郅 慧，蘭 夢，尹馨雪，楊小倩，張 輝,*，李晶峰,*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117；2.吉林省東北亞生物科技有限公司，吉林長春 130017）

鹿筋為鹿科動(dòng)物梅花鹿（Cervus nipportTemminck）四肢的筋，性溫，味淡微咸，具有壯筋骨、續(xù)勞損等功效，可用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、腰膝軟弱等疾病[1?2]。鹿筋含有豐富的膠原蛋白、氨基酸，作為藥食同源的名貴中藥材，營養(yǎng)及藥用價(jià)值極高，因而需要測定鹿筋的氨基酸種類及含量[3]，目前已有一些文獻(xiàn)對(duì)鹿筋的氨基酸組成及其含量進(jìn)行了研究。

王曉通等[4]采用聚類分析的定性研究方法分析了鹿產(chǎn)品中17 種水解氨基酸的含量；龐博等[5]利用柱前衍生化法測定了鹿筋中氨基酸的含量。機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)主要是由于細(xì)胞炎癥因子的過度釋放，其中NO、IL-6 為典型的致炎因子，通過抑制細(xì)胞分泌致炎因子，可達(dá)到一定的抗炎效果[6?8]，故抗炎功效與降低細(xì)胞炎癥因子的含量水平密切相關(guān)?，F(xiàn)代研究表明鹿筋蛋白具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，孫曉迪等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹿筋膠原通過抑制炎性細(xì)胞因子IL-lβ和TNF-α的釋放從而減輕小鼠的炎性反應(yīng)。由于鹿筋膠原在抗炎方面表現(xiàn)出良好的活性，氨基酸作為構(gòu)成膠原蛋白的基本單位，鹿筋酶解過程中氨基酸組成及含量的變化可能會(huì)影響抗炎活性，近幾年的報(bào)道僅對(duì)鹿筋的氨基酸組成及含量進(jìn)行了測定，并沒有研究氨基酸組成及含量的變化與抗炎活性之間的關(guān)系，不能全面地評(píng)價(jià)酶解法對(duì)鹿筋品質(zhì)特征的影響，因此本研究具有一定意義。

本研究篩選鹿筋天然蛋白（DSNP）和鹿筋酶解蛋白（DSEP）中對(duì)MH7A 細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)的活性組分，測定了活性組分的氨基酸組成、含量以及細(xì)胞炎癥因子分泌量，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析[10?11]，揭示其特征差異氨基酸，并篩選出潛在具有抗炎活性的氨基酸，初步探索鹿筋的藥用價(jià)值與其氨基酸組成及含量變化的相關(guān)性，為鹿筋的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿筋 吉林省東鰲鹿業(yè)科技開發(fā)有限公司；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（MH7A） 廣東吉尼歐生物技術(shù)公司；牛血清蛋白 上海源葉生物科技有限公司；噻唑藍(lán)（MTT） 美國Amersco 公司；TNF-α北京索萊寶科技有限公司；NO、IL-6 試劑盒 長春百金生物科技有限公司；堿性蛋白酶（20000 U/mg） 上海寶曼生物科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基 美國Hyclone 公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

pH 計(jì) 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；1、3、10 kDa 超濾離心管 Millipore；680 型酶標(biāo)儀日本TAKARA 公司；HERAEUS HERAcell 150 CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司；L-8900 型氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；Alpha1-2LDplus 冷凍干燥機(jī)德國CHRIST 凍干機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 DSNP 樣品制備 稱取5.0 g 鹿筋，剪碎成8 mm×8 mm 的小塊，按料液比1:20 g/mL 溶于水中，于80 °C 下磁力攪拌8 h[12]，過濾，微濾，濾液用超濾離心管進(jìn)行超濾分級(jí)（1、3、10 kDa 超濾離心管），按不同分子量分為：DSNP 總提物、DSNP>10 kDa 組分、DSNP 3～10 kDa 組分、DSNP 1～3 kDa、DSNP<1 kDa， 依 次 命 名 為 DSNP-1、 DSNP-2、DSNP-3、DSNP-4、DSNP-5，?40 ℃真空冷凍干燥，制得凍干粉備用。

