盧丹， 彭小蘭， 熊珊， 郭小琴， 李婷

（1.鄂州市中心醫(yī)院急診科，湖北鄂州 436000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬鄂州市中醫(yī)醫(yī)院急診科，湖北鄂州 436000）

胰腺癌（pancreatic cancer）是一種惡性程度很高、診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤。胰腺癌早期的確診率不高，但手術(shù)死亡率卻非常高，且治愈率非常低[1]。盡管手術(shù)技術(shù)和輔助藥物治療均有所改善，但胰腺癌發(fā)病率和死亡率仍明顯上升，且1年生存率仍不足30%，5年生存率僅為2%[2]。因此，迫切需要開發(fā)新的抗胰腺癌藥物。天然產(chǎn)物提取物作為新的治療來源已廣受關(guān)注。高良姜為姜科植物高良姜Alpiniao fficinarumHance 的根莖，味辛，性溫，入脾胃經(jīng)，具有溫經(jīng)、祛風(fēng)、散寒、行氣、止痛等功效，主治脾胃中寒、脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、噎嗝反胃、食滯、癔病、冷癖等病證。高良姜素（galangin）是一種主要提取于高良姜中的黃酮醇類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[3]。已有研究表明，高良姜素可抑制喉癌[4]、鼻咽癌[5]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[6]、宮頸癌[7]、肺癌[8]等腫瘤生長。Kwak 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高良姜素通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4 活性來抑制Smad3 接頭磷酸化，從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。因此，本研究進(jìn)一步觀察高良姜素對胰腺癌PCNA-1 細(xì)胞的凋亡、自噬及對移植瘤的影響，探討其抗胰腺癌機(jī)制，以期為胰腺癌的治療提供參考數(shù)據(jù)，為高良姜素的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

圖1 高良姜素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Galangin chemical structure

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)胰腺癌PCNA-1 細(xì)胞購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。PCNA-1 細(xì)胞以含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 動(dòng)物24 只 SPF 級 4 ～ 6 周齡雌性 BALB/c 裸鼠，購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SYXK（川）2017-203。裸鼠在25 ℃12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)，自由飲水、飲食。在實(shí)驗(yàn)前1周開始適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.3 藥物、試劑與儀器高良姜素（HPLC≥98%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品，批號：548-83-4）；順鉑（浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號：PHR1624）。RPMI-1640 培養(yǎng)液（上海栩冉生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）；胱天蛋白酶（Caspase）-3 抗體、Caspase-9 抗體、B 細(xì)胞淋巴瘤蛋白2（Bcl-2）抗體、Bcl-2 相關(guān)的 X 蛋白（Bax）抗體、微管相關(guān)蛋白l 輕鏈3（LC3）抗體（武漢碧云天生物科技有限公司）；P62抗體、Beclin1抗體（沈陽萬類生物科技有限公司）；液泡分選蛋白34（Vps34）抗體、Atg7 抗體、Atg5 抗體（上海艾博抗生物科技有限公司）；絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抗體、磷酸化MAPK（p-MAPK）抗體（上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司）；MAPK siRNA 質(zhì)粒由上海生工設(shè)計(jì)并合成。Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀購自美國ThermoFisher 公司；ChemiDocTMXRS 凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司。

1.4 體外研究

1.4.1 MTT 法檢測細(xì)胞相對存活率 將PCNA-1細(xì)胞接種于96 孔板上，1×103個(gè)/孔，用含高良姜素（0、5、10、20、40、80、150 μmol·L-1）的培養(yǎng)基于37 ℃分別處理12、24、48 h 后，移除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，加入20 μL MTT（5 g·L-1）溫育 4 h。每孔再加入 150 μL 二甲基亞砜在搖床低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測定各孔490 nm 波長處的光密度值，計(jì)算細(xì)胞相對存活率。細(xì)胞相對存活率=實(shí)驗(yàn)組光密度值/0 μmol·L-1高良姜素組光密度值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 分組與處理 先設(shè)置空白對照組、陽性藥物對照組、高良姜素低、中、高劑量組，PCNA-1細(xì)胞密度為1 × 106個(gè)/mL。其中：空白對照組，PCNA-1 細(xì)胞以含 0 μmol·L-1高良姜素的培養(yǎng)基正常培養(yǎng)24 h；陽性藥物對照組，用含有40 μmol·L-1順鉑[10]的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；高良姜素低、中、高劑量組分別用含有20、40、80 μmol·L-1高良姜素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

