覃弘毅

摘 要：建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）測(cè)定畜肉中萊克多巴胺的分析方法，樣品經(jīng)提取后通過PCX固相萃取柱凈化。經(jīng)C18色譜柱分離后，通過電噴霧離子源正離子模式（ESI+）進(jìn)行多重反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）。以內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，萊克多巴胺的線性范圍為0.5～10.0 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r為0.999 77，定量限為0.25 μg/kg，加標(biāo)回收率在100.2%～105.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6）為4.0%～5.4%。本方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可用于畜肉中萊克多巴胺的定量及確證分析。

關(guān)鍵詞：畜肉;萊克多巴胺;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

萊克多巴胺是一種人工合成的β-腎上腺受體激動(dòng)劑，在臨床上主要用于治療支氣管哮喘、充血性心力衰竭癥和肌肉萎縮癥等。在飼料中添加萊克多巴胺可使動(dòng)物快速增長(zhǎng)，減少脂肪含量，提高瘦肉率。2021年的3·15晚會(huì)曝光河北滄州青縣“瘦肉精”羊肉流入鄭州的新聞，其中檢出的“瘦肉精”就是萊克多巴胺。若此類肉制品被消費(fèi)者所食用，會(huì)對(duì)其身體健康造成損害[1]。

目前我國(guó)主要推薦使用GB/T 22286—2008進(jìn)行畜肉中萊克多巴胺的監(jiān)督抽檢，但標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)繁雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)于技術(shù)人員實(shí)驗(yàn)操作要求較高。為此，需建立一種穩(wěn)定性、重復(fù)性好，且效率較高的測(cè)定方法[2-4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，Alta）、萊克多巴胺D3標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，Alta），PCX固相萃取柱（60 mg/3 mL，Agela）、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（100 000 units，CNW）、甲醇（HPLC級(jí)，Merck）、乙腈（HPLC級(jí)，Merck）、乙酸銨（HPLC級(jí)，CNW）、甲酸（HPLC級(jí)，CNW）、氨水（HPLC級(jí)，CNW）、超純水（Milli-Q制備）

1.2 儀器與設(shè)備

AB Sciex TripleQuad 4500三重四極桿質(zhì)譜儀、Agilent Infinity 1290II超高效液相色譜儀、IKA MS3渦旋振蕩器、Sigma 2-16 KL冷凍離心機(jī)、Biotage TurboVap 全自動(dòng)樣品濃縮儀、梅特勒 XS205DU電子天平

1.3 樣品處理

稱取2 g試樣于50 mL離心管中，加入8 mL乙酸銨溶液（pH=5.2），混勻，再加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液（100 ng/mL）和50 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，于37 ℃下振蕩16 h。再加入高氯酸調(diào)節(jié)pH值到1.0，于8 000 r/min下離心5 min，取全部上清液過PCX柱（依次用3 mL甲醇、3 mL水活化平衡），控制流速在3 mL/min，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液，抽干，用2 mL5%氨水甲醇洗脫。洗脫液于50 ℃下氮吹至干，加入1 mL5%甲醇水溶液，渦旋10 s混勻，過0.22 μm濾膜，上機(jī)處理。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）;流速：0.4 mL/min;進(jìn)樣體積：5 μL;柱溫：35 ℃;流動(dòng)相A：0.1%甲酸水;流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈;梯度洗脫程序：0～1 min，90%A;1～1.1 min，90%～80%A;1.1～2.2 min，80%A;2.2～2.8 min，80%～5%A;2.8～3.3 min，5%A;3.3～3.4 min，5%～90%A;3.4～4.0 min，90%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）;掃描模式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）;溫度（TEM）：550 ℃;噴霧電壓（IS）：5 500 V;氣簾氣（CUR）：30 psi;霧化氣（GS1）：55 psi;輔助加熱氣（GS2）：55 psi。萊克多巴胺及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1，萊克多巴胺及其內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖見圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)的選擇

在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中使用較多的GB/T 22286—2008，采用沙丁胺醇D3作為萊克多巴胺的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。然而由于性質(zhì)上存在差異，其回收率不高，且不穩(wěn)定，因此本次實(shí)驗(yàn)采用萊克多巴胺的同位素氘代物作為內(nèi)標(biāo)，其在性質(zhì)上更接近本體，因此回收率更好、更加穩(wěn)定。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

GB/T 22286—2008實(shí)驗(yàn)步驟中，經(jīng)高氯酸調(diào)節(jié)pH后的樣品溶液，需使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使萊克多巴胺轉(zhuǎn)化為分子態(tài)，再經(jīng)異丙醇-乙酸乙酯溶液萃取濃縮，復(fù)溶后作為固相萃取上樣溶液。本次實(shí)驗(yàn)直接使用經(jīng)高氯酸調(diào)節(jié)pH后的樣品溶液作為上樣溶液，省去了國(guó)標(biāo)方法中的后續(xù)步驟，節(jié)省前處理時(shí)間。根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，高氯酸調(diào)節(jié)pH為酸性后，萊克多巴胺已成離子狀態(tài)[5]，滿足PCX對(duì)上樣溶液中目標(biāo)物形態(tài)的要求，確保能夠吸附目標(biāo)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的靈敏度及準(zhǔn)確度也未受到明顯影響。

2.3 線性范圍、定量限、回收率和精密度

精密移取萊克多巴胺和萊克多巴胺D3標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，相應(yīng)稀釋成0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL，其中各工作曲線溶液中內(nèi)標(biāo)的濃度為10 ng/mL。依次上機(jī)測(cè)定，擬合線性回歸方程見圖2，為y=0.201 89x-7.582 13×10-4。

在空白樣品中加入適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液。經(jīng)測(cè)定后，以滿足信噪比（S/N）>10且添加回收率RSD（n=6）≤20%的最小加標(biāo)水平作為本方法的定量限（LOQ）。分別按LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ這3個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平設(shè)置6個(gè)平行試樣，結(jié)果均滿足GB/T 27404—2008中關(guān)于方法確認(rèn)的要求[6]，詳見表2。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

取100份樣品作為實(shí)際樣品測(cè)試，其中50份為豬肉、30份為牛肉、10份為羊肉、10份為豬肝，均未檢出萊克多巴胺。盲樣測(cè)試結(jié)果為4.82 μg/kg，準(zhǔn)確度為109%。

3 結(jié)論

本文以常見畜肉為分析樣本，建立了以萊克多巴胺為分析目標(biāo)物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定、快捷、定量限滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。在實(shí)際應(yīng)用中，可為在畜肉中非法添加萊克多巴胺的食品安全處置工作提供高通量的技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)

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[2]潘勝東，葉美君，王立，等.混合型陽離子交換固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉樣中特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克倫特羅殘留[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2018，28（23）：2841-2844.

[3]馬月姣，梁雪燕，孫曉娟，等.萊克多巴胺檢測(cè)方法研究進(jìn)展[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì).[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集.北京：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)，2019：3.

[4]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法：GB/T 22286—2008[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[5]陳小華，汪群杰.固相萃取技術(shù)與應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

[6]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)：GB/T 27404—2008[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.