權(quán)浩嚴(yán)，王 鵬，位正鵬，杜春影，沈照鵬，張京良，喬樂(lè)克,,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.青島市市立醫(yī)院，山東青島 266011；3.海洋功能食品國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，山東榮成 264309；4.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島 266071）

膽固醇酯酶（EC 3.1.1.13），又稱(chēng)甾醇酯酶，是酯酶家族中的一員，可以催化膽固醇類(lèi)物質(zhì)合成膽固醇酯類(lèi)，也可以將膽固醇酯類(lèi)水解為膽固醇和相應(yīng)的脂肪酸，具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。在食品加工方面，膽固醇酯酶可催化植物甾醇合成為甾醇酯，提高其在油相中的溶解度與穩(wěn)定性，應(yīng)用于功能性食品添加劑的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[1]。在醫(yī)藥方面，膽固醇酯酶可應(yīng)用于酶法檢測(cè)血液中總膽固醇含量[2]；在造紙方面，膽固醇酯酶主要通過(guò)水解廢紙中所含的甾醇酯，提升廢紙利用率[3]。隨著生物工業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的需要，膽固醇酯酶的市場(chǎng)需求也逐漸增加。

膽固醇酯酶的來(lái)源主要分為兩個(gè)方面。一方面是從生物組織中獲取，肝臟、胰臟、腎上腺、性腺、乳腺、腦、腦黃體等均有分布[4?6]。另一方面是由細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物發(fā)酵培養(yǎng)獲得[7?10]。不同來(lái)源的膽固醇酯酶具有不同的制備特點(diǎn)。從動(dòng)物內(nèi)臟中提取，成本高產(chǎn)量低。相比之下，利用微生物發(fā)酵方式獲取，能夠有效降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)量。然而，微生物來(lái)源的膽固醇酯酶酶活力較低，韓廷玉等[11]從莓實(shí)假單胞菌中得到膽固醇酯酶，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后酶活力僅為0.48 U/mL，孫柳青等[12]從伯克霍爾德菌中獲得的膽固醇酯酶水解活力也僅為1.04 U/mL，如何有效提高酶活已逐漸成為研究熱點(diǎn)。

本研究以課題組成功異源表達(dá)的產(chǎn)膽固醇酯酶的畢赤酵母工程菌株為主要研究對(duì)象，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，有效提高菌株產(chǎn)酶活力，建立搖瓶水平的最優(yōu)產(chǎn)酶工藝，同時(shí)探究其酶學(xué)性質(zhì)。為膽固醇酯酶的規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用提供了良好的理論技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株來(lái)源 獲自課題組成功異源表達(dá)的畢赤酵母工程菌株P(guān).pastorisX-33；培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：酵母浸粉 1.0%、胰蛋白胨 2.0%、葡萄糖 2.0%、瓊脂1.8%；種子培養(yǎng)基：酵母浸粉 1.0%、胰蛋白胨2.0%、葡萄糖 2.0%；發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉 1.0%、蛋白胨 2.0%、甘油 1.5%、K2HPO40.3%、KH2PO41.18%、生物素 4×10?5%、YNB 1.34%；酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨 分析純，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；乙酸對(duì)硝基苯酯 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對(duì)硝基苯酚 分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；葡萄糖、甘油、K2HPO4、KH2PO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉等 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LDZX-30KBS 立式蒸汽壓力滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；ZHJH-C1115B 型超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；pH400 pH 計(jì) 安萊立思儀器科技（上海）有限公司；LRH-70F 生化培養(yǎng)箱、HWS12 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZWY-2102C 智誠(chéng)恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；UV-6000PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 從菌種保藏管中挑取一環(huán)菌體接入固體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，活化菌株。再?gòu)墓腆w培養(yǎng)基上挑取一環(huán)活化后的菌體接入種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。以1%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)96 h，每24 h 加入1%甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

1.2.2 酶活力測(cè)定 參照Dong 等的方法[13]，酶活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯酚乙酸酯（p-NPA）法。酯酶能夠水解乙酸對(duì)硝基苯酯為對(duì)硝基苯酚及乙酸，對(duì)硝基苯酚在405 nm 處有特征吸收峰。酶活力單位定義為：在50 ℃ 和pH8.0 條件下，每分鐘水解底物生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所用的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。酶活反應(yīng)體系為1.03 mL，在1 mL Tris-HCl 緩沖液中加入50 mmol/L 乙酸對(duì)硝基苯酯溶液20 μL，10 μL 酶液，50 ℃ 反應(yīng)10 min，加入1 mL 1% SDS溶液終止反應(yīng)，405 nm 處測(cè)定吸光值，以不加酶的反應(yīng)體系作為對(duì)照。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.3.1 碳源篩選優(yōu)化 在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加1%的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，探究不同碳源種類(lèi)對(duì)發(fā)酵效果的影響；同步探究不同濃度甘油（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對(duì)發(fā)酵效果的影響[14]。以初始的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.2.3.2 氮源篩選優(yōu)化 在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加1%的（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3，探究不同無(wú)機(jī)氮源種類(lèi)對(duì)發(fā)酵效果的影響；同步探究不同濃度蛋白胨（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對(duì)發(fā)酵效果的影響[14]。以初始的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.2.3.3 初始pH 優(yōu)化 用100 mmol/L 的HCl 和NaOH分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，探究不同初始pH 對(duì)發(fā)酵效果的影響[15]。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基組分 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以甘油、蛋白胨、初始pH 為因素，以酶活力和為檢測(cè)指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行培養(yǎng)基組分優(yōu)化[16]。確定最佳產(chǎn)酶條件。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiments for enzyme production