1.2.1.2 DSEP 樣品制備 稱取一定量的DSNP-1 凍干粉，加入一定量的水，超聲溶解，選用堿性蛋白酶，經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)篩選，在酶解最適條件下（溫度50 ℃、pH9.0、底物濃度3%、酶底比1%）酶解5 h，酶解后沸水浴加熱15 min 滅酶，冷卻至室溫，3600 r/min 離心15 min 取上清液[13]，超濾分級(jí)方法同“1.2.1.1”節(jié)，所獲得組分依次命名為DSEP-1、DSEP-2、DSEP-3、DSEP-4、DSEP-5，?40 ℃凍干備用。

1.2.2 MH7A 細(xì)胞培養(yǎng) MH7A 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[14]。

1.2.3 DSNP 和DSEP 不同超濾組分對(duì)MH7A 細(xì)胞增殖抑制的影響 實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置空白組、模型組、給藥組，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以5×104個(gè)/mL 接種于96 孔板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，除空白組（加DMEM高糖培養(yǎng)液）外，其余各組加入終濃度為60 ng/mL的TNF-α100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，給藥組分別加入終濃度為50 μg/mL 的DSNP-1～DSNP-5 和DSEP-1～DSEP-5 溶液進(jìn)行給藥干預(yù)，培養(yǎng)24 h 后每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長處的吸光度OD 值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次[15]。

1.2.4 不同質(zhì)量濃度DSNP-5、DSEP-5 對(duì)MH7A 細(xì)胞增殖抑制的影響 按“1.2.4”項(xiàng)下方法，給藥組分別加入25、50、100、200 μg/mL 的DSNP-5、DSEP-5 溶液100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，培養(yǎng)4 h 后棄去上清，加入150 μLDMSO，振蕩10 min，于490 nm 波長處測其OD 值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.2.5 DSNP-5、DSEP-5 對(duì)MH7A 細(xì) 胞 釋 放NO、IL-6 含量水平的影響 細(xì)胞給藥培養(yǎng)24 h 后（分別加入50 μg/mL DSNP-1～DSNP-5 和DSEP-1～DSEP-5溶液，25、50、100、200 μg/mL 的DSNP-5、DSEP-5 溶液進(jìn)行給藥干預(yù)），吸取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測NO、IL-6 的釋放量，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次[16]。

1.2.6 氨基酸含量的測定

1.2.6.1 檢測樣品制備 稱取10 mg 鹿筋DSNP-5、DSEP-5 樣品各6 份，分別加入10 mL 濃度為6 mol/L的鹽酸溶液中，110 °C 水解24 h，用氨基酸分析儀進(jìn)行測定[17]。

1.2.6.2 色譜條件 色譜柱：P/N 855-3507 色譜柱（4.6 mm×60 mm）,分離柱內(nèi)填料為3 μm 磺酸型陽離子交換樹脂；柱溫50 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。將得到的18 個(gè)氨基酸峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P14.0（Umetrics,Umea,Sweden）軟件中進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用主成分分析（principal component analysis, PCA）、偏最小二乘法（partial least squares, PLS）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonalPLS-DA, OPLSDA）[18?20]，找出酶解前后DSNP-5、DSEP-5 的差異氨基酸，采用灰色關(guān)聯(lián)度（the grey relational degree analysis, GRA）和偏最小二乘法（partial least squares,PLS），篩選抑制MH7A 細(xì)胞分泌炎癥因子的氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSNP 和DSEP 不同超濾組分對(duì)MH7A 細(xì)胞的增殖抑制作用

由表1 可知，與空白組相比，模型組能顯著促進(jìn)MH7A 細(xì)胞的增殖（P<0.05）；在50 μg/mL 質(zhì)量濃度下，給藥組中DSNP-5、DSEP-5 對(duì)MH7A 細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，分別為56.99%、52.68%，與其他給藥組相比具有顯著性差異（P<0.05），故選擇DSNP-5、DSEP-5 做進(jìn)一步研究。

表1 不同超濾組分的DSNP 和DSEP 對(duì)MH7A 細(xì)胞的增殖抑制作用Table 1 Inhibitory effect of different ultrafiltration fractions DSNP and DSEP on the proliferation of MH7A cells

