李云洲 岳寧波 陳相儒 李玉龍 曹賀賀 閆見敏 梁 燕

(1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)屬雙生病毒科(Geminiviruses)菜豆金色花葉病毒屬(Begomoviruses)[1]。番茄幼苗感染TYLCV 后，會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p失[2－3]。TYLCV 已成為威脅番茄安全生產(chǎn)的重要病害之一[4－5]，該病毒主要通過煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播[6－7]。粉虱很難控制，所以培育TYLCV 抗性新品種是控制TYLCV 蔓延的重要途徑。目前，已發(fā)現(xiàn)的番茄抗TYLCV 標(biāo)記/基因主要有Ty－1[8－10]、Ty－2[11－12]、Ty－3[10－11]、Ty－4[13]、Ty－5[14－15]和Ty－6[16]，其中Ty－1 和Ty－3 是一對等位基因，在番茄育種中應(yīng)用最為廣泛[17－18]。但是，TYLCV 屬于單鏈DNA(single strand DNA，ssDNA)病毒，易變異，因此造成抗性不穩(wěn)定[19]。

RNAi 是植物抗病毒的重要機(jī)制[20]。通過RNAi技術(shù)抗TYLCV 可以解決因病毒變異而造成的抗性不穩(wěn)定的現(xiàn)象。RNAi 是指在生物體內(nèi)雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)分子所引起的序列特異性降解靶基因，引發(fā)內(nèi)源靶基因沉默的現(xiàn)象。RNAi 現(xiàn)象最先發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)，將dsRNA注入蟲體，可以抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而抑制同源基因的表達(dá)，之后逐漸在昆蟲、植物以及人體中陸續(xù)報(bào)道[20－21]。RNAi 是真核生物中普遍存在的、比較保守的抗病毒機(jī)制。

人工設(shè)計(jì)dsRNA 沉默靶標(biāo)基因已被廣泛應(yīng)用，如將病毒基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)dsRNA 已成功應(yīng)用于馬鈴薯Y 病毒(Potato virus Y，PVY)、大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和TYLCV[22－24]。參與RNAi 過程主要有三類蛋白:Ⅲ型核糖核酸酶蛋白(Dicer-like，DCL)、AGO 蛋白(Argonaute，AGO)、RNA 依賴型RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerases，RDR)。內(nèi)源或外源dsRNA 經(jīng)DCL 酶加工miRNA (microRNA)或siRNA(small interference RNA)，miRNA 或siRNA 與AGO 結(jié)合形成 RNA 沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC 通過堿基互補(bǔ)配對方式降解和干擾靶標(biāo)核酸或病毒，降低病毒的轉(zhuǎn)錄本[25－26]，目前RNAi 技術(shù)已在多種病毒中成功應(yīng)用[27]。

TYLCV 基因組相對比較小，大約2 700～2 800 bp，該病毒基因組含有6 個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF):V1、V2、C1、C2、C3 和C4，其中V1 和C1在病毒的復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用，V1 編碼外殼蛋白(coat protein，CP)，CP 也是病毒顆粒的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，在病毒進(jìn)化過程中相對保守[28－29]。CP 對于病毒的侵染和移動(dòng)是必需的[30]。CP 突變體可以影響病毒的侵染[31]。C1 編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(replication-associated protein，Rep)調(diào)控病毒復(fù)制的開始[32－33]，因此通過RNAi 技術(shù)抑制TYLCVV1 和C1 基因，阻止病毒在植物體內(nèi)繼續(xù)組裝、擴(kuò)繁是植物防御病毒的有效途徑。

