張 裕，王 穎,2,3,4,*，李志芳，王 迪，張艷莉，佐兆杭

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室，黑龍江大慶 163319）

藜麥（Chenopodium quinoa），是全營養(yǎng)完全蛋白的功能性食品[1]，2013 年被FAO 認(rèn)定為最適合人類食用的“超級谷物”，我國目前也是全球設(shè)立的5 個宣傳點之一[2?4]。藜麥種子中不僅富含脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維和蛋白質(zhì)與氨基酸[5?7]，還有大量生物活性化合物，如類胡蘿卜素、維生素C 和酚類化合物等[8]，表現(xiàn)出顯著的降血糖、抗氧化、減脂、緩解炎癥、降低心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險等益生功能，使得藜麥作為備受矚目的新興營養(yǎng)功能食品之一[9]。藜麥作為低GI 食物原料，長期食用可以控制體重，不會引起人體內(nèi)血糖濃度的快速升高，在臨床上被推薦給糖尿病患者食用[10]。藜麥經(jīng)乳酸菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD 酶）、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多功效酶類，其中SOD 酶是機(jī)體內(nèi)能夠清除超氧陰離子自由基的預(yù)防型抗氧化劑，可直接用于衡量機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱[11]。

雜糧發(fā)酵乳是以雜糧與生牛乳或復(fù)原乳為主料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成具有特殊風(fēng)味且富含益生活性的乳制品[12]，不僅能保留原材料中固有營養(yǎng)活性成分，還兼具多種乳酸與活性益生菌，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持腸道菌群平衡、緩解乳糖不耐癥、提高免疫力等生理功能[13?14]，極大滿足消費(fèi)者對新型雜糧產(chǎn)品的需求。目前魏艷麗等[15]優(yōu)化藜麥青稞復(fù)合酸奶發(fā)酵工藝，藜麥添加量15%、青稞5%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時間6 h 時，制備的藜麥青稞復(fù)合酸奶感官品質(zhì)較高。李翔等[16]探索藜麥核桃酸奶發(fā)酵工藝，藜麥漿20.9%、蔗糖添加量7.0%、菌種接種量3.3%、發(fā)酵時間6.1 h，藜麥核桃酸奶感官評分高達(dá)95.98。但現(xiàn)階段研發(fā)的藜麥發(fā)酵乳多用蔗糖調(diào)味，長期飲用不利于機(jī)體健康。基于此，本研究將藜麥漿添加到復(fù)原乳中，采用木糖醇代替蔗糖，以復(fù)合菌系混合發(fā)酵，以SOD 酶作為主要考察指標(biāo)響應(yīng)面優(yōu)化無糖藜麥發(fā)酵乳發(fā)酵工藝，為后續(xù)驗證此產(chǎn)品的抗氧化活性提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥 青海高原紅藜麥；脫脂奶粉 黑龍江雙城雀巢有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum,LP）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus,LA） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)菌庫；SOD 酶活力檢測試劑盒南京建成生物工程研究所。

BS224S 型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HDJ-ZTG 型龍多功能電熱鍋 佛山市億用電器科技有限公司；JYL-Y912 型打漿機(jī) 九陽股份有限公司；pHS-3C 型pH 計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；均質(zhì)機(jī) 上海人和科學(xué)儀器有限公司；DGG-9140A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；YXQ-LS-100A 型立式壓力蒸汽滅菌器 山東浩中化工科技有限公司；FCH-900B 型超凈無菌工作臺 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；DRP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；A360 型紫外可見分光光度計 上海翱藝儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制作工藝流程