2.2 不同質(zhì)量濃度DSNP-5、DSEP-5 對(duì)MH7A 細(xì)胞的增殖抑制作用

由表2 可知，TNF-α誘導(dǎo)劑能顯著促進(jìn)MH7A細(xì)胞的增殖（P<0.05），在25～200 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著DSNP-5、DSEP-5 質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)向上升后下降的趨勢，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)，DSNP-5、DSEP-5 對(duì)MH7A 細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，與其他給藥組相比具有顯著性差異（P<0.05），在25～200 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與DSEP-5 組相比，DSNP-5 抑制MH7A 細(xì)胞增殖的能力更強(qiáng)，具有顯著性差異（P<0.05）。

表2 不同質(zhì)量濃度的DSNP-5、DSEP-5 對(duì)MH7A 細(xì)胞的增殖抑制作用Table 2 Inhibitory effects of different concentrations of DSNP-5 and DSEP-5 on the proliferation of MH7A cells

結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的DSNP-5、DSEP-5 均可不同程度的抑制MH7A 細(xì)胞增殖，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)，對(duì)MH7A 細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，抑制率分別為77.60%、68.03%。

2.3 DSNP-5、DSMP-5 對(duì)MH7A 細(xì)胞NO、IL-6 分泌量的影響

2.3.1 對(duì)MH7A 細(xì)胞釋放NO 的影響 NO 是炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)的發(fā)展與歸轉(zhuǎn)中起著多種作用，具有代表性意義，過度釋放NO，會(huì)引發(fā)炎癥，造成組織損傷[21]。由圖1 可知，與空白組相比，模型組可以顯著誘導(dǎo)MH7A 細(xì)胞分泌NO（P<0.05）；隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，NO 的分泌量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其中，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，NO 分泌量達(dá)到最低，顯著低于其他給藥組（P<0.05），抑制作用最強(qiáng)，與DSEP-5 相比，DSNP-5 抑制MH7A 細(xì)胞釋放NO 的能力更強(qiáng)（P<0.05）。

圖1 DSNP-5、DSEP-5 對(duì)MH7A 細(xì)胞NO 分泌量的影響Fig.1 Effects of DSNP-5 and DSEP-5 on NO secretion of MH7A cells

2.3.2 對(duì)MH7A 細(xì)胞釋放IL-6 的影響 IL-6 作為刺激因子，在炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色[22]，由圖2 可知，與空白組相比，TNF-α模型組可以顯著誘導(dǎo)MH7A 細(xì)胞分泌IL-6（P<0.05）；與TNF-α模型組相比，質(zhì)量濃度在25～200 μg/mL 范圍內(nèi)，各劑量組均可不同程度地下調(diào)IL-6 的含量水平，有顯著性差異（P<0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL 時(shí)，IL-6 的分泌量達(dá)到最低，顯著低于其他給藥組（P<0.05），效果最佳，與DSEP-5 相比，DSNP-5 抑制MH7A 細(xì)胞釋放IL-6 的能力更強(qiáng)（P<0.05）。

圖2 DSNP-5、DSEP-5 對(duì)MH7A 細(xì)胞IL-6 分泌量的影響Fig.2 Effects of DSNP-5 and DSEP-5 on IL-6 secretion in MH7A cells

結(jié)果表明DSNP-5、DSEP-5 能抑制MH7A 細(xì)胞炎癥因子的釋放，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)，炎癥因子NO、IL-6 釋放量達(dá)到最低，效果最顯著。由此推測DSNP-5、DSEP-5 可能通過抑制炎癥因子（NO、IL-6）的釋放，減緩細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到抗炎的效果。同時(shí)DSNP-5、DSEP-5 對(duì)炎癥因子NO、IL-6 抑制的最佳濃度（100 μg/mL）與對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的最佳濃度（100 μg/mL）一致，推測可能是由于DSNP-5、DSEP-5 抑制MH7A 細(xì)胞釋放兩種炎癥因子NO、IL-6，降低炎癥因子含量水平，從而抑制了MH7A 細(xì)胞的增殖。與DSEP-5 相比，DSNP-5 對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞炎癥因子分泌的抑制能力更強(qiáng)，具有顯著性差異（P<0.05），推測酶解過程中可能使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或成分發(fā)生了變化從而降低了生物活性。

