陳穎， 曹伊媛， 陸杰， 張慧倩， 岳華， 梁琨， 王新宏

（1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082）

急性胰腺炎是一種病情險惡、并發(fā)癥多、病死率較高的急腹癥，基本病機為腑氣不通，中醫(yī)學治療應始終貫徹“通里攻下”的思想[1]。大承氣湯是經(jīng)典的“通里攻下”方劑，出自張仲景的《傷寒論》，由大黃、厚樸、枳實、芒硝4味中藥組成。方中：大黃蕩滌腸胃，泄熱瀉結(jié)為君；芒硝軟堅潤燥，瀉熱通便為臣；厚樸、枳實行氣破結(jié)，消痞除滿為佐。四藥相和，綜瀉下、軟堅、消痞、除滿之用，可用于治療“痞滿燥實”為主要表現(xiàn)的腸梗阻、胰腺膽道疾病等多種疾病[2]。在臨床上，加用大承氣湯優(yōu)于單獨常規(guī)西藥治療急性重癥胰腺炎，具有良好的臨床應用前景[3]。本課題組前期采用膽胰管注射?；悄懰徕c法建立急性胰腺炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大承氣湯可明顯改善模型大鼠的胰腺損傷。同時，本課題組運用超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-LTQ-Orbitrap-MS）技術(shù)對大承氣湯主要化學成分進行了快速的分析和鑒定[4]。

分子對接（molecular docking）根據(jù)“鎖-鑰原理”通過化學計量學方法來模擬和預測蛋白質(zhì)受體與藥物小分子之間的結(jié)合力，是一種高效快速的藥物篩選手段，對藥效物質(zhì)與作用機制研究具有重要意義[5-6]。表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是一種無標記型光學檢測手段，通過測定共振角的變化檢測生物分子間的相互作用，可為中藥的活性成分分析以及對應蛋白靶點的鑒定提供有力支撐[7]。

為進一步發(fā)現(xiàn)大承氣湯治療急性胰腺炎的潛在分子機制，本研究立足于中醫(yī)藥整體觀和系統(tǒng)論，通過分子對接與網(wǎng)絡藥理學研究，篩選主要活性化合物和關(guān)鍵靶蛋白，以SPR 技術(shù)驗證活性成分及潛在靶標親和力并評估其抵抗疾病的活性[8]，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 試藥胡蘿卜苷（批號：B20517）、和厚樸酚（批號：B20498）、柚皮素（批號：B21596）、大黃素-1-O-葡萄糖苷（批號：B27009）購自于上海源葉生物科技有限公司；厚樸酚（批號：AB0682-0020）、歐前胡素（批號：AB0831-0020）、柚皮苷（批號：AB1848-0020）、橙皮苷（批號：AB0714-0020）購自于成都埃法生物科技有限公司。

1.2 儀器Biacore T200 生物分子相互作用分析系統(tǒng)（GE Healthcare 公司）；CM-5 芯片購自于GE Healthcare公司。

2 方法

2.1 大承氣湯活性成分篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺（TCMSP）（http：//sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php/）搜集大承氣湯中4 味中藥的化學成分。篩選類藥性（DL）≥0.18、口服利用度（OB）≥30%的化學成分結(jié)合已發(fā)表文獻中報道過的重要活性成分，共同組成主要活性成分庫。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）查找化合物的 SMILES 結(jié)構(gòu)，導入 Discovery Studio 2016（DS）軟件，轉(zhuǎn)化成3D結(jié)構(gòu)，保存其mol2格式。

2.2 急性胰腺炎靶點預測及篩選在DrugBank 數(shù)據(jù) 庫（https：//www.drugbank.ca/）和 TTD 數(shù) 據(jù) 庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）中搜索與急性胰腺炎相關(guān)的靶點，并使用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對檢索到的靶點進行命名規(guī)范化處理。PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）提供靶點的x-ray 晶體結(jié)構(gòu)，優(yōu)先選擇Resolution 值小、配體不是金屬離子，且有小分子與蛋白結(jié)合示意圖的靶點結(jié)構(gòu)，作為分子對接的受體。

