風(fēng)險(xiǎn)。

氯霉素類藥物屬廣譜抗生素，對革蘭氏陰、陽性細(xì)菌均有抑制作用，常見的藥物主要包括氯霉素（chloamphenicol，CAP）、甲砜氯霉素（thiamphenicol，TAP）和氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）等[11],其中氯霉素被世界多個(gè)國家列入禁止使用的獸藥名單中[12?14]。由于甲砜氯霉素和氟苯尼考，其抗菌譜與氯霉素相似，較氯霉素其毒性有所降低，被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)。為保障食品安全，歐盟、日本和我國等均制定了其在動(dòng)物源性食品中的最大殘留限量，如GB 31650-2019[15]規(guī)定了動(dòng)物源性食品中甲砜氯霉素和氟苯尼考最高殘留限量分別為50 μg/kg 和100～3000 μg/kg。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于氯霉素類藥物及代謝物殘留檢測方法的研究越來越得到人們的重視[16?20]，主要基質(zhì)為畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品和蜂蜜等，但尚未見蜂蠟中氯霉素類藥物殘留量同時(shí)檢測方法的報(bào)道。為保障蜂蠟產(chǎn)品的質(zhì)量安全，同時(shí)為更好地監(jiān)控蜂產(chǎn)品的污染狀況，溯源蜂蜜、蜂王漿等其他蜂產(chǎn)品的藥物污染來源提供檢測技術(shù)支持。本文首次建立了正己烷預(yù)處理-固相萃取凈化-超高效液相色譜電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜檢測蜂蠟中痕量氯霉素類藥物的分析方法，該法具有簡便、靈敏度高、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，可用于大批量蜂蠟實(shí)際樣品中痕量氯霉素、甲砜氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氯霉素（CAS 56-75-7，純度≥98%）、氯霉素-D5（純度≥98%）、甲砜氯霉素（CAS 15318-45-3，純度≥98%）、氟苯尼考（CAS 76639-94-6，純度≥98%）和氟苯尼考-D3（純度≥98%）、氟苯尼考胺（CAS 76639-94-5，純度≥98%）、氟苯尼考胺-D3（純度≥98%） 德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、正己烷 色譜純，美國fisher 公司；氨水 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超純水 Millpore 純水儀制備；OASIS HLB 固相萃取小柱：500 mg，6 mL 美國Waters 公司；蜂蠟樣品 采購于某網(wǎng)購平臺(tái)和某蜂產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)提供，常溫保存。

1260-6460 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技有限公司；MS 3 digital 漩渦混合器 德國IKA 公司；MD 200 氮吹儀 杭州奧盛儀器公司；KQ-500B 超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器公司；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng) 美國密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂蠟預(yù)處理 試樣可放置于燒杯中，在70 ℃左右[8]加熱條件下溶解并混勻。

1.2.2 樣品提取 稱取試樣2.0 g（精確至0.01 g）于50 mL 帶蓋離心管中，準(zhǔn)確加入0.25 mL 混合內(nèi)標(biāo)溶液（10 ng/mL），加入10 mL 正己烷，渦旋超聲溶解后加入5 mL 水渦旋振蕩提取，8000 r/min 離心5 min，取下層水層，用5 mL 水再提取一次，合并提取液，待凈化。

1.2.3 凈化 將提取液轉(zhuǎn)移至MCX 固相萃取小柱（500 mg/6 mL,使 用 前 依 次 用3 mL 甲 醇，5 mL 1%甲酸水溶液活化）中，棄去淋洗液，用5.0 mL 甲醇-水（1:1，V/V）淋洗，抽干，用8 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集全部洗脫液，在50 ℃以下水浴中氮吹干，用1.0 mL 甲醇?0.15%甲酸（2:8，V/V）溶液溶解，混勻后經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾后用于上機(jī)分析[21]。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：InertSustain Swift C18（100 mm×2.1 mm,1.9 μm）,流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水，B 為甲醇,流速0.1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫程序：0～1.0 min，80%A；0.5～7 min，70%A～10%A；7～8 min，10%A；8～8.1 min，10%A～70%A；8.1～12 min，70%A。

