王艷陽，邊明明，康媛媛，章紹兵，孟 珺

（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州 450001）

乳桿菌作為益生菌的一大類，可黏附定植于腸道細菌，均衡腸道內(nèi)微生物，影響免疫調(diào)節(jié)功能，減少病原菌在胃腸道的定殖[1?2]。乳桿菌對腸道上皮細胞的黏附作用與菌體表面的疏水作用、靜電作用和菌體本身的聚集能力相關(guān)。這些都與乳桿菌的表面成分相關(guān)，其中表層蛋白起著至關(guān)重要的作用[3?6]。多數(shù)乳桿菌的外表都覆蓋著一層表層蛋白，可經(jīng)自組裝形成對稱次晶格陣列結(jié)構(gòu)，在乳桿菌的總蛋白含量中占比較大[7?9]。表層蛋白的提取通常采用高濃度解離劑法，表層蛋白亞基以及表層蛋白與細胞壁之間通過非共價鍵連接，因此可通過高濃度的解離劑提取表層蛋白[10]。LiCl（氯化鋰）、鹽酸胍和尿素是常用的表層蛋白解離劑[11?13]。尹瓊芳等[14]分別利用4 mol/L鹽酸胍和5 mol/L LiCl 提取L. acidophilusCGMCC 1.1878 和L. acidophilusLA1 的表層蛋白，電泳發(fā)現(xiàn)其分子量約為46 kDa。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mol/L LiCl 提取的粗蛋白含量更多，效果更好。Zhang 等[15]分別利用LiCl 和尿素提取L. acidophilusCICC6074 表層蛋白，分子量約為46 kDa。目前關(guān)于表層蛋白的提取方法差異性較大，通常采用高濃度的解離劑提取方法。但高濃度解離劑提取的表層蛋白通常含有雜蛋白，因此需進一步優(yōu)化蛋白的提取方法。

本文用5 mol/L LiCl 法、4 mol/L 鹽酸胍法、8 mol/L 尿素法、兩種不同濃度的LiCl 法（5 mol/L和1 mol/L）提取乳桿菌表層蛋白，通過比較每種方法所提取蛋白的總蛋白濃度、對乳桿菌的表面特性以及存活率的影響，找到提取乳桿菌表層蛋白的最適方法。為之后研究乳桿菌表層蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)與功能應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）JCM 1132 由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供；電泳低分子量標準蛋白（Marker，相對分子質(zhì)量范圍 14.4～97.4 kDa）、透析袋（截留分子量8～14 kDa） 上海源葉生物科技有限公司；其它試劑 均為分析純。

ZD85 氣浴恒溫振蕩器 國華電器有限公司；GL-20G 高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；722S 型分光光度計 上海渡楊精密儀器；GNP-9050 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏儀器廠；SWCJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺 上海篤特科學儀器廠；MVS1 漩渦混合機 北京金北德工貿(mào)有限公司；ML204 電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化與傳代 在安瓿瓶管內(nèi)加入無菌的MRS（de Man-Rogosa-Sharpe）液體培養(yǎng)基，輕輕振蕩。取適量菌懸液轉(zhuǎn)接到MRS 固體培養(yǎng)基，37oC恒溫培養(yǎng)48 h。接種環(huán)挑取單菌落接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37oC 恒溫培養(yǎng)18 h。取培養(yǎng)液再次轉(zhuǎn)接MRS 液體培養(yǎng)基中，按接種量2%（v/v），37oC 恒溫搖床培養(yǎng)18 h，以此提高菌株活性，置于4 ℃冰箱內(nèi)用于實驗備用。

1.2.2 表層蛋白的提取 1000 mL 的乳桿菌菌懸液離心（5000 r/min，15 min），收集菌體。無菌PBS（pH 7.2）洗滌兩次，再次離心收集菌體。分別加入菌懸液1/20 體積的提取劑（5 mol/L LiCl，4 mol/L 鹽酸胍，8 mol/L 尿素）重懸菌體，37oC 處理30 min。4oC下12000 r/min 離心20 min，所得上清液即為表層蛋白粗提液。在4oC 下用去離子水對上清液進行透析48 h，12000 r/min 離心20 min 收集沉淀，即為不同提取方法提取的表層蛋白[16]。