2.3 化合物與疾病靶點的分子對接將靶點蛋白導入DS 軟件，去除蛋白中水分子，準備蛋白，使其易與小分子化合物對接。最后，選擇Libdock 模式，對接公差設置為0.25，進行靶點和化合物的分子對接，把原配體與蛋白靶點對接所得的分數(shù)作為基礎值，篩選出比之前分數(shù)高的化合物，即說明兩者之間親和力更高，結(jié)合較好。若對接失敗，則上調(diào)對接公差至0.5。

2.4 成分-靶點蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建根據(jù)分子對接結(jié)果，通過Cytoscape 3.6.2 軟件“File”“Import”“Import Network from File System”構(gòu)建大承氣湯化學成分和疾病靶點的互作網(wǎng)絡圖來分析成分與靶點之間的相互作用關(guān)系。

2.5 生物功能及通路的富集分析將篩選出的疾病靶點基因名輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）“Multiple proteins”，物種設置為“Homosapiens”，其余參數(shù)設置為保持默認，進行基因本體（gene ontology，GO）生物學功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路分析，統(tǒng)計富集信息。以錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）作為篩選條件。

2.6 SPR技術(shù)測定活性成分與靶點蛋白的親和力

2.6.1 蛋白芯片固定 將蛋白通過1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）/N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）偶聯(lián)活化固定在CM5 芯片上，然后根據(jù)蛋白的等電點篩選蛋白質(zhì)固定在CM5 芯片的最佳 pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5），濃度（20、50、100 μg/mL）摸索，以確保較多的蛋白固定于蛋白芯片上，其蛋白質(zhì)的偶聯(lián)包括3 步：EDC/NHS 的活化；蛋白質(zhì)的偶聯(lián)；乙醇胺封閉蛋白質(zhì)多余的結(jié)合位點。

2.6.2 化合物檢測液配制 精密稱定大黃素-1-O-葡萄糖苷、胡蘿卜苷、厚樸酚、和厚樸酚、歐前胡素、柚皮素、柚皮苷、橙皮苷對照品適量，分別以二甲基亞砜（DMSO）溶液溶解制成適當濃度的對照品貯備液。取各對照品儲備液適量，再分別加入 DMSO 溶液和 1.05×磷酸緩沖鹽（PBS）溶液，制備成濃度為256 μmol/L 的對照品溶液，用流動相溶液依次稀釋成濃度為128、64、32、16、8、4 μmol/L的對照品溶液。

2.6.3 親和力檢測 設定結(jié)合目標蛋白的流通池為檢測通道，未結(jié)合目標蛋白的流通池為參比通道，流通池的流速為10 μL/min。同時，將待測物注入目標蛋白流通池和參比流通池，使結(jié)合反應在22～24 ℃的條件下進行，分別取上述配制梯度的對照品溶液進行檢測，流動相采用含5.0%DMSO的1.05 × PBS 溶液，結(jié)合時間為60 s，流速為30 μL/min，解離時間為180 s，同時配制溶劑校正（solvent correction）曲線的8 個濃度點，范圍為含4.5% ～ 5.5% DMSO 的PBS 溶液，以消除溶劑對表面折光率的影響。

2.6.4 親和曲線擬合 進樣完成后，進行數(shù)據(jù)處理，親和曲線擬合用Biacore T200 軟件進行評估，將穩(wěn)態(tài)親和力模型（1∶1）用于曲線擬合。繪制靶點蛋白與單體化合物的結(jié)合曲線，即SPR 光譜圖，并且計算獲得動力學參數(shù)如最大結(jié)合濃度（Kd）、最大響應值（Rmax）、偏移量（Offset）和卡方檢驗統(tǒng)計（Chi2）。

3 結(jié)果

3.1 大承氣湯活性成分分析由TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到大黃有92 個成分，枳實有65 個成分，厚樸有139 個成分。芒硝為硫酸鹽礦物藥，化學式為Na2SO4·10H2O，不計入后續(xù)研究。篩選并納入文獻報道的其他活性成分[9]，共收集到37 個化合物。澤蘭黃醇素、大黃素甲醚二葡糖苷、大黃酸、決明內(nèi)酯、胡蘿卜苷等12 個成分源自大黃；桉葉醇、和厚樸新酚、厚樸酚、和厚樸酚等4個成分源自厚樸；異橙黃酮、5，7，4-三甲氧基黃酮、異櫻花素-7-蕓香糖甙、柚皮素、橙皮素、木犀草素、橙皮苷、柚皮苷等21個成分源自枳實。