1.2.2 操作要點 菌種活化：MRS 液體培養(yǎng)基活化受試菌株，傳代3 次活化充分。挑取斜面培養(yǎng)基生長較好的菌落接種至MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。藜麥漿制備：挑選籽粒飽滿、顏色均勻的紅藜麥，反復(fù)清洗2～3 遍，蒸鍋熟化40～50 min，按1:5（g/mL）料水比充分磨勻藜麥制成藜麥漿，過200 目篩，于4 ℃保存?zhèn)溆?。?fù)原乳制備：將脫脂乳粉25 g 加入180 mL 70 ℃蒸餾水，混合均勻。均質(zhì)：將藜麥漿、木糖醇和復(fù)原乳按比例混合預(yù)熱至70 ℃，20 MPa 均質(zhì)8 min。滅菌：95 ℃，高壓滅菌10 min。冷卻后熟：發(fā)酵樣品立即放入4 ℃冰箱后熟10 h 以上，即得無糖藜麥發(fā)酵乳。

1.2.3 復(fù)合菌種發(fā)酵比例對發(fā)酵乳pH 和活菌數(shù)的影響 選用LP 和LA 作為發(fā)酵菌種復(fù)合發(fā)酵（LP:LA 為1:3、1:2、1:1、2:1、3:1），以發(fā)酵乳pH和活菌數(shù)為衡量指標(biāo)，確定最佳復(fù)合發(fā)酵劑比例。

1.2.4 木糖醇添加量對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響 添加不同含量的木糖醇（3%、4%、5%、6%、7%），對發(fā)酵乳進(jìn)行色澤、氣味、口感、組織形態(tài)等綜合感官評價，以確定最佳木糖醇添加量。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 藜麥漿添加量對發(fā)酵乳SOD 活力影響 設(shè)定接菌量3%、發(fā)酵溫度為38 ℃、發(fā)酵時間為8 h，考察不同藜麥漿添加量（10%、20%、30%、40%、50%）對無糖藜麥發(fā)酵乳的SOD 酶活力的影響。

1.2.5.2 乳酸菌接種量對發(fā)酵乳SOD 酶活力影響設(shè)定藜麥添加量為30%、發(fā)酵溫度為38 ℃、發(fā)酵時間為8 h，考察不同接菌量（1%、2%、3%、4%、5%）對無糖藜麥發(fā)酵乳的SOD 酶活力的影響。

1.2.5.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳SOD 酶活力的影響 設(shè)定藜麥添加量為30%、接菌量為3%、發(fā)酵時間為8 h，考察不同發(fā)酵溫度（34、36、38、40、42 ℃）對無糖藜麥發(fā)酵乳的SOD 酶活力的影響。

1.2.5.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵乳SOD 酶活力的影響 設(shè)定藜麥添加量為30%、接菌量為4%、發(fā)酵溫度為38 ℃，考察不同發(fā)酵時間（6、8、10、12、14 h）對無糖藜麥發(fā)酵乳的SOD 酶活力的影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 利用Design-Expert 8.06 軟件中Box-Behnken 模型，以菌種接種量（A）、藜麥漿添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）4 個單因素為自變量，發(fā)酵乳SOD 酶活力為響應(yīng)值，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.7 pH 的測定 采用pH 計對發(fā)酵乳進(jìn)行測定。

1.2.8 活菌數(shù)的測定 在無菌操作臺內(nèi)吸取1 mL樣品，用滅菌后的生理鹽水將樣品以1:9 的比例稀釋至10n，選取3 個合適的稀釋梯度，吸取1 mL 的樣品稀釋液加入MRS 固體培養(yǎng)基中，混勻，待培養(yǎng)基凝固后放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，選擇菌總數(shù)在30～300 之間進(jìn)行計數(shù)[17]。

1.2.9 理化指標(biāo)的測定 蛋白質(zhì)含量測定按照國標(biāo)GB 5009.5-2010 中的方法執(zhí)行[18]；脂肪含量測定按照國標(biāo)GB 5413.3-2010 中的方法執(zhí)行[19]；非脂乳固體測定按照國標(biāo)GB 5413.39-2010 中的方法執(zhí)行[20]；酸度的測定按照GB 5413.34-2010 中的方法測定[21]。