再設(shè)置空白對照組、高良姜素高劑量組、MAPK siRNA 組、高良姜素+MAPK siRNA 組，其中：空白對照組，PCNA-1 細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h；高良姜素高劑量組，用含有80 μmol·L-1高良姜素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；MAPK siRNA 組，應(yīng)用Lipofectamine 2000 將 MAPK siRNA（50 nmol/L）轉(zhuǎn)染PCNA-1 細(xì)胞后，用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；MAPK siRNA+高良姜素組，用Lipofectamine 2000 將MAPK siRNA（50 nmol/L）轉(zhuǎn)染PCNA-1 細(xì)胞后，用含有80 μmol·L-1高良姜素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組PCNA-1細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后，離心，按 1 × 106個(gè)/mL 密度重懸。于細(xì)胞懸液中加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin-V-FITC）和5 μL 碘化丙啶（PI），在黑暗的房間里孵育15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.4.4 蛋白免疫印跡法檢測PCNA-1 細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ/LC3I、P62、Vps34、Beclin1、Atg7、Atg5、p-MAPK/MAPK蛋白相對表達(dá)水平 收集細(xì)胞，用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒檢測蛋白濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。再經(jīng)過脫脂牛奶室溫蛋白封閉2 h、一抗（1∶1 000 稀釋）4 ℃ 封閉過夜、二抗（1∶3 000 稀釋）室溫封閉1 h等過程，滴電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑曝光。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，使用Quantity One 軟件分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。

1.5 體內(nèi)研究將24 只裸鼠隨機(jī)分為模型對照組、高良姜素組、MAPK siRNA組、高良姜素+MAPK siRNA 組，每組6 只。模型對照組和高良姜素組裸鼠右后肢腹側(cè)皮下分別注射0.2 mL 1×107個(gè)/mL培養(yǎng) 24 h 的 PCNA-1 細(xì)胞；MAPK siRNA 組和高良姜素+MAPK siRNA 組裸鼠右后肢腹側(cè)皮下分別注射0.2 mL 1 × 107個(gè)/mL-1培養(yǎng)24 h的轉(zhuǎn)染MAPK siRNA的PCNA-1 細(xì)胞。然后，繼續(xù)在SPF 條件下給予正常飲食飼養(yǎng)，高良姜素組和高良姜素+MAPK siRNA 組每天癌旁注射80 mg·kg-1高良姜素溶液，其余2組注射等體積生理鹽水，觀察裸鼠皮下成瘤情況。30 d后，頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下移植瘤，測定移植瘤體積，稱量瘤質(zhì)量，蛋白免疫印跡法檢測瘤組織Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、Beclin1、Atg7、Atg5、p-MAPK/MAPK的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，圖形使用GraphPad Prism 6.0 構(gòu)建。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，方差齊，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩組比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高良姜素對胰腺癌PCNA-1 細(xì)胞存活的影響表1 結(jié)果顯示，在處理12 h 時(shí)，80 ～160 μmol·L-1高良姜素處理組PCNA-1 細(xì)胞相對存活率明顯降低（P< 0.05）；在處理24 h 時(shí)，20 ～160 μmol·L-1高良姜素處理組 PCNA-1 細(xì)胞相對存活率明顯降低（P< 0.05 或P< 0.01）；在處理48 h時(shí)，10～160 μmol·L-1高良姜素處理組PCNA-1細(xì)胞相對存活率明顯降低（P< 0.05 或P< 0.01）。綜上，后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選擇 20、40、80 μmol·L-1高良姜素處理PCNA-1細(xì)胞24 h。

表1 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞相對存活率比較Table 1 Comparison of the relative survival rate of PCNA-1 cells in various groups（，%）

表1 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞相對存活率比較Table 1 Comparison of the relative survival rate of PCNA-1 cells in various groups（，%）