將按上述方法5 mol/L LiCl 提取的沉淀再加入菌懸液1/20 體積的1 mol/L LiCl 溶液重懸，37oC 處理30 min。4oC 下12000 r/min 離心20 min，所得上清液即為兩種不同濃度的LiCl（5 mol/L 和1 mol/L）提取兩次所得到的表層蛋白粗提液。去離子水透析，離心收集沉淀。

1.2.3 表層蛋白濃度的測定 實驗采用NanoDrop 2000C 超微量分光光度計測定樣品溶液分別在260 nm 和280 nm 處的OD 值，蛋白質(zhì)濃度計算公式為：

1.2.4 表層蛋白相對分子質(zhì)量的測定 配制5%濃縮膠和12%分離膠進行SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）。將表層蛋白樣品溶于10%的SDS 溶液中，2×上樣緩沖液與樣品等體積混合，沸水浴加熱5 min，上樣量15 μL。濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。

1.2.5 乳桿菌存活率的測定 37oC 恒溫搖床培養(yǎng)乳桿菌18 h，離心收集菌體（5000 r/min，4oC，5 min）。600 nm 波長下調(diào)整菌懸液吸光值至（1.00±0.01），離心收集菌體。無菌PBS 等比稀釋菌體后，將菌體涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，活菌計數(shù)，三組平行實驗取其平均值，記為N0。分別取5 mol/L LiCl、4 mol/L 鹽酸胍、兩種不同濃度的LiCl 法（5 mol/L 和1 mol/L）、8 mol/L 尿素處理后的菌體，實驗操作如上所述。對失去表層蛋白的乳桿菌進行菌落計數(shù)，記為N1。依照公式計算乳桿菌的存活率：

1.2.6 乳桿菌表面疏水性的測定 參考Kos 等[17]的MATH 方法，分別計算不同方法處理后菌體的表面疏水率。0.01 mol/L 無菌PBS 洗滌菌體兩次后，菌體重懸于0.1 mol/L KNO3溶液（pH6.2）。600 nm波長下調(diào)節(jié)菌懸液的OD 值為（0.50±0.01），準確讀數(shù)，記為A0。0.1 mol/L KNO3溶液作為空白對照組，將菌懸液與二甲苯按照3:1 的體積比混合，室溫反應10 min，漩渦振蕩2 min 后，再次室溫反應20 min。測定分層后的水相在波長600 nm 處的OD 值，記為A1。乳桿菌表面疏水率的計算如下：

1.2.7 乳桿菌表面電荷的測定 參考Kos 等[17]的實驗方法，路易斯酸堿采用三氯甲烷和乙酸乙酯，測定表層蛋白與菌體表面電荷的關(guān)系。離心得到的菌體重懸于0.1 mol/L KNO3溶液（pH6.2）。600 nm 波長下調(diào)節(jié)菌懸液的OD 值為0.50±0.01，準確讀數(shù)，記為A0。0.1 mol/L KNO3溶液作為空白對照組，將菌懸液與三氯甲烷或乙酸乙酯按照3:1 的體積比混合，室溫反應10 min，漩渦振蕩2 min 后，再次室溫反應20 min。測定分層后水相的OD600值，記為A1。不同方法提取表層蛋白后乳桿菌溶劑吸附率的計算如下：

1.2.8 乳桿菌自動聚集能力的測定 參考劉珊娜等[18]的實驗方法，菌懸液5000 r/min 離心15 min 得到菌體，PBS 洗滌兩次后重懸于PBS 緩沖液中。600 nm波長下調(diào)節(jié)菌懸液的OD 值為（0.50±0.01），準確讀數(shù)，記為A0。將菌懸液混勻，室溫靜置4 h，測定分層后水相的OD600值，記為A4。乳桿菌自動聚集率的計算公式如下：