本研究利用NCBI 中已登陸TYLCVV1 和C1 基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，通過同源克隆獲得TYLCV 的V1 保守片段tCP和C1 基因保守片段tRep，以這兩段保守序列為靶標(biāo)構(gòu)建RNAi 干擾載體:pFGC5941－rtCP-tCP和 pFGC5941 －rtRep-tRep。以感病番茄TTI1103B－2 為材料，農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得RNA干擾株系RNAi-CP－2 和RNAi-Rep－12，通過實(shí)驗(yàn)室和田間鑒定，研究RNAi TYLCV 病毒關(guān)鍵基因V1 和C1對TYLCV 的抗性，旨在為番茄抗TYLCV 育種提供材料與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄材料TTI1103B－2 來自西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101 及克隆載體為pMD18-T 購于生工生物工程(上海)股份有限公司，pFGC5941 空載體為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所朱德蔚教授饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 RNAi 干擾載體設(shè)計(jì)流程 利用軟件DNAMAN 比對以色列TYLCV(X15656)、中國安徽TYLCV(FJ646611)、 中國上海TYLCV(AM282874)、中國 廣西TYLCV(AF311734)、中國臺灣TYLCV(U88692)、日本TYLCV(AB192966)、泰國TYLCV(X63015)、中國廣東TYLCV(AY602165)、多米尼加TYLCV(AF024715)、波多黎各TYLCV(AY134494)、荷蘭TYLCV(FJ439569)、葡萄牙TYLCV(AF105975)、伊朗TYLCV(AJ132711)、埃及TYLCV(AY594174)、古巴TYLCV(AJ223505)、美國TYLCV(EF539831)、約旦TYLCV(EF054893)、中國楊凌TYLCV(KC293824)等不同TYLCV 基因組序列，選擇其V1 和C1 保守區(qū)tCP、tRep，采用Primer Premier 5.0 分析tCP和tRep并設(shè)計(jì)引物F-tCP/R-tCP和tRep-F/tRep-R(表1)，酶切位點(diǎn)在設(shè)計(jì)引物時(shí)已加兩端[34]。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將目的片段PCR 產(chǎn)物連接到pMD18-T 載體上，構(gòu)建中間載體pMD18-T-tCP和pMD18-T-tRep，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB(Luria-Bertani，LB)固體培養(yǎng)基(氨芐青霉素Amp 50 mg·L－1)，37℃黑暗培養(yǎng)16 h，挑取單菌落送上海桑尼生物科技有限公司測序。提取測序正確的菌落質(zhì)粒，分別對中間載體pMD18-T-tCP、pMD18-TtRep 和pFGC5941 載體酶切，用T4 連接酶將目的片段與載體pFGC5941 連接，構(gòu)建目標(biāo)載體pFGC5941－rtCP-tCP、pFGC5941－rtRep-tRep，再次轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，Baste 抗性篩選目標(biāo)克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。

采用凍融法將目標(biāo)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB 固體培養(yǎng)基(25 mg·L－1利福平、30 mg·L－1卡娜霉素)，28℃黑暗培養(yǎng)直至長出單菌落，并提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得 轉(zhuǎn)基因方法參考趙菁菁等[35]方法，略加修改。選取飽滿的番茄種子，揉搓脫毛5 min，55℃溫湯浸種4～6 h，1.0%NaClO 殺菌25 min，無菌水沖洗5 次，25℃暗培養(yǎng)3 d，待種子發(fā)芽露白后移置3 000 Lux 光強(qiáng)的培養(yǎng)間培養(yǎng)。12 d 后將番茄無菌苗子葉切割成0.5 mm×0.5 mm 小葉盤，在預(yù)培養(yǎng)基[2.0 mg·L－16－芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)＋0.1 mg·L－1吲哚－3－乙酸(indole－3-acetic acid，IAA)]上預(yù)培養(yǎng)2 d，用含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染5 min，于共培養(yǎng)基(2.0 mg·L－16-BA＋0.1 mg·L－1IAA)上暗培養(yǎng)36～48 h，移至抑菌培養(yǎng)基[2.0 mg·L－16-BA＋0.1 mg·L－1IAA＋400 mg·L－1頭孢霉素(Carb)]培養(yǎng)5～10 d，轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基[2.0 mg·L－16-BA＋0.1 mg·L－1IAA ＋0.2 mg·L－1除草劑(Basta) ＋400 mg·L－1Carb]進(jìn)行培養(yǎng)。生根階段為1/2 MS 培養(yǎng)基(0.1 mg·L－1IAA＋300 mg·L－1Carb)[34]。各階段培養(yǎng)基基本組分均為:MS＋3.0%蔗糖＋7.0%瓊脂，1/2 MS培養(yǎng)基中蔗糖為1.5%，pH 值均為5.8。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測 提取Baste 抗性植株及陰性對照(非轉(zhuǎn)基植株)的總DNA 進(jìn)行PCR 分析檢測，以pFGC5941－rtCP-tCP和pFGC5941－rtRep-tRep質(zhì)粒DNA 為陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株總DNA 為陰性對照。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 TYLCV 接種方法 通過帶毒粉虱自然接種TYLCV，具體方法參考文獻(xiàn)[36]。接種30 d 統(tǒng)計(jì)發(fā)病嚴(yán)重度，分級標(biāo)準(zhǔn)，0:無病毒癥狀；1:葉片邊緣黃化；2:葉片嚴(yán)重黃化和葉片卷曲；3:葉片嚴(yán)重卷曲和皺縮；4:葉片嚴(yán)重皺縮[37]。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)病毒含量檢測 溫室接種帶毒粉虱，3 周后拍照，病情鑒定及病情指數(shù)參考李云洲[38]的分級標(biāo)準(zhǔn)。取實(shí)驗(yàn)室粉虱接種6 周左右的轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因葉片，CTAB 法提取總DNA，CP 保守序列tCP用于檢測TYLCV 病毒含量，引物如表1(FtCP/R-tCP)，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s。分別在反應(yīng)循環(huán)數(shù)為14、17、20、23、26、29、32、35 時(shí)各取出一管。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。