1.2.5 丙酮沉淀 取等體積的粗酶液，按1:0.5、1:1、1:2 和1:3 體積比分別加入丙酮，4 ℃靜置，離心取沉淀，用Tris-HCl 緩沖液等體積復(fù)溶，測(cè)定酶活力，確定最佳丙酮沉淀比例。以原膽固醇酯酶粗酶液的酶活力值為100%作為對(duì)照。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)探究

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 采用p-NPA 法分別在30、35、40、45、50、55 ℃條件下測(cè)定酶活力；在pH8.0 Tris-HCl 緩沖液體系中，分別將酶液于40、45、50、55 ℃條件下靜置1 h 后測(cè)定酶活，以原酶液酶活力值100%作為對(duì)照[17]。

1.2.6.2 最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性 采用p-NPA法 分 別 在 pH4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0條件下測(cè)定酶活；分別將酶液于50 mmol/L pH 為6.0、7.0、8.0、9.0 的Tris-HCl 緩沖液體系中靜置1 h后測(cè)定酶活，以原酶液酶活力值100%作為對(duì)照[17]。

1.2.6.3 金屬離子的影響 在pH8.0 Tris-HCl 緩沖液體系和50 ℃條件下，分別向酶液中加入K+、Na+、Li+、Ba2+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+金屬離子至終濃度為5 mmol/L，室溫靜置1 h 后測(cè)定酶活，以原酶液酶活力值100%作為對(duì)照[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采用Microsoft Excel 2016 和GraphPad Prism 9 進(jìn)行數(shù)據(jù)的圖表處理。使用正交助手軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析。使用SPSS 22.0 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

2.1.1 碳源對(duì)酶活力的影響 碳源是微生物生長(zhǎng)繁殖代謝過(guò)程中必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和誘導(dǎo)物質(zhì)，不同的微生物的碳源代謝酶系不同，因此可利用的碳源也互不相同[18]。不同碳源對(duì)畢赤酵母發(fā)酵的影響如圖1A所示。作為對(duì)照的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，酶活力最高（P<0.01），在其基礎(chǔ)上添加其他碳源，不利于酶活力的積累。圖1B 為不同甘油濃度對(duì)菌種發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，當(dāng)甘油濃度從0.5%增加到1.0%時(shí)，酶活力緩慢上升，進(jìn)一步增加酶活力顯著下降（P<0.01）。這可能是由于過(guò)高的甘油濃度會(huì)導(dǎo)致關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的下降，進(jìn)而導(dǎo)致酶活力降低[19]。因此，選擇對(duì)酶活力較大的甘油含量（1.0%、1.5%、2.0%）作為正交水平進(jìn)行進(jìn)一步交互作用的探究。

圖1 碳源對(duì)畢赤酵母產(chǎn)膽固醇酯酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on cholesterol esterase produced by Pichia pastoris

2.1.2 氮源對(duì)酶活力的影響 氮源是微生物生長(zhǎng)和代謝所必需的重要原料，它也是構(gòu)成微生物核酸和蛋白質(zhì)等諸多含氮化合物的原料[20]。如圖2A 所示，添加無(wú)機(jī)氮源實(shí)驗(yàn)組的酶活力與對(duì)照組相比提高不顯著（P>0.05）。所以，在發(fā)酵過(guò)程中，主要以有機(jī)氮作為主要氮源。不同蛋白胨濃度對(duì)酶活力影響如圖2B所示，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?%時(shí)，酶活力幾乎達(dá)到最大值，進(jìn)一步提高蛋白胨含量，酶活力增加不顯著（P>0.05）。因此，分別選擇1.5%、2.0%、2.5%的蛋白胨濃度作為進(jìn)行后續(xù)交互作用的探究水平。

圖2 氮源對(duì)畢赤酵母產(chǎn)膽固醇酯酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on cholesterol esterase produced by Pichia pastoris

2.1.3 初始pH 對(duì)酶活力的影響 培養(yǎng)基的初始pH 對(duì)菌體的生長(zhǎng)、代謝及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程有重要影響[21]。畢赤酵母在不同初始pH 條件下的產(chǎn)酶結(jié)果如圖3 所示，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH 為8.0 時(shí)，酶活力幾乎達(dá)到峰值。不同的pH 會(huì)影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌[22]。因此，選擇出現(xiàn)酶活力峰值的pH 值范圍（6.0、7.0、8.0）作為下一步正交因素的探究水平。