1.2.9 乳桿菌與致病菌的共聚集能力的測定 37oC恒溫搖床培養(yǎng)乳桿菌18 h，菌懸液（5000 r/min，4oC，5 min）離心得到的菌體重懸于0.1 mol/L KNO3溶液（pH6.2）。600 nm 波長下調(diào)節(jié)菌懸液的OD 值為0.50±0.01。將2 mL 乳桿菌菌懸液與致病菌菌懸液等量混合，旋渦振蕩10 s。室溫下放置4 h 后測定OD600值，記為AM。同時分別取4 mL 乳桿菌和致病菌懸液作為對照組，室溫下放置4 h 后OD600值，分別記為AL和AP[19]。依照如下公式計算不同提取方法后失去表層蛋白的乳桿菌與致病菌的共聚集率：

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗所得數(shù)據(jù)為三次平行實驗的平均值，通過SPSS Statistics 20.0?（美國 IBM 公司）對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，當P<0.05 時，代表數(shù)據(jù)的差異性顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 表層蛋白的SDS-PAGE 分析

表層蛋白與細胞壁之間通過非共價鍵相連接，高濃度的解離劑如LiCl、鹽酸胍和尿素等可以提取表層蛋白。Johnson 等[20]提出，先用5mol/L LiCl 處理后再用1 mol/L LiCl 處理提取表層蛋白可得到純度較高的表層蛋白。本實驗采用四種不同方法提取表層蛋白，對蛋白樣品進行SDS-PAGE 分析，比較各方法提取的表層蛋白的純度，結(jié)果如圖1。

圖1 不同方法提取菌體表層蛋白的SDS-PAGE 圖Fig.1 SDS-PAGE of different methods to extract the surface layer proteins

已知嗜酸乳桿菌表層蛋白的分子量約為46 kDa[21?23]，圖中可以看出2 和3 號泳道蛋白條帶最為密集，粗蛋白分子量分布較廣，但目標蛋白（46 kDa）的提取量低。推測可能是鹽酸胍和尿素導致表層蛋白的降解。泳道1 和4 提取的目標蛋白的量明顯增加，在46 kDa 左右有明顯的蛋白條帶，與之前的研究結(jié)果相符[15]。泳道4 有明顯的單一的蛋白條帶，提取效果最好，故5 mol/L 和1 mol/L LiCl法是最適提取表層蛋白的方法。

2.2 蛋白含量測定

不同方法提取的表層蛋白濃度結(jié)果如圖2。兩種不同濃度LiCl 法所得表層蛋白濃度是最高的，為4.61 mg/mL，5 mol/L LiCl 法次之，8 mol/L 尿素法濃度最低。說明用兩種不同濃度LiCl 法提取表層蛋白，可以更徹底地將表層蛋白粗提液中的糖類、脂類等其他大分子過濾掉，從而提取得更高純度的蛋白樣品。

圖2 不同方法提取表層蛋白的濃度Fig.2 Surface layer proteins concentrations extracted by different methods

2.3 不同提取方法對乳桿菌存活率影響

在實驗過程中，表層蛋白的提取劑對乳桿菌菌體的損傷是不可避免的，但不同提取劑對菌體的損傷是否會引起其存活率的大幅度下降尚未可知。

本實驗采用平板計數(shù)法研究了不同提取方法對乳桿菌存活率的影響，結(jié)果如表1 所示。用兩種不同濃度LiCl（5 mol/L 和1 mol/L）處理后，乳桿菌存活率最高，其他方法處理的菌體存活率損失在14%～17%左右，均在一個1 個log 以內(nèi)，說明表層蛋白的去除對乳桿菌的存活沒有太大影響。研究發(fā)現(xiàn)LiCl 處理L. helveticusATCC 12046 后引起了菌體1 個log 內(nèi)的損傷[24]。孟珺等[25]也發(fā)現(xiàn)LiCl 剝離乳桿菌表層蛋白后引起的菌體損傷在6%～11%左右，均在一個1 個log 以內(nèi)，與本實驗結(jié)果與其一致。