3.2 急性胰腺炎靶點的信息通過搜索DrugBank數(shù)據(jù)庫和TTD 數(shù)據(jù)庫，共獲取430個與急性胰腺炎相關(guān)的疾病靶點。篩選出文獻報道較多，且具有配體及X 線晶體結(jié)構(gòu)的疾病蛋白32 個，具體靶點信息見表1。

表1 急性胰腺炎潛在的靶點信息Table 1 Potential targets information for acute pancreatitis

3.3 分子對接分析將上述篩選出的37個成分與32個靶點進行分子對接。結(jié)果顯示：454條對接良好的信息，每個成分均可以與一個或多個蛋白靶點結(jié)合良好。其中，橙皮苷、柚皮苷、和厚樸酚、大黃素-1-O-葡萄糖苷、歐前胡素、厚樸酚、柚皮素、胡蘿卜苷的親和力較高，其分別與26、22、21、21、20、19、19、19 個蛋白結(jié)合較好，對接得分見表2。

表2 8個化合物與蛋白靶點Docking Score值Table 2 Docking Score values of 8 compounds and targets

其中，厚樸酚和細胞間黏附分子1（ICAM-1）蛋白之間的對接相互作用如圖1-A、B 所示，厚樸酚母核中的羥基與ICAM-1 蛋白中的氨基酸GLU87、VAL89 可形成常規(guī)氫鍵，其鍵長范圍為1.0-1.6?，其苯環(huán)與VAL89 具有疏水結(jié)合Pi-Alkyl 作用，該化合物與ICAM-1對接能量為-8.540 87 KJ/mol。歐前胡素和ICAM-1 的分子相互作用如圖1-C、D 所示，歐前胡素母核結(jié)構(gòu)主要與ICAM-1中的氨基酸殘基VAL1123、ARG88 形成疏水結(jié)合Pi-Alkyl 作用，同時，母核上的羰基與VAL89 形成常規(guī)氫鍵，其鍵長范圍為1.0-1.6?，增加了分子與蛋白的結(jié)合，該化合物與ICAM-1對接能量為-13.485 6 KJ/mol。

圖1 ICAM-1與厚樸酚（A、B），歐前胡素（C、D）的二維及三維分子對接模式Figure 1 2D and 3D molecular docking patterns of ICAM-1 with magnolol（A，B），Ammidin（C，D）

歐前胡素-絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）蛋白對接的相互作用如圖2-A、B 所示，苯環(huán)的中心結(jié)構(gòu)與TRP197 形成了π-π相互作用力，又與氨基酸LYS249、LEU246 形成疏水結(jié)合Pi-Alkyl 作用，母核結(jié)構(gòu)上的羰基與ASN201 形成氫鍵，其鍵長范圍為0.9-1.6 ?。

圖2 MAPK14與歐前胡素的二維及三維分子對接模式（A、B）Figure 2 2D and 3D molecular docking patterns of MAPK14 with Ammidin（A，B）

3.4 成分-靶點互作分析將成分與疾病靶點通過Cytoscape 3.6.2 軟件構(gòu)建活性成分-靶點蛋白網(wǎng)絡圖（見圖3）。紅色橢圓形為大黃成分，綠色三角形為厚樸成分，粉色菱形為枳實成分，該網(wǎng)絡由66個節(jié)點（nodes）和454 條邊（edges）組成，只有29 個蛋白顯示出與大承氣湯成分對接良好。根據(jù)參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，ICAM1、MAPK11、MAPK14、ERN1、RAF1、CASP3度值分別為30、30、29、27、27、26。

圖3 大承氣湯“活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡圖Figure 3 “Active ingredient-disease target”network diagram of Da Chengqi Decoction