①P < 0.05，②P < 0.01，與 0 μmol·L-1 高良姜素組（空白對照組）比較

48 h 100.00±1.13 87.52±1.34 72.45±1.19①61.03±1.04②54.73±1.12②46.64±1.15②36.18±1.24②高良姜素濃度（μmol·L-1）處理時(shí)間051 0 20 40 80 160 12 h 100.00±1.21 97.54±1.14 95.72±1.32 90.63±1.01 84.97±1.18 73.19± 1.11①64.28± 1.15①24 h 100.00±1.04 94.46±1.18 91.23±1.07 82.17±1.15①65.16±1.26①55.68±1.06②48.86±1.14②

2.2 高良姜素促進(jìn)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡圖2和表2結(jié)果顯示，與空白對照組比較，高良姜素低劑量組PCNA-1細(xì)胞凋亡率升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），高良姜素中、高劑量組和陽性藥物對照組PCNA-1細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05或P< 0.01），表明高劑量高良姜素具有類似順鉑的藥效，能誘導(dǎo)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡。

表2 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of the cell apoptosis rate of PCNA-1 cells in various groups（）

表2 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of the cell apoptosis rate of PCNA-1 cells in various groups（）

①P<0.05，②P<0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組高良姜素低劑量組高良姜素中劑量組高良姜素高劑量組陽性藥物對照組細(xì)胞凋亡率（%）4.59±0.94 13.19±1.12 21.67±1.05①39.88±1.08②41.21±1.11②

圖2 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞散點(diǎn)圖Figure 2 The flow cytometry scatter plots for the cell apoptosis rate of PCNA-1 cells in various groups

圖3和表3 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，高良姜素低劑量組PCNA- 1 細(xì)胞Caspase- 3、Caspase-9、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），高良姜素中、高劑量組和陽性藥物對照組PCNA-1 細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P< 0.05 或P< 0.01），進(jìn)一步證明高劑量高良姜素具有類似順鉑的藥效，能誘導(dǎo)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡。

表3 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白相對表達(dá)比較Table 3 Comparison of the expression levels of cell apoptosis-related proteins in PCNA-1 cells of various groups（）

表3 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白相對表達(dá)比較Table 3 Comparison of the expression levels of cell apoptosis-related proteins in PCNA-1 cells of various groups（）

①P<0.05，②P<0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組高良姜素低劑量組高良姜素中劑量組高良姜素高劑量組陽性藥物對照組Bcl-2 0.63±0.02 0.55±0.03 0.43±0.05①0.24±0.04②0.19±0.03②Caspase-3 0.05±0.02 0.17±0.03 0.36±0.05①0.54±0.04②0.56±0.05②Caspase-9 0.04±0.02 0.19±0.04 0.41±0.03①0.65±0.05②0.68±0.04②Bax 0.16±0.03 0.37±0.04 0.46±0.04①0.58±0.03②0.61±0.05②

圖3 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白的蛋白免疫印跡電泳條帶Figure 3 The Western blotting strips of cell apoptosisrelated proteins in PCNA-1 cells of various groups

2.3 高良姜素促進(jìn)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞自噬圖4和表4結(jié)果顯示，與空白對照組比較，高良姜素低劑量組PCNA-1細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Vps34、Beclin1、Atg7、Atg5 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，P62 蛋白表達(dá)水平下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），高良姜素中、高劑量組和陽性藥物對照組PCNA-1 細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Vps34、Beclin1、Atg7、Atg5 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05或P<0.01），P62蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P< 0.05 或P< 0.01），進(jìn)一步證明高劑量高良姜素具有類似順鉑的藥效，能誘導(dǎo)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞自噬。

表4 各組胰腺癌自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)比較Table 4 Comparison of the expression levels of autophagy-related proteins in PCNA-1 cells of various groups（）

表4 各組胰腺癌自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)比較Table 4 Comparison of the expression levels of autophagy-related proteins in PCNA-1 cells of various groups（）