表1 不同提取方法對嗜酸乳桿菌存活率的影響Table 1 Effect of different extraction methods on the survival rate of L. acidophilus

2.4 不同提取方法對乳桿菌表面疏水性的影響

乳桿菌可通過特異性黏附和非特異性黏附定植于上皮細胞，其中疏水作用力是乳桿菌非特異性黏附的重要作用力。Perez 等[26]發(fā)現(xiàn)黏附性較好的雙歧桿菌菌株都具備高疏水性。為了研究表層蛋白提取方法對乳桿菌表面疏水性的影響，本實驗選擇四種不同的蛋白提取方法測定乳桿菌表面疏水性的變化。

結(jié)果如表2 所示，未處理的L. acidophilusJCM 1132 的表面疏水率為47.00%，四種方法處理后的L.acidophilusJCM 1132 表面疏水率均有顯著下降（P<0.05）。其中，用5 mol/L LiCl 處理后的菌株和5 mol/L 和1 mol/L LiCl 處理后的菌株表面疏水率最低，約為13.87%。5 mol/L LiCl 處理的菌株疏水率下降幅度最大，約為33.13%，8 mol/L 尿素處理的下降幅度最小，約為23%。這與之前的實驗結(jié)果相符，LiCl 法提取表層蛋白效果更好且提取表層蛋白的濃度更高導致乳桿菌的表面疏水性更低。推測表層蛋白對乳桿菌的表面疏水性及非特異性黏附有著重要的貢獻。研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌的疏水性通常與其粘附性之間呈現(xiàn)正相關(guān)[13]。Collado 等[19]發(fā)現(xiàn)L. acidophilus等多株乳桿菌具有較高的表面疏水率，本實驗結(jié)果與其一致。

表2 不同提取方法對嗜酸乳桿菌表面疏水性的影響Table 2 Effect of different extraction methods on surface hydrophobicity of L. acidophilus

2.5 不同提取方法對乳桿菌表面電荷的影響

除了表面疏水性之外，菌株的表面電荷也會影響菌體的非特異性黏附。表面電荷強的菌株對腸道粘膜具有較強的黏附能力[27]。本實驗測定了不同方法提取表層蛋白后菌株的表面電荷的變化，結(jié)果如表3 和表4 所示：未處理的L. acidophilusJCM 1132 對三氯甲烷的吸附率高達90.93%，表明未處理的菌株具有很強的給電子能力。對乙酸乙酯的吸附率很弱，只有26.33%，說明其接受電子的能力很低。通過四種不同方法去除表層蛋白后，L. acidophilusJCM 1132 對三氯甲烷的吸附率都有明顯下降（P<0.05），表明菌體給電子能力降低。

表3 不同提取方法處理后嗜酸乳桿菌對三氯甲烷的吸附率Table 3 Adsorption rate of trichloromethane by L. acidophilus after different extraction methods

表4 不同提取方法處理后嗜酸乳桿菌對乙酸乙酯的吸附率Table 4 Adsorption rate of ethyl acetate by L. acidophilus after different extraction methods

然而不同方法處理后菌體對乙酸乙酯的吸附率不全是下降趨勢。用4 mol/L 鹽酸胍和8 mol/L 尿素方法處理的乳桿菌在失去表層蛋白后，對乙酸乙酯的吸附率反而升高。菌體的表面電荷不僅與表層蛋白所帶電荷有關(guān)，還受到細胞壁羥基、羧基、磷酸基團等極性基團的影響，推測其原因可能是其他物質(zhì)作用更能影響L. acidophilusJCM 1132 表面電荷，具體機理還需要更深入探討[25]。