2.4 DSNP-5 和DSEP-5 氨基酸的組成與含量

DSNP-5、DSEP-5（每組樣品數(shù)量n=6）的氨基酸種類和含量測定結(jié)果見表3。從表3 中可以看出，DSNP-5、DSEP-5 均含有18 種氨基酸，說明酶解前后的氨基酸組成基本一致，但含量有所差異。甘氨酸的含量是DSNP-5、DSEP-5 氨基酸總含量中占比最高的，分別為31.01%、28.91%，且DSNP-5 的甘氨酸含量高于DSEP-5 的甘氨酸含量，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道甘氨酸與炎癥密切關(guān)聯(lián)[23?24]，當(dāng)LPS 刺激機(jī)體時(shí)，炎癥模型中甘氨酸合成減少、含量下降，抗炎的作用機(jī)制可能是與受體特異性結(jié)合或抑制炎癥細(xì)胞因子的合成與分泌，由此推測甘氨酸含量的高低與鹿筋蛋白的抗炎效果有一定的關(guān)系。

表3 DSNP-5、DSEP-5 的氨基酸組成及含量（ ±s，n=3）Table 3 Aminoacid composition and content of DSNP-5 and DSEP-5（±s，n=3）

表3 DSNP-5、DSEP-5 的氨基酸組成及含量（ ±s，n=3）Table 3 Aminoacid composition and content of DSNP-5 and DSEP-5（±s，n=3）

注：*：表示必需氨基酸。

氨基酸種類 DSNP-5（%） 氨基酸種類 DSEP-5（%）天冬氨酸（Asp） 5.27±0.033g 天冬氨酸（Asp） 4.76±0.025g蘇氨酸（Thr）* 2.01±0.024l 蘇氨酸（Thr）* 1.95±0.016m絲氨酸（Ser） 4.35±0.011h 絲氨酸（Ser） 4.65±0.019h谷氨酸（Glu） 8.57±0.017d 谷氨酸（Glu） 8.74±0.024d甘氨酸（Gly） 31.01±0.013a 甘氨酸（Gly） 28.91±0.018a丙氨酸（Ala） 10.63±0.028b 丙氨酸（Ala） 12.00±0.014b半胱氨酸（Cys） 2.64±0.026k 半胱氨酸（Cys） 2.74±0.013k纈氨酸（Val）* 1.32±0.015o 纈氨酸（Val）* 1.92±0.026n蛋氨酸（Met）* 0.60±0.023q 蛋氨酸（Met）* 0.67±0.020q異亮氨酸（Ile）* 1.45±0.011n 異亮氨酸（Ile）* 1.39±0.010p亮氨酸（Leu）* 2.91±0.019j 亮氨酸（Leu）* 2.82±0.025j酪氨酸（Tyr） 0.39±0.014r 酪氨酸（Tyr） 0.29±0.022r苯丙氨酸（Phe）* 1.78±0.020m 苯丙氨酸（Phe）* 2.04±0.017l賴氨酸（Lys）* 3.34±0.012i 賴氨酸（Lys）* 3.73±0.034i組氨酸（His） 1.24±0.016p 組氨酸（His） 1.54±0.019o精氨酸（Arg） 5.67±0.017f 精氨酸（Arg） 6.10±0.011f脯氨酸（Pro） 10.20±0.031c 脯氨酸（Pro） 9.27±0.021c羥脯氨酸（Hyp） 6.62±0.020e 羥脯氨酸（Hyp） 6.48±0.027e必需氨基酸 13.41 必需氨基酸 14.52總和 100.00 總和 100.00

2.5 DSNP-5 和DSEP-5 的氨基酸多元統(tǒng)計(jì)分析

采用PCA 分析法對(duì)DSNP-5、DSEP-5 所含氨基酸進(jìn)行分析，所得結(jié)果見圖3。從圖3 中可以看出，PCA 法可以將DSNP-5 和DSEP-5 分開，二者存在一定差異，推測可能是由于酶解過程中肽鍵的斷裂造成了氨基酸含量的變化。進(jìn)一步采用OPLS-DA分析，而OPLS-DA 分析的基礎(chǔ)為PLS 模型的驗(yàn)證，采用排列實(shí)驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，在PLS-DA 模型參數(shù)中R2和Q2分別表示對(duì)數(shù)據(jù)的解釋程度和對(duì)模型的預(yù)測能力，從圖4 中可以看出，PLS-DA 模型排列實(shí)驗(yàn)中左端任何一次隨機(jī)變量y變量產(chǎn)生的R2、Q2值均小于右端的原始值,表明模型有效（R2=0.443,Q2=?0.53）。