①P<0.05，②P<0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組高良姜素低劑量組高良姜素中劑量組高良姜素高劑量組陽性藥物對照組Atg5 0.08±0.03 0.16±0.03 0.30±0.04①0.48±0.03②0.51±0.05②LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.04±0.02 0.11±0.04 0.24±0.03①0.38±0.03②0.42±0.04②P62 0.75±0.05 0.63±0.06 0.41±0.03①0.34±0.04②0.32±0.05②Vps34 0.09±0.03 0.18±0.05 0.32±0.03①0.53±0.05②0.55±0.04②Beclin1 0.11±0.04 0.19±0.04 0.35±0.04①0.61±0.05②0.63±0.04②Atg7 0.49±0.05 0.61±0.05 0.73±0.04①0.85±0.05②0.87±0.04②

圖4 各組胰腺癌自噬相關(guān)蛋白的蛋白印跡電泳條帶Figure 4 The Western blotting strips of autophagyrelated proteins in PCNA-1 cells of various groups

2.4 高良姜素使胰腺癌PCNA-1 細(xì)胞MAPK活化圖5 和表5 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，高良姜素低劑量組PCNA-1 細(xì)胞p-MAPK/MAPK 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），高良姜素中、高劑量組和陽性藥物對照組PCNA-1 細(xì)胞p-MAPK/MAPK 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P< 0.05 或P< 0.01），進(jìn)一步證明高劑量高良姜素具有類似順鉑的藥效，能使胰腺癌PCNA-1細(xì)胞MAPK活化。

表5 各組PCNA-1細(xì)胞MAPK蛋白活化水平比較Table 5 Comparison of the activation level of MAPK in PCNA-1 cells of various groups（）

表5 各組PCNA-1細(xì)胞MAPK蛋白活化水平比較Table 5 Comparison of the activation level of MAPK in PCNA-1 cells of various groups（）

①P<0.05，②P<0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組高良姜素低劑量組高良姜素中劑量組高良姜素高劑量組陽性藥物對照組p-MAPK/MAPK 0.15±0.03 0.29±0.04 0.41±0.05①0.56±0.04②0.52±0.05②

圖5 PCNA-1細(xì)胞MAPK的蛋白印跡電泳條帶Figure 5 The Western blotting strips of MAPK in PCNA-1 cells of various groups

2.5 高良姜素通過活化MAPK促進(jìn)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞的凋亡和自噬圖6 ～ 8 和表6 ～ 8 結(jié)果顯示：與空白對照組和MAPK siRNA 組比較，高良姜素+MAPK siRNA組細(xì)胞凋亡率，Caspase-3、Caspase-9、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、Vps34、Beclin1、Atg7、Atg5 蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與高良姜素高劑量組比較，高良姜素+MAPK siRNA 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.01），Caspase-3、Caspase-9、Bax 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P< 0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P<0.01），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Vps34、Beclin1、Atg7、Atg5 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.01），P62蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P<0.01）。說明高良姜素通過活化MAPK 促進(jìn)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞的凋亡和自噬。

表6 各組PCNA-1細(xì)胞干擾MAPK后凋亡率比較Table 6 Comparison of the apoptosis rate of PCNA-1 cells in various groups after interfering MAPK（）

表6 各組PCNA-1細(xì)胞干擾MAPK后凋亡率比較Table 6 Comparison of the apoptosis rate of PCNA-1 cells in various groups after interfering MAPK（）

①P<0.01，與空白對照組比較；②P<0.01，與高良姜素高劑量組比較

細(xì)胞凋亡率（%）5.33±0.94 40.67±1.08①3.11±1.09 4.06±0.89②組別空白對照組高良姜素高劑量組MAPK siRNA組高良姜素+MAPK siRNA組

圖6 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞干擾MAPK后凋亡的流式細(xì)胞散點(diǎn)圖Figure 6 The flow cytometry scatter plots for the apoptosis of PCNA-1 cells in various groups after interfering MAPK

圖7 各組胰腺癌PCNA-1細(xì)胞干擾MAPK后凋亡標(biāo)記蛋白的蛋白免疫印跡電泳條帶Figure 7 The Western blotting strips of apoptosisrelated proteins in PCNA-1 cells of various groups after interfering MAPK

圖8 各組胰腺癌干擾MAPK后細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的蛋白免疫印跡電泳條帶Figure 8 The Western blotting strips of autophagyrelated proteins in PCNA-1 cells of various groups after interfering MAPK

表7 各組PCNA-1細(xì)胞干擾MAPK后凋亡標(biāo)記蛋白相對表達(dá)比較Table 7 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in PCNA-1 cells of various groups after interfering MAPK （）