孟珺等[25]提取了7 株不同乳桿菌表層蛋白后發(fā)現(xiàn)其對三氯甲烷的吸附率明顯降低，與本文實驗結(jié)果一致。推測不同方法提取表層蛋白后都會影響菌體的表面電荷。由于菌體的非特異性黏附與表面疏水性和表面電荷相關(guān)，因此推測不同方法提取表層蛋白后菌體的非特異性黏附特性均會明顯降低。

2.6 不同提取方法對乳桿菌自動聚集能力的影響

乳桿菌的自聚集能力和共聚集能力與其對胃腸道的黏附作用和抵抗致病菌有關(guān)。菌株的自聚集作用和黏附作用呈正相關(guān)，自聚集能力強的菌株的黏附作用強，反之，則低[28]。本實驗通過四種方法去除L.acidophilusJCM 1132 表層蛋白后，測定其自動聚集能力的變化也證明了表層蛋白對乳桿菌的非特異性黏附有著積極的貢獻。

結(jié)果如表5 所示，用四種不同方法處理后，乳桿菌自聚集率都有顯著下降（P<0.05），下降幅度約為4%～19%。其中4 mol/L 鹽酸胍處理后菌株的自聚集能力下降最多，下降幅度為19%。5 mol/L LiCl 處理后菌株的自聚集能力下降最少，下降幅度為4%。表明不同的處理方法均能降低菌體的自聚集能力。

表5 不同提取方法對嗜酸乳桿菌自動聚集能力的影響Table 5 Effect of different extraction methods on the autoaggregation ability of L. acidophilus

Chen[29]等去除L. crispatusZJ001 表層蛋白后，菌體自動聚集力和對Hela 細胞的黏附力都有明顯的下降趨勢。Beganovic 等[30]報道5 mol/L LiCl 處理L. helveticusM92 后，其自動聚集率下降了10%，與本實驗結(jié)果一致。

2.7 不同提取方法對乳桿菌共聚集能力的影響

本實驗采用致病菌Salmonella typhimuriumFP1 作為病原菌的代表，測定不同處理方法后對乳桿菌共聚集能力的影響。結(jié)果如表6 所示：未處理前，菌體與S. typhimurium的共聚集率約為2.7%，表明該菌株與致病菌的共聚集能力較弱。用四種不同方法處理后，乳桿菌與致病菌共聚集率明顯降低。其中8 mol/L 尿素處理處理后的乳桿菌共聚集能力下降幅度最小，約為1.47%。兩種不同濃度LiCl（5 mol/L和1 mol/L）處理的乳桿菌共聚集能力下降幅度最大，約為2.36%。表明表層蛋白參與了乳桿菌的共聚集過程。

表6 不同處理方法對嗜酸乳桿菌共聚集能力的影響Table 6 The effect of different extraction methods on the coaggregation ability of L. acidophilus

Beganovic 等[30]研究了LiCl 處理對L. helveticusM92 與S. typhimuriumFP1 共聚集率的影響，發(fā)現(xiàn)LiCl 去除表層蛋白后兩株菌的共聚集率下降了約7.52%，與本文的實驗結(jié)果相符。

3 結(jié)論

本實驗利用5 mol/L LiCl、4 mol/L 鹽酸胍、8 mol/L尿素和兩種不同濃度的LiCl（5 mol/L 和1 mol/L）提取菌體表層蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE 分析，兩種不同濃度LiCl 提取的表層蛋白含量顯著高于其余三種方法，且有單一條帶，相對分子質(zhì)量在46 kDa 左右。采用平板計數(shù)法測定乳桿菌致死率，結(jié)果表明四種提取方法對乳桿菌菌體的損傷都較小，不會影響到菌體的存活率。但菌體的表面疏水性、表面電荷、自聚集能力與共聚集能力都呈明顯下降趨勢，表明表層蛋白參與了菌體自聚集與共聚集的過程，且對菌體的非特異性黏附有積極的貢獻。