1.2.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源（ESI），正負(fù)離子切換掃描模式；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：5 L/min；噴霧氣壓力：50 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min;毛細(xì)管電壓：3000 V；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），采集參數(shù)見表1。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別稱取適量4 種氯霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成500 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，儲(chǔ)存于?20 ℃冰箱中。取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成50 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋配制成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中同位素內(nèi)標(biāo)溶液濃度均為2.5 μg/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用OriginLab 9.0 軟件進(jìn)行繪圖和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇與優(yōu)化

蜂蠟屬于脂溶性物質(zhì)，常溫下，易溶于正己烷、氯仿和四氯化碳等弱極性有機(jī)溶劑，不易溶于水、甲醇、乙腈等強(qiáng)極性溶劑[3,8]。所以本文采用加入正己烷溶解蜂蠟樣品后，再加入提取溶劑提取。同時(shí)為考察水溶液的種類和水相-有機(jī)相比例對蜂蠟中氯霉素類藥物提取的影響，本文比較了水、10%甲醇-水溶液、0.1%甲酸-水溶液和0.1%氨水-水溶液四種提取溶劑的提取效果。采用基質(zhì)曲線和外標(biāo)法定量，前處理提取2 次，結(jié)果見圖1。

圖1 溶劑對氯霉素類藥物提取效果的影響Fig.1 Recovery rates of chloramphenicol drugs in different extraction solvents

結(jié)果表明，對于氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，采用0.1%氨水-水溶液的提取回收率均小于20%；采用10%甲醇-水溶液和0.1%甲酸-水溶液的提取回收率60%左右，采用純水的提取回收率大于88%。4 種提取溶劑對氟苯尼考胺的提取效率均低于50%，其中純水的提取回收率最高為45.9%。綜合以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)考慮環(huán)保因素，所以本實(shí)驗(yàn)采用水作為提取溶液。

2.2 凈化條件的選擇和優(yōu)化

研究比較了親水親脂平衡（HLB）和混合型陽離子交換固相萃取柱（MCX）固相萃取小柱對蜂蠟中4 種氯霉素類藥物凈化效果和回收率[22?23]。結(jié)果表明：對于蜂蠟中甲砜氯霉素和氟苯尼考HLB 凈化小柱的回收率略優(yōu)于MCX 凈化小柱，但是氟苯尼考胺的回收率只有14.4%，見圖2。綜合考慮，所以本實(shí)驗(yàn)的凈化方法采用MCX 凈化小柱。

圖2 不同凈化方法對氯霉素類藥物凈化回收率的影響Fig.2 Recovery rates of chloramphenicol drugs in different purification method

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取1.0 mg/L 氯霉素、氯霉素-D5、甲砜氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺和氟苯尼考胺-D3 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動(dòng)注射進(jìn)樣的方式，以30 μL/min 分別對其母離子掃描得到分子離子峰，再對其進(jìn)行子離子掃描得到碎片離子信息。優(yōu)化各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)，使母離子與選取的子離子強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化結(jié)果表明，氯霉素、甲砜氯霉素和氟苯尼考在負(fù)模式下靈敏度高，氟苯尼考胺在正模式下靈敏度高。氯霉素、甲砜氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的二級(jí)質(zhì)譜圖，母離子、子離子的質(zhì)量數(shù)均與文獻(xiàn)[16?20]報(bào)道一致。多種氯霉素類藥物及其代謝物多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表1，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見圖3。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters

圖3 氯霉素藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatograms of standard of chloramphenicol drugs