表7 各組PCNA-1細(xì)胞干擾MAPK后凋亡標(biāo)記蛋白相對表達(dá)比較Table 7 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in PCNA-1 cells of various groups after interfering MAPK （）

①P<0.01，與空白對照組比較；②P<0.01，與高良姜素高劑量組比較

組別空白對照組高良姜素高劑量組MAPK siRNA組高良姜素+MAPK siRNA組Bcl-2 0.62±0.02 0.21±0.04①0.79±0.04 0.68±0.05②Caspase-3 0.06±0.03 0.56±0.03①0.02±0.01 0.04±0.02②Caspase-9 0.05±0.02 0.67±0.03①0.02±0.01 0.03±0.02②Bax 0.17±0.03 0.61±0.04①0.07±0.03 0.12±0.04②

表8 各組PCNA-1細(xì)胞干擾MAPK后胰腺癌自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)比較Table 8 Comparison of the expression levels of autophagy-related proteins in PCNA-1 cells of various groups after interfering MAPK （）

表8 各組PCNA-1細(xì)胞干擾MAPK后胰腺癌自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)比較Table 8 Comparison of the expression levels of autophagy-related proteins in PCNA-1 cells of various groups after interfering MAPK （）

①P<0.01，與空白對照組比較；②P<0.01，與高良姜素高劑量組比較

組別空白對照組高良姜素高劑量組MAPK siRNA組高良姜素+MAPK siRNA組Atg5 0.09±0.04 0.47±0.04①0.03±0.02①0.07±0.03②LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.05±0.02 0.39±0.04①0.02±0.02 0.04±0.03②P62 0.76±0.05 0.34±0.03①0.88±0.05 0.79±0.05②Vps34 0.09±0.02 0.52±0.05①0.04±0.03 0.06±0.03②Beclin1 0.13±0.04 0.62±0.04①0.08±0.03 0.11±0.04②Atg7 0.48±0.03 0.87±0.03①0.34±0.05①0.41±0.03②

2.6 高良姜素通過活化MAPK抑制胰腺癌PCNA-1移植瘤生長圖9 和表9 結(jié)果顯示，與模型對照組比較，高良姜素組胰腺癌PCNA-1移植瘤的體積和質(zhì)量均明顯減?。≒< 0.01）；與高良姜素組比較，高良姜素+ MAPK siRNA 組胰腺癌PCNA-1 移植瘤的體積和質(zhì)量均明顯增加（P< 0.01）；與MAPK siRNA 組比較，胰腺癌PCNA-1 移植瘤的體積和重量無明顯變化（P<0.01）。說明高良姜素通過活化MAPK抑制胰腺癌PCNA-1移植瘤生長。

圖9 各組胰腺癌PCNA-1移植瘤大小肉眼比較Figure 9 Comparison of the macroscopic sizes of xenografts in various groups

表9 各組裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量比較Table 9 Comparison of the volume and mass of xenografts of nude mice in various groups（）

表9 各組裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量比較Table 9 Comparison of the volume and mass of xenografts of nude mice in various groups（）

①P < 0.01，與模型對照組比較；②P < 0.01，與高良姜素組比較

質(zhì)量（g）1 672.34±15.32 698.48±11.52①1 784.22±14.67 1 709.23±13.92②組別模型對照組高良姜素組MAPK siRNA組高良姜素+MAPK siRNA組體積（mm3）2 132.25±21.38 931.97±18.86①2 476.45±20.57 2 247.64±19.95②

圖10和表10結(jié)果顯示，體內(nèi)移植瘤中各凋亡及自噬相關(guān)蛋白變化同體外一致，說明在體內(nèi)，高良姜素通過活化MAPK 促進(jìn)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞的凋亡和自噬。

表10 各組胰腺癌移植瘤中凋亡及自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)比較Table 10 Comparison of the expression levels of apoptosis-，autophagy-related proteins in nude mice of various groups after interfering MAPK （）

表10 各組胰腺癌移植瘤中凋亡及自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)比較Table 10 Comparison of the expression levels of apoptosis-，autophagy-related proteins in nude mice of various groups after interfering MAPK （）