1.2.10 微生物的測定 按照GB 4789-2016《食品微生物學(xué)檢驗》測定發(fā)酵乳中大腸菌群、致病菌數(shù)和乳酸菌數(shù)[22]。

1.2.11 感官評分標(biāo)準(zhǔn) 參照趙延勝等[23]的方法，對無糖藜麥發(fā)酵乳進(jìn)行感官評分，參評人數(shù)10 人，取平均分作為感官評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表2 所示。

表2 感官評分準(zhǔn)則Table 2 Sensory rating criteria

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)操作，所有數(shù)據(jù)用xˉ±s 表示。用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與處理，響應(yīng)面分析結(jié)果用Design Expert 8.06 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合發(fā)酵劑比例對發(fā)酵乳pH 和活菌數(shù)的影響

LP 屬于同型發(fā)酵乳酸菌[24]，繁殖能力較強(qiáng)且能大量的產(chǎn)酸，而LA 具有較強(qiáng)的酸耐受性[25]，兩種菌株復(fù)配為得到一種有較強(qiáng)生長活性、產(chǎn)酸較快的復(fù)合發(fā)酵劑。從圖1 可知，隨LP 接種比例的增大，發(fā)酵乳pH 逐漸降低，推測隨LP 產(chǎn)酸量較大，其接種比例越多，發(fā)酵乳中酸度越高。LP 和LA 以2:1 比例復(fù)配時，發(fā)酵乳中活菌數(shù)最高達(dá)6.54×109CFU/mL隨后下降，推測可能是發(fā)酵乳內(nèi)部環(huán)境酸度過高，導(dǎo)致菌株生長繁殖受到一定的抑制，使菌株活菌數(shù)減少，且發(fā)酵乳酸度過高，口感不易被消費(fèi)者接受，因此選復(fù)合發(fā)酵劑比例2:1。

圖1 復(fù)合發(fā)酵劑比例對發(fā)酵乳pH 和活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of compound starter ratio on pH and viable bacteria count of fermented milk

2.2 木糖醇添加量對發(fā)酵乳感官評分的影響

木糖醇添加量直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味口感，由圖2可知，發(fā)酵乳的感官評分值隨木糖醇添加量增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。木糖醇添加量過少，發(fā)酵乳過酸，發(fā)酵效果不好，組織狀態(tài)不穩(wěn)定。木糖醇添加量過多，發(fā)酵乳口感偏甜，感官評分下降。因此木糖醇最適添加量選為5%。

圖2 木糖醇添加量對發(fā)酵乳感官評分的影響Fig.2 Effect of xylitol supplemental amount on sensory score of fermented milk

2.3 單因素實驗

2.3.1 藜麥漿添加量對發(fā)酵乳SOD 酶活力及感官評分的影響 由圖3a 可知，隨藜麥漿添加量的增多，發(fā)酵乳SOD 酶活力和感官評分為均呈現(xiàn)先增強(qiáng)后降低的趨勢。藜麥漿添加量為30%時，發(fā)酵乳SOD 酶活力和感官評分均達(dá)最高，這可能是由于混合液中糖類物質(zhì)恰好促進(jìn)乳酸菌生長繁殖。藜麥富含的酚類、黃酮類、SOD 酶類活性物質(zhì)，能夠顯著抑制脂質(zhì)過氧化和清除O2-自由基的能力；當(dāng)藜麥漿過多時，原料難以調(diào)配均勻，導(dǎo)致乳酸菌發(fā)酵不充分，抗氧化酶系統(tǒng)受損，發(fā)酵乳SOD 酶活力下降[26]。因此綜合考慮選擇藜麥漿添加量最適范圍為20%～40%。

