任妙璇，汪明權(quán)，熊家炳，宋文安，熊 康

（武漢動物園，湖北 武漢 430050）

禽流感（Avian Influenza AI）是由正黏病毒科-A型禽流感病毒（AIV）感染家禽和野生鳥類引起的一種感染和疾病的綜合征。目前已成為危害禽類健康發(fā)展的一種重要傳染源，2006年青海湖發(fā)生野鳥暴發(fā)禽流感疫情，2020年山西也出現(xiàn)了野生天鵝感染禽流感，研究表明，水禽是禽流感病毒的天然宿主，可長期無癥狀攜帶病毒并經(jīng)消化道排毒污染水源而感染其他鳥類或者其他哺乳動物。隨著研究的深入，H5亞型的高致病性禽流感，不僅可以導(dǎo)致水禽發(fā)病死亡，甚至能直接感染人。動物園承擔(dān)著珍稀鳥類異地保護的重要職能，而禽流感病毒嚴(yán)重威脅到園內(nèi)珍禽的健康，丹頂鶴是我國一級保護動物，針對目前國內(nèi)外尚無針對包括丹頂鶴等野生珍禽的專用禽流感疫苗，且免疫方法、劑量無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的情況，為了進一步掌握禽流感H5亞型三價油乳劑滅活疫苗對丹頂鶴免疫效力及免疫期，使丹頂鶴群保持高而持久的抗體水平，對免疫后不同階段的丹頂鶴群進行了抗體水平監(jiān)測，以期掌握其抗體消長規(guī)律，為制定我園丹頂鶴最佳的禽流感免疫程序提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 重組禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗（Re-6、Re-7、Re-8）；生產(chǎn)廠家：易邦生物，由武漢市動物衛(wèi)生監(jiān)督所提供。

1.1.2 檢測試劑禽流感H5亞型HI試驗抗原及禽流感病毒H5亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，由農(nóng)業(yè)部哈爾濱獸醫(yī)研究所研制，武漢市疾病控制中心饋贈。

1.1.3 實驗動物 健康丹頂鶴15只，年齡為0.5～8歲，其中半歲未成年幼鶴1只，雄性；2歲青年鶴8只，雄性2只，雌性6只；6～8歲成年鶴6只，雄性4只，雌性2只，該丹頂鶴群由武漢動物園提供，除半歲的幼鶴未進行禽流感疫苗免疫，其余丹頂鶴每年春秋二季均進行禽流感疫苗免疫。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫前采樣 免疫前對15只受試丹頂鶴腿靜脈采血2mL，對禽流感抗體滴度進行測定。

1.2.2 疫苗接種 對全群丹頂鶴于胸部肌肉注射禽流感病毒H5亞型三價油乳劑滅活疫苗，青年鶴、成年鶴每羽2頭份，未成年鶴每羽1頭份，于免疫后1、2、3、4、8、12、16、20、24周定期采集受試丹頂鶴靜脈血2mL，析出血清，-20℃保存、備用。

1.2.3 應(yīng)用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗進行抗體滴度檢測，具體參照《GB/18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)》。

1.2.4 結(jié)果判定 禽流感H5抗體滴度≥4，判定為免疫合格。

2 結(jié)果

2.1 禽流感疫苗免疫前禽流感抗體檢測結(jié)果

丹頂鶴群疫苗免疫前，禽流感H5亞型抗體滴度分別為成年組抗體滴度水平在免疫前處于較高水平（4.5±1.6），83.3%（6/5）高于或等于4；青年組抗體滴度水平在免疫前也處于較高水平（6.2±1.0）未成年組抗體滴度為0。疫苗免疫后，成年組H5抗體滴度于第2、3、4周相對免疫前顯著升高（P<0.05）,自第5周起抗體水平逐漸穩(wěn)定在一定水平（6.1±0.2），明顯高于免疫前抗體水平。青年組H5抗體滴度于第2、3周相對免疫前顯著升高（P<0.05）,自第5周起抗體水平逐漸穩(wěn)定在一定水平（6.1±0.2），與免疫前無明顯差異。未成年組抗體滴度，在免疫后迅速升至4，在第3周達到頂峰，隨后緩慢下降，于第4周降至4，第16周降至0，20周曾短暫回升至4，隨后再次降至4以下。

3 討論

3.1 我園丹頂鶴種群未出現(xiàn)禽流感感染病例，從本實驗的數(shù)據(jù)來看，成年組及青年組丹頂鶴，在進行疫苗免疫前，抗體滴度均處于較高水平，92.8%（13/14）的抗體滴度高于4，說明我園去年對丹頂鶴群進行的禽流感疫苗免疫仍給予了丹頂鶴有效的保護，本實驗通過對禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗（Re-6、Re-7、Re-8）免疫后，抗體滴度為時半年的監(jiān)測顯示，在免疫6個月后，青年鶴和成年鶴抗體滴度均高于4，再次印證春秋兩次免疫禽流感滅活疫苗，能較好的達到了預(yù)防禽流感的目的。

3.2 半歲未成年鶴禽流感疫苗免疫前，H5抗體滴度為0，說明該?dān)Q母源抗體已完全消失，并從未接觸過禽流感病毒。疫苗免疫后，抗體滴度迅速上升至4，于第4周降至4，第16周降至0，20周曾短暫升至4，隨后降低。為了保證產(chǎn)生足夠的抗體保護幼鶴免于禽流感病毒侵襲，應(yīng)于首免后第4周對該幼鶴進行二次免疫。第20周出現(xiàn)的抗體再次上升的情況，考慮是否該丹頂鶴再次接觸到禽流感病毒，導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3.3 8只青年鶴和6只成年鶴在疫苗免疫后，大多數(shù)有輕微且短暫的不適，但都能保持正常的采食、運動和排泄，其中1只雌性青年鶴和1只雄性成年鶴前后出現(xiàn)較為明顯不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為精神沉郁，采食量下降，體溫升高，雙腿無力，后經(jīng)過2周左右的對癥治療后，均恢復(fù)正常。此不良反應(yīng)考慮是個體存在較為激烈的抗原應(yīng)激反應(yīng)。此外，還有1只雌性青年鶴于免疫第2周出現(xiàn)突發(fā)性死亡，該?dān)Q疫苗免疫后，未見明顯的不良反應(yīng)，死亡前曾在籠舍內(nèi)展翅騰空，后背部落地，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)該?dān)Q腎臟破裂導(dǎo)致死亡，懷疑是地面濕滑導(dǎo)致的意外死亡。此點應(yīng)考慮個體差異及疫苗的注射量，接下來我們可對肌肉注射疫苗劑量進行進一步實驗，減少不良反應(yīng)，以期達到最佳效果。

圖1 免疫不同時間H5抗體滴度

圖2 不同時間成年丹頂鶴組H5抗體滴度

圖3 不同時間青年丹頂鶴組H5抗體滴度