圖3 鹿筋DSNP-5 及DSEP-5 的PCA 分析散點(diǎn)圖Fig.3 PCA analysis of DSNP-5 and DSEP-5 for deer sinew

圖4 鹿筋DSNP-5 及DSEP-5 的PLS-DA 模型圖Fig.4 PLS-DA model diagram of DSNP-5 and DSEP-5 of deer sinew

OPLS-DA 分析散點(diǎn)圖見圖5，OPLS-DA 分析可以最大程度地將DSNP-5、DSEP-5 分離，并且降低樣本的組內(nèi)差異，更準(zhǔn)確地找出二者之間的差異氨基酸。由OPLS-DA 分析得到DSNP-5、DSEP-5 的VIP 值見表4，選取VIP>1，表示其差異性貢獻(xiàn)率大于其他組分，找出酶解前后DSNP-5、DSEP-5 所含的差異氨基酸分別是Phe、Asp、Pro、Arg、Lys、Gly、Glu、Cys、Ala 和Hyp。

表4 DSNP-5、DSEP-5 組分基于OPLS-DA 分析的VIP 值Table 4 VIP results of DSNP-5 and DSEP-5 components based on OPLS-DA analysis

圖5 鹿筋DSNP-5 及DSEP-5 的OPLS-DA 分析散點(diǎn)圖Fig.5 OPLS-DA of DSNP-5 and DSEP-5 analyzed scatter plots

通過PCA 分析得到了酶解前后DSNP-5、DSEP-5中的特征差異氨基酸，但未能篩選出抑制MH7A 細(xì)胞活性的氨基酸。故本研究以抑制MH7A 細(xì)胞炎癥因子（NO、IL-6）釋放量作為活性指標(biāo)，應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度（GRA）分析和偏最小二乘法（PLS）篩選出鹿筋抑制MH7A 細(xì)胞分泌NO、IL-6 細(xì)胞炎癥因子的氨基酸。

灰色關(guān)聯(lián)分析的目的是確定參考序列和若干個(gè)比較序列之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度，尋求系統(tǒng)中各個(gè)因素間的主要關(guān)系[25]。使用EXCEL 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，將DSNP-5、DSEP-5 的氨基酸含量Xi（自變量）設(shè)為比較數(shù)列（子序列）；MH7A 分泌的炎癥因子（NO、IL-6）的含量Xo（因變量）設(shè)為參考序列（母序列），將對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)輸入到EXCEL 表中，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，得到各個(gè)氨基酸對(duì)抑制MH7A炎癥因子分泌活性的貢獻(xiàn)程度排名：Lys>Phe>Ser>Arg>Ala>Met>Glu>Leu>Cys>Ile>Val>Thr>His>Gly>Pro>Asp>Hyp>Tyr（NO）；Lys>Arg>Leu>Glu>Ala>Ser>Phe>Ile>Thr>Gly>Cys>Met>Pro>Asp>Hyp>Val>His>Tyr（IL-6）。關(guān)聯(lián)度>0.7 時(shí)，認(rèn)為子序列與母序列之間存在一定關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明（見表5），Lys、Phe、Ser、Arg、Ala、Met、Glu、Leu、Cys、Ile、Val、Thr、Gly 與抑制NO、IL-6 含量水平相關(guān)，由此可以看出DSNP-5、DSEP-5 抑制MH7A 分泌炎癥因子活性是多種氨基酸共同作用的結(jié)果。

表5 DSNP-5、DSEP-5 的氨基酸含量與抗炎指標(biāo)的關(guān)聯(lián)序和關(guān)聯(lián)度Table 5 Correlation order and correlation degree of amino acid content andanti-inflammatory index of DSNP-5 and DSEP-5