①P<0.01，與模型對照組比較；②P<0.01，與高良姜素組比較

組別模型對照組高良姜素組MAPK siRNA高良姜素+MAPK siRNA Atg5 0.10±0.03 0.51±0.03①0.04±0.03①0.07±0.04②Caspase-3 0.08±0.03 0.62±0.04①0.03±0.02 0.06±0.03②Caspase-9 0.09±0.03 0.68±0.05①0.04±0.02 0.06±0.02②Bax 0.23±0.04 0.73±0.05①0.11±0.04 0.18±0.05②Bcl-2 0.61±0.03 0.22±0.04①0.81±0.05 0.74±0.04②LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.07±0.03 0.41±0.05①0.03±0.02 0.05±0.03②P62 0.78±0.04 0.33±0.04①0.87±0.04 0.81±0.04②Beclin1 0.15±0.05 0.66±0.05①0.09±0.03 0.12±0.05②Atg7 0.46±0.04 0.86±0.04①0.34±0.04①0.39±0.04②

圖10 各組胰腺癌移植瘤中凋亡及自噬相關(guān)蛋白的蛋白免疫印跡電泳條帶Figure 10 The Western blotting strips of apoptosis-，autophagy-related proteins in nude mice of various groups after interfering MAPK

3 討論

凋亡作為程序性細(xì)胞死亡的主要機(jī)制，由各種抗細(xì)胞凋亡蛋白和促凋亡蛋白調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是癌癥治療的有效指標(biāo)[11]。Bcl-2蛋白家族，包括促凋亡蛋白（如Bax）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2），在調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中起著重要的作用[12]。Bcl-2 表達(dá)的降低和Bax表達(dá)的增強(qiáng)會導(dǎo)致線粒體膜完整性的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，隨后誘導(dǎo)Caspase-9的活化效應(yīng)切割Caspase-3，從而最終激活共同的下游細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，高良姜素能明顯上調(diào)胰腺癌PCNA-1 細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax 蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，表明高良姜素通過線粒體依賴性途徑對胰腺癌PCNA-1細(xì)胞發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用。

自噬是一種不依賴胱天蛋白酶的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的途徑[14]，被認(rèn)為是抑制癌癥惡性轉(zhuǎn)化和抗癌免疫監(jiān)視所必需的[15]。微管相關(guān)蛋白l 輕鏈3（LC3）Ⅱ是LC3Ⅰ的脂質(zhì)結(jié)合形式，是自噬最常用的標(biāo)記物[16]。p62 具有一個(gè)與LC3 相互作用的區(qū)域，與自噬密切相關(guān)[17]，表達(dá)量越少，自噬活動(dòng)越多[18]。自噬相關(guān)蛋白 Atg5、Atg7 、Beclin1 和Vps34 均在自噬過程中發(fā)揮了重要的作用，可作為自噬發(fā)生的關(guān)鍵標(biāo)志物[19-20]。Li 等[21]研究表明，高良姜素可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡和自噬。本研究結(jié)果顯示，高良姜素明顯上調(diào)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Vps34、Beclin1、Atg7、Atg5蛋白表達(dá)，下調(diào)P62蛋白表達(dá)，表明高良姜素通過誘導(dǎo)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞發(fā)生自噬促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路能夠通過促進(jìn)對p38 蛋白的磷酸化，上調(diào)抑癌基因p53 蛋白的磷酸化，從而抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示，抑制MAPK 明顯逆轉(zhuǎn)高良姜素對胰腺癌PCNA-1 細(xì)胞凋亡和自噬的誘導(dǎo)作用，表明高良姜素通過激活MAPK 通路促進(jìn)胰腺癌PCNA-1細(xì)胞的凋亡和自噬。

綜上所述，高良姜素可以通過誘導(dǎo)凋亡和自噬來有效抑制胰腺癌PCNA-1 細(xì)胞的生長和增殖，該過程可能受到MAPK 通路活性的調(diào)節(jié)。另外，在體內(nèi)的胰腺癌異種移植模型中，高良姜素亦表現(xiàn)出明顯的抗癌活性。據(jù)此，推測高良姜素可能是一種新型且有效的胰腺癌治療藥物。