圖3 單因素實驗結(jié)果Fig.3 Results of single factor experiment

2.3.2 乳酸菌接種量對發(fā)酵乳SOD 酶活力及感官評分的影響 由圖3b 可知，隨乳酸菌接種量增加，發(fā)酵乳SOD 酶活力和感官評分均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。乳酸菌接種量為3%時，發(fā)酵乳SOD 酶活力和感官評分均達(dá)最高，接種量過低時，發(fā)酵乳易污染雜菌形成不利于菌種增殖生長的環(huán)境。若接種量超過3%，就可能導(dǎo)致發(fā)酵過度發(fā)酵乳pH 改變，且過酸、過堿均不利于菌體繁殖生長的環(huán)境；同時SOD酶作為蛋白質(zhì)，分子內(nèi)部規(guī)律性結(jié)構(gòu)亦易受pH、溫度等物理或化學(xué)因素影響導(dǎo)致氫鍵斷裂進(jìn)而空間結(jié)構(gòu)被破壞，使其活性降低或衰亡，從而影響SOD 酶活力[27]。因此綜合考慮選擇乳酸菌接種量最適范圍為2%～4%。

2.3.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳SOD 酶活力及感官評分的影響 由圖3c 可知，隨發(fā)酵溫度增加，發(fā)酵乳SOD酶活力和感官評分均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。發(fā)酵溫度38 ℃時，發(fā)酵乳的SOD 酶活力和感官評分最高。發(fā)酵溫度過低不利于乳酸菌生長，使發(fā)酵速度變慢，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物不足，SOD 酶活力下降。根據(jù)酶促反應(yīng)動力學(xué)，溫度升高反應(yīng)速度加快，呼吸強(qiáng)度增高，導(dǎo)致微生物繁殖代謝加快，但溫度升高同時，也會導(dǎo)致酶失活速度增大，縮短發(fā)酵周期，影響發(fā)酵效果[28]。因此綜合考慮選擇發(fā)酵溫度最適范圍為36～40 ℃。

2.3.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵乳SOD 酶活力及感官評分的影響 由圖3d 可知，隨發(fā)酵時間增加，發(fā)酵乳SOD酶活力和感官評分均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。發(fā)酵時間8 h，發(fā)酵乳SOD 酶活力和感官評分最高，此時發(fā)酵乳氣味醇正，口感酸甜合適。推測當(dāng)發(fā)酵時間過短，乳酸菌生長繁殖不充分，代謝產(chǎn)物積累不足，酶活性低；時間過久，乳酸菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)不足，其生長提前進(jìn)入衰亡期，菌體死亡數(shù)增加，發(fā)酵乳中代謝廢物積累，致使SOD 酶活力迅速下降[29]。因此綜合考慮選擇發(fā)酵時間最適范圍為6～10 h。

2.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.4.1 回歸模型分析 選取乳酸菌接種量（A）、藜麥漿添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）四個因素作為考察因子，研究各因素間交互作用對發(fā)酵乳的SOD 酶活力的影響，采用Box-Behnken 設(shè)計原理，對無糖藜麥發(fā)酵乳的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，如表3所示。

對表3 中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面回歸模擬方程：Y=245.8+1.67A?2.48B+5.57C+3.45D?2.08 AB?1.56AC?5.43AD+7.65BC?5.3BD?2.15CD?25.39 A2?18.54B2?20.21C2?9.98D2。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for respond surface analysis

對方程進(jìn)行顯著性分析，如表4 所示。所選回歸方程模型P<0.0001，說明該二次多項回歸模型極顯著，失擬項（P=0.1971>0.05），表明不顯著，說明該模型吻合實際情況，方程對試驗有較好的擬合性。同時，模型回歸系數(shù)R2為0.9939，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9877，表明該方程擬合程度良好，試驗誤差小，可用于無糖藜麥發(fā)酵乳發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model

由分析結(jié)果可知因素一次項中C、D 對無糖藜麥發(fā)酵乳SOD 酶活力的影響達(dá)到高度顯著水平（P<0.001），A、B 項達(dá)到差異極顯著（P<0.01），由因素的F值可知，各因素對無糖藜麥發(fā)酵乳SOD 酶活力影響順序依次為：發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>藜麥漿添加量>乳酸菌接種量。