偏最小二乘回歸法是一種能廣泛使用的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，該方法集多元線性回歸分析、主成分分析、典型相關(guān)分析基本功能于一體，與其他統(tǒng)計(jì)方法相比，具有計(jì)算簡單、建模效果好、解釋性強(qiáng)、預(yù)測性較高等優(yōu)點(diǎn)[26?27]。利用SIMCA-P14.1 軟件，經(jīng)過多次提取主成分，多次迭代，擬合出酶解前后DSNP-5、DSEP-5 的氨基酸含量與抑制MH7A 細(xì)胞炎癥因子NO、IL-6 分泌活性數(shù)據(jù)之間的數(shù)理方程：Y=?0.11230XAsp?0.06724XThr?0.11420XSer+0.0319 6XGlu?0.10012XGly+0.07324XAla+0.05723XCys+0.01513XMet?0.10235XIle+0.0061XLeu?0.00608X Tyr+0.07580XPhe+0.12093XLys+0.03706XVal+0.12401XHis+0.07391XArg?0.07735XPro?0.02773 XHyp (NO)；Y=?0.12345XAsp?0.12381XThr+0.04279 XSer?0.00482XGlu?0.08449XGly+0.09871XAla?0.04969XCys+0.01149XMet?0.11810XIle?0.11237 XLeu?0.04932XTyr+0.07780XPhe+0.08740XLys+0.17387XVal+0.13180XHis+0.07661XArg?0.09188 XPro?0.01731XHyp（IL-6）（XAsp～XHyp 為氨基酸含量豐度，Y 為酶解前后鹿筋抑制MH7A 細(xì)胞釋放炎癥因子NO、IL-6 的活性）。

相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值大小反映對(duì)MH7A 細(xì)胞炎癥因子NO、IL-6 分泌活性抑制的貢獻(xiàn)程度，絕對(duì)值越大，貢獻(xiàn)程度越大，相關(guān)系數(shù)的符號(hào)反映與抑制MH7A 細(xì)胞炎癥因子NO、IL-6 分泌活性的相關(guān)性[28]，由于炎癥因子釋放量與藥效呈負(fù)相關(guān)，故相關(guān)系數(shù)為負(fù)值的氨基酸是對(duì)藥效的貢獻(xiàn)氨基酸。各氨基酸對(duì)抑制MH7A 細(xì)胞炎癥因子NO 分泌活性貢獻(xiàn)絕對(duì)值大小順序?yàn)椋篐is>Lys>Ser>Asp>Ile>Gly>Pro>Phe>Arg>Ala>Thr>Cys>Val>Glu>Hyp>Met>Leu>Tyr，其中Asp、Thr、Gly、Ile、Tyr、Pro、Hyp 與活性呈負(fù)相關(guān)，各氨基酸對(duì)抑制MH7A 細(xì)胞炎癥因子IL-6 分泌活性貢獻(xiàn)絕對(duì)值大小順序?yàn)椋篤al>His>Thr>Asp>Ile>Leu>Ala>Pro>Lys>Gly>Phe>Arg>Cys>Tyr>Ser>Hyp>Met>Glu，其中Asp、Thr、Glu、Gly、Cys、Ile、Leu、Tyr、Pro、Hyp 與活性呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)見表6。

表6 DSNP-5、DSEP-5 的氨基酸含量與抗炎指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficient of amino acid content andantiinflammatory index of DSNP-5 and DSEP-5

綜合三種分析方法，多元統(tǒng)計(jì)分析VIP 值>1，灰色相關(guān)度>0.7，與活性呈負(fù)相關(guān)的特征性氨基酸為Gly。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DSNP-5、DSEP-5 在體外抗炎實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖抑制活性，能夠抑制MH7A 細(xì)胞分泌炎癥因子（NO、IL-6），與DSEP-5 相比，DSNP-5 對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞炎癥因子分泌的抑制能力更強(qiáng)，具有顯著性差異（P<0.05）。將多元統(tǒng)計(jì)分析篩選出的特征差異氨基酸（VIP 值>1）、PLS（相關(guān)系數(shù)>0.7）、GRA（活性呈負(fù)相關(guān)）結(jié)果相結(jié)合，分析得到Gly 是特征差異性成分。DSNP-5 的Gly 含量（31.01%）高于DSEP-5 的Gly 含量（28.91%），Gly 參與了許多重要生理活性分子的合成，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用，可通過抑制炎癥因子的分泌來降低炎癥損傷[29?30]，而在相同濃度下，DSNP-5 較DSEP-5 抗炎效果好，可能是由于DSNP-5 所含的Gly 含量更高，具有更好的抗炎效果，但是DSNP-5 中的Gly 含量的高低與DSNP-5 抑制MH7A 細(xì)胞分泌活性的能力強(qiáng)弱的內(nèi)在關(guān)系尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。