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

分別吸取不同濃度的氯霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按建立好的方法進(jìn)行分析，以各目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)的濃度比X 為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比Y 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，繪制基質(zhì)加標(biāo)工作曲線，得到本方法的線性范圍，回歸曲線方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示，在0.1～10 ng/mL 范圍內(nèi)，4 種氯霉素類藥物均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r≥0.99），如表2 所示。在陰性蜂蠟中加標(biāo)測定，3 倍信噪比對應(yīng)的加標(biāo)水平為方法的檢出限，10 倍為定量限。該方法的檢出限和定量限符合歐盟、我國等國家對動(dòng)物源性產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留限量的要求[15,23]。

表2 線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear rangs, regression equations, correlation coefficients, recoveries, limit of detection and limit of quantitation

2.5 回收率和精密度

選取陰性蜂蠟樣品，分別在0.1、0.3 和1.0 μg/kg 3 個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，測得的回收率和精密度如表3 所示。結(jié)果顯示，蜂蠟中4 種藥物殘留的平均回收率在65.0%～113.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.9%～18.2%之間。

表3 空白樣品的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Spiked recoveries rate and relative standard deriations(RSDs) of in blank samples (n=6)

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

本文采用基質(zhì)空白配制標(biāo)樣響應(yīng)值（A）與同質(zhì)量濃度溶劑標(biāo)樣響應(yīng)值(B)的比值(Matrix effect)進(jìn)行評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，其計(jì)算公式為Matrix effect（ME）=A/B×100[24?26]。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為2 μg/mL時(shí)，氯霉素、甲砜氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺質(zhì)效應(yīng)分別為ME（氯霉素）=33.9%，ME（甲砜氯霉素）=24.0%，ME（氟苯尼考）=30.8%，ME（氟苯尼考胺）=12.3%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，蜂蠟基質(zhì)對氯霉素、甲砜氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺四種化合物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，為消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，本文采用同位素內(nèi)標(biāo)以及空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的溶液等方法來降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。因未采購到甲砜氯霉素的氘代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，所以本文甲砜氯霉素的測定內(nèi)標(biāo)采用氯霉素-D5。

2.7 實(shí)際樣品檢測

用上述建立的方法對15 個(gè)蜂蠟樣品進(jìn)行檢測，有4 批次樣品檢出氯霉素類藥物殘留，其中1 批次同時(shí)檢出了氯霉素和氟苯尼考胺兩種物質(zhì)。檢測結(jié)果為氯霉素檢出3 批，殘留量濃度分別為0.62、0.77和14.3 μg/kg，甲砜氯霉素和氟苯尼考胺各檢出1 批，殘留量濃度分別為1.56 和0.87 μg/kg。氟苯尼考藥物未檢出，原因可能為該藥物分解為氟苯尼考胺[21]。具體情況見表4。

對蜂蠟中氯霉素類藥物檢測結(jié)果表明，蜂蠟中氯霉素藥物陽性檢出率高于蜂蜜、蜂王漿等蜂產(chǎn)品[27]。分析原因可能為蜜蜂養(yǎng)殖過程中，為預(yù)防或者之類蜂蜜疾病，需要向蜂巢中噴灑藥物，造成蜂蠟直接暴露在一定濃度的氯霉素藥物中；蜂蠟脂溶性的特點(diǎn)，蜂蠟更容易受到氯霉素類藥物的污染[28?30]；蜂蠟可重復(fù)用于制造蜂巢，造成了藥物在蜂蠟中的累積[6?7]。

3 結(jié)論

本文采用正己烷預(yù)溶解，水提取2 次，MCX 固相萃取小柱凈化等前處理方法提取凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法測定蜂蠟中痕量氯霉素、甲砜氯霉素和氟苯尼考等氯霉素類藥物殘留量。結(jié)果表明，本方法具有簡便、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以用于蜂蠟中痕量氯霉素類藥物殘留的定性和定量分析，為蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制、污染物溯源、風(fēng)險(xiǎn)分析提供檢測技術(shù)支持。對蜂蠟中氯霉素類藥物檢測結(jié)果表明，蜂蠟中存在一定的藥物殘留的安全隱患，希望相關(guān)部門給予重視，開展相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)分析，并制定相應(yīng)的措施。