2.4.2 響應(yīng)面分析 依據(jù)Design-Expert，獲得各因素之間交互作用對無糖藜麥發(fā)酵乳SOD 酶活力影響的響應(yīng)面三維圖，如圖4 所示，兩個因素之間的相互作用越強(qiáng)曲面圖坡度陡峭，反之亦然，因此各交互作用對發(fā)酵乳SOD 酶活力的影響從大到小依次為B（藜麥漿添加量）C（發(fā)酵溫度）>A（乳酸菌接種量）D（發(fā)酵時間）>B（藜麥漿添加量）D（發(fā)酵時間）>C（發(fā)酵溫度）D（發(fā)酵時間）>A（乳酸菌接種量）B（藜麥漿添加量）>A（乳酸菌接種量）C（發(fā)酵溫度），其中BC、AD、BD 交互作用對發(fā)酵乳SOD 酶活力的影響極顯著，這與方差分析結(jié)果吻合。根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果分析得到最佳參數(shù)乳酸菌接種量3.01%、藜麥漿添加量29.32%、發(fā)酵溫度38.24 ℃、發(fā)酵時間8.35 h、此條件下無糖藜麥發(fā)酵乳的SOD 酶活力可達(dá)246.54 U/mL。考慮實際操作情況，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為：乳酸菌接種量3%，藜麥漿添加量30%，發(fā)酵溫度38 ℃，發(fā)酵時間8 h。為驗證模型結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)最佳發(fā)酵工條件進(jìn)行三次重復(fù)性試驗，得到無糖藜麥發(fā)酵乳SOD 酶活力為（241.17±3.65） U/mL，與模型預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化的無糖藜麥發(fā)酵乳發(fā)酵工藝參數(shù)具有準(zhǔn)確性。

圖4 兩因素交互作用對無糖藜麥發(fā)酵乳SOD 活力的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of SOD activity in fermented milk of sugar-free quinoa under the interaction of two factors

2.5 無糖藜麥發(fā)酵乳理化指標(biāo)測定結(jié)果

由表5 可知，無糖藜麥發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)、脂肪、非脂乳固體、酸度均符合相關(guān)國標(biāo)要求，并且藜麥漿的加入使發(fā)酵乳更滿足現(xiàn)代人的膳食營養(yǎng)需求。

表5 無糖藜麥發(fā)酵乳理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 5 Determination of physicochemical indexes of sugar-free quinoa fermented milk

2.6 微生物指標(biāo)測定結(jié)果

對無糖藜麥發(fā)酵乳進(jìn)行微生物指標(biāo)測定，如表6所示，無糖藜麥發(fā)酵乳的乳酸菌數(shù)高于普通發(fā)酵乳，且未檢出大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌，衛(wèi)生指標(biāo)合格，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

表6 微生物指標(biāo)測定結(jié)果Table 6 Results of microbial index determination

3 結(jié)論

以藜麥漿與脫脂奶粉為原料，利用木糖醇替代蔗糖制得的無糖藜麥發(fā)酵乳，通過單因素實驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝條件為：復(fù)合發(fā)酵劑植物乳桿菌:嗜酸乳桿菌為2:1、木糖醇添加量5%、乳酸菌接種量3%、藜麥漿添加量30%、發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵時間8 h，其中發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳SOD 酶活力影響最大，此條件下無糖藜麥發(fā)酵乳的SOD 酶活力241.17 U/mL，蛋白質(zhì)含量為2.33 g/100 g，非脂乳固體含量為6.59 g/100 g，酸度為77.9 °T，乳酸菌數(shù)為5.85×109CFU/mL，未檢出致病菌。無糖藜麥發(fā)酵乳組織狀態(tài)穩(wěn)定，口感細(xì)膩，酸甜適中，具有藜麥香氣，是一款營養(yǎng)豐富、具有較高抗氧化能力的雜糧發(fā)酵乳，并為深入研究無糖藜麥發(fā)酵乳降糖提供理論基礎(chǔ)及數(shù)據(jù)支撐。