圖3 初始pH 對(duì)畢赤酵母產(chǎn)膽固醇酯酶的影響Fig.3 Effect of initial pH on cholesterol esterase produced by Pichia pastoris

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，選擇甘油、蛋白胨和初始pH 三個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)極差值可知各因素對(duì)畢赤酵母產(chǎn)酶的影響次序?yàn)楦视?蛋白胨>初始pH，最優(yōu)產(chǎn)酶組合為A1B1C2，即甘油1.0%，蛋白胨1.5%，初始pH7.0。由表3 方差分析可知甘油、蛋白胨和初始pH 對(duì)畢赤酵母產(chǎn)酶差異均為極顯著（P<0.01）。

表2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analyses of orthogonal experiments for enzyme production

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析表Table 3 The variance analysis form of orthogonal design

2.3 最佳優(yōu)化培養(yǎng)基驗(yàn)證

為了進(jìn)一步探究培養(yǎng)基優(yōu)化的可靠性和穩(wěn)定性，采用正交實(shí)驗(yàn)中的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，并與優(yōu)化前發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4。優(yōu)化后酶活力較于優(yōu)化前提高3.65 倍。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果Table 4 Comparison results of validation experiments

2.4 膽固醇酯酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 酶液的制備 不同體積倍數(shù)丙酮沉淀酶液的酶活力變化曲線如圖4 所示。當(dāng)丙酮添加倍數(shù)為1.0 倍時(shí)，沉淀中的酶活力基本達(dá)最大值，之后再提高丙酮添加倍數(shù)，復(fù)溶液的酶活力不再增加。選擇1.0 倍作為丙酮添加最佳倍數(shù)。

圖4 丙酮沉淀曲線Fig.4 Acetone precipitation curve

2.4.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 溫度是影響酶蛋白性質(zhì)的重要因素之一，溫度過(guò)高，會(huì)引起酶分子高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，溫度過(guò)低，分子運(yùn)動(dòng)緩慢，酶解反應(yīng)速度下降[23]。如圖5A 所示，在30～55 ℃測(cè)定酶活，最適溫度為50 ℃。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，酶活力僅為最高值的68%。

酶溫度穩(wěn)定性的研究結(jié)果如圖5B，在40 ℃和45 ℃時(shí)，酶具有較好的穩(wěn)定性，45 ℃保溫300 min，酶活力仍能保持在89%以上；50 ℃保溫15 min，酶活力基本保持不變，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，酶活力迅速降低，在300 min 時(shí)酶活力保持在52%左右；而55 ℃保溫，酶活力顯著降低，保溫300 min 后，酶活力僅保持39%。

圖5 溫度對(duì)膽固醇酯酶的影響Fig.5 Effect of temperature on cholesterol esterase

2.4.3 最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性 不同pH 對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖6A，最適反應(yīng)pH 為8.0。當(dāng)pH 為7.0 時(shí)，酶活力能保持74%以上；當(dāng)pH 高于8.0 時(shí)，酶活力顯著降低，因?yàn)槊傅鞍姿幁h(huán)境的酸堿度，影響酶活性中心結(jié)合位點(diǎn)和催化位點(diǎn)的解離程度，導(dǎo)致酶催化作用降低[24]。

pH 穩(wěn)定性的研究結(jié)果如圖6B。在pH6.0～9.0 之間，該酶活力整體變化較小。pH 穩(wěn)定性良好。

圖6 pH 對(duì)膽固醇酯酶影響Fig.6 Effect of pH on the stability of cholesterol esterase

2.4.4 金屬離子的影響 金屬離子對(duì)酶活力影響結(jié)果如表5 所示。K+、Na+、Li+、Ba2+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Ca2+、Mg2+和Al3+對(duì)酶活力影響較??；Mn2+和Fe3+對(duì)酶活力具有弱促進(jìn)作用；Zn2+對(duì)酶活力有一定的抑制作用。覃擁靈等[25]研究結(jié)果顯示，Zn2+對(duì)酯酶具有一定抑制作用，可能是由于Zn2+影響了酯酶催化活性中心與底物的結(jié)合，從而導(dǎo)致酯酶活性降低。

表5 金屬離子對(duì)膽固醇酯酶穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of metal ions on the stability of cholesterol esterase

3 結(jié)論

本研究以課題組成功異源表達(dá)的產(chǎn)膽固醇酯酶的畢赤酵母工程菌株為主要研究對(duì)象，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最適培養(yǎng)基組成。優(yōu)化后酶活力達(dá)到11.21 U/mL，較優(yōu)化前3.65 倍。該酶酶學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，Zn2+對(duì)其具有一定的抑制作用。與其他產(chǎn)膽固醇酯酶的菌株相比，該酶酶活力較高，酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，穩(wěn)定性好。下一階段將從膽固醇酯酶的分離純化以及酶制劑的開(kāi)發(fā)方面進(jìn)行深入探究，以期為其規(guī)?；苽浜蛻?yīng)用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。