3.5 生物功能和信號通路分析將32個作用靶點導入SRTING 數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)參數(shù)錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）值，篩選出靶點蛋白富集的前10 條富集GO功能，包括生物過程（biological process，BP）、分子 功 能（molecular function， MF）和 細 胞 組 成（cellular component，CC），結(jié)果如圖4 顯示。這些靶點參與的生物過程有細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞對化學刺激的反應、分子功能的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等；分子功能主要與蛋白激酶活性、藥物結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等關(guān)系密切；細胞組成主要富集在胞漿、胞質(zhì)部分、膜結(jié)合細胞器等部位。KEGG 富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點蛋白主要參與了癌癥信號通路、AGE-RAGE 信號通路、FoxO 信號通路、細胞凋亡信號通路、JAK/STAT 信號通路等，分別有 15、9、9、9、9 個蛋白富集在上面，表明這些信號通路與急性胰腺炎緊密相關(guān)。FDR排名前20條信號通路，見圖5。

圖4 大承氣湯治療急性胰腺炎的基因本體（GO）分析（A、B、C）Figure 4 GO analysis of Da Chengqi Decoction for treatment of acute pancreatitis（A，B，C）

圖5 大承氣湯治療急性胰腺炎的KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis of Da Chengqi Decoction for treatment of acute pancreatitis

3.6 活性成分與靶點蛋白的親和作用分析采用SPR生物傳感器檢測活性成分橙皮苷、柚皮苷、和厚樸酚、大黃素-1-O-葡萄糖苷、歐前胡素、厚樸酚、柚皮素、胡蘿卜苷與關(guān)鍵靶點ICAM1、MAPK14、過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPAR-γ）之間的親和力。其中，ICAM-1 和MAPK14 為“成分-靶點”圖預測的關(guān)鍵蛋白，PPAR-γ 為文獻報道的重要靶點。結(jié)果顯示，8 個化合物與ICAM-1反應作出的擬合曲線中，厚樸酚、歐前胡素與ICAM-1 親和力較好，如圖6 所示。厚樸酚、歐前胡素的解離常數(shù)Kd值較小，各親和力參數(shù)如表3所示。

表3 大承氣湯主要活性成分和ICAM -1之間的親和力動力學參數(shù)Table 3 Affinity kinetic parameters between active compounds and ICAM-1 in Da Chengqi Decoction

圖6 ICAM -1蛋白與大承氣湯主要活性成分結(jié)合SPR分析擬合圖Figure 6 SPR fit plot of ICAM-1 protein and Da Chengqi Decoction active components binding

在對MAPK14 表現(xiàn)出高響應和良好親和力的化合物中，歐前胡素可作出擬合曲線且顯示出較好的親和力，如圖 7 所示。Kd為 19.07 μmol·L-1，Rmax為3.665，Offset為-3.754，Chi2為0.755。

圖7 MAPK14蛋白與歐前胡素結(jié)合SPR分析擬合圖Figure 7 SPR fit plot of MAPK14 protein binding with active component

大黃素-1-O-葡萄糖苷、和厚樸酚、厚樸酚、胡蘿卜苷、歐前胡素與PPAR-γ反應可作出擬合曲線，如圖8 所示。其中，大黃素-1-O-葡萄糖苷、和厚樸酚、厚樸酚、胡蘿卜苷、歐前胡素Kd值較小，說明與PPAR-γ親和力較好，各親和力參數(shù)如表4所示。

表4 大承氣湯主要活性成分和PPAR-γ之間的親和力動力學參數(shù)Table 4 Affinity kinetic parameters between Da Chengqi Decoction active compounds and PPAR-γ

4 討論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學探討了大承氣湯治療急性胰腺炎預測靶點可能參與的生物過程和作用通路。GO 基因功能注釋結(jié)果表明，大承氣湯治療急性胰腺炎的相關(guān)靶點主要在胞漿、胞質(zhì)部分、膜結(jié)合細胞器等部位發(fā)生蛋白激酶活性、藥物結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子反應，參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞對化學刺激的反應、分子功能的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程。KEGG 富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點蛋白通過癌癥信號通路、AGE-RAGE 信號通路、FoxO 信號通路、細胞凋亡信號通路、JAK/STAT 信號通路等調(diào)控急性胰腺炎。

此外，通過分子對接篩選出了大承氣湯治療急性胰腺炎的8個活性成分，這些化合物來自于不同的中藥且與較多的急性胰腺炎相關(guān)靶點顯示出親和力。大黃素-1-O-葡萄糖苷、胡蘿卜苷是大黃的活性成分；厚樸酚、和厚樸酚為厚樸的活性成分；橙皮苷、柚皮苷、歐前胡素、柚皮素為枳殼的活性成分。ICAM1、MAPK11、MAPK14、ERN1、RAF1、CASP3 為分子對接結(jié)果中度值較高的蛋白，進一步證實了中藥“多成分-多靶點”干預疾病的整體觀。

ICAM-1 在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，其介導異質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)之間的粘附，并參與一系列重要的生理和病理過程，例如免疫、炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移等[10]。在嚴重急性胰腺炎患者引發(fā)的免疫反應中，可見T淋巴細胞的抑制活性升高，嗜中性粒細胞的吞噬活性降低，黏附分子ICAM-1 活化異常[11]。Li 等[12]發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎大鼠胰腺和肝組織中ICAM-1的表達較高，并且抗炎作用與ICAM-1 表達的降低有關(guān)。MAPK 是一種促分裂原活化蛋白激酶，MAPK 通過細胞內(nèi)信號通路傳輸體內(nèi)的炎癥反應，并在急性胰腺炎的形成機理中起重要作用[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，重癥急性胰腺炎早期MAPK14 活性上調(diào)，釋放了炎癥細胞因子，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應，加重全身炎癥反應綜合征，通過控制MAPK14 活性可能是緩解炎癥反應的有效途徑[14]。PPAR-γ與急性胰腺炎嚴重程度相關(guān)，重癥急性胰腺炎大鼠的胰腺及肺臟組織中PPAR-γ表達上調(diào)，有研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥通過降低PPAR-γ表達，加重重癥急性胰腺炎炎癥程度[15]。

采用SPR技術(shù)對ICAM-1、MAPK14和PPAR-γ蛋白與大承氣湯治療急性胰腺炎的8個化合物進行親和力檢測。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 個蛋白均可以與1個或多個成分顯示出較好的結(jié)合力。現(xiàn)有的報道證實了SPR 的結(jié)果，厚樸酚可抑制NF-κB 信號通路降低ICAM-1 的表達，發(fā)揮抗炎作用[16]。歐前胡素在人類單核細胞系U937 泡沫細胞中對ICAM-1表達具有抑制作用[17]。故推測ICAM-1 蛋白在大承氣湯治療急性胰腺炎的過程中發(fā)揮著重要作用。歐前胡素也能抑制MAPK14 的磷酸化，減少膠原沉積和炎癥細胞滲出[18]，這些研究側(cè)面驗證了SPR實驗的有效性。PPAR-γ為3 個蛋白中與化合物結(jié)合力最好的蛋白，然而這一蛋白在分子對接結(jié)果中并未體現(xiàn)出優(yōu)越性。這一結(jié)果可能與網(wǎng)絡藥理學和SPR技術(shù)的局限性有關(guān)。

網(wǎng)絡藥理學的數(shù)據(jù)信息主要依賴于文獻數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫，收錄的信息可能存在偏倚。目前的網(wǎng)絡分析技術(shù)仍然有限，虛擬計算結(jié)果呈現(xiàn)假陰性的可能性較高。SPR技術(shù)計算主要是在體外動態(tài)模擬化合物與蛋白芯片的相互結(jié)合，體外的虛擬計算無法全面反映出藥物的體內(nèi)作用狀態(tài)。基于此，本課題組下一步將會從網(wǎng)絡分析和體外研究，延伸至分子水平、細胞水平和整體動物水平等不同層面展開研究，以期闡明大承氣湯在體內(nèi)對靶蛋白的作用情況以及大承氣湯通過調(diào)節(jié)AGERAGE 信號通路、JAK/STAT 信號通路等改善急性胰腺炎的分子生物學機制。