用Actin基因作為內(nèi)參(表1)，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；4℃保存。分別在反應(yīng)循環(huán)14、17、20、23、26、29、32、35 時(shí)各取出一管。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。

1.2.7 TYLCV 相關(guān)基因表達(dá)檢測 定量PCR 檢測TYLCV 相關(guān)基因V1、V2、C1、C2、C3 和C4 的相對表達(dá)量，具體方法參考文獻(xiàn)[38－39]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNAi 載體pFGC5941－rtCP-tCP 和pFGC5941－rtRep-tRep 的構(gòu)建

用引物F-tCP/R-tCP、tRep-F/tRep-R 擴(kuò)增得到基因片段tCP(420 bp)、tRep(300 bp)，將目的片段tCP、tRep分別插入pFGC5941 內(nèi)含子CHSA 兩端，其中正向插入的片段為tCP、rtRep，反向插入的片段為rtCP、tRep。干擾載體pFGC5941－rtCP-tCP、pFGC5941－rtCPtCP示意圖如圖1 所示。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測

圖2 泳道1、2 分別為轉(zhuǎn)基因植株No.2 和No.9 cDNA用引物CaMV35S′/CHSA-A 的PCR 產(chǎn)物，而泳道3、4 分別為陰性對照和陽性對照(pFGC5941－rtCP-tCP)。證明植株No.2、No.9 已轉(zhuǎn)入tCP/rtCP并轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖3 泳道1、2 分別為轉(zhuǎn)基因植株No.12 和No.16 cDNA 用引物CHSA-B/OCS3 的PCR 產(chǎn)物，而泳道3、4分別為陰性對照和陽性對照(pFGC5941－rtRep-tRep)。證明轉(zhuǎn)基因植株No.12 和No.16 轉(zhuǎn)入tRep/rtRep并轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株在田間的表型

將野生型(WT)、轉(zhuǎn)基因株系RNAi-CP－2、RNAi-Rep－12 分別移栽于溫室自然接種TYLCV，可以明顯看到，野生型植株發(fā)育遲緩，葉片皺縮、黃化，感病癥狀顯著，而轉(zhuǎn)基因植株無明顯癥狀，發(fā)病程度明顯低于野生型植株(圖4)。通過統(tǒng)計(jì)發(fā)病嚴(yán)重度，發(fā)現(xiàn)RNAi-CP－2 與RNAi-Rep－12 株系發(fā)病嚴(yán)重度分別為1.77和1.33，極顯著低于WT(3.73)(表2)。

表2 RNAi 株系RNAi-CP－2 和RNAi-Rep－12 抗病性評價(jià)Table 2 The evaluation of disease resistance in the tomato plants of RNAi-CP－2 and RNAi-Rep－12

2.4 轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)病毒含量定性檢測

通過半定量PCR 檢測CP 編碼基因V1 的含量，結(jié)果如圖5 所示。無論是CP 干擾株系RNAi-CP－2 還是Rep 干擾株系RNAi-Rep－12 體內(nèi)都存在病毒，但是CP、Rep 干擾株系體內(nèi)病毒CP 模板V1 含量明顯低于對照植株(WT)。RNAi-CP－2、RNAi-Rep－12 株系體內(nèi)病毒含量低，所以直到26 個(gè)循環(huán)才檢測到CP 基因V1，而對照WT 在14 個(gè)循環(huán)就可以檢測到病毒，內(nèi)參基因Actin在26 個(gè)循環(huán)時(shí)才能檢測到，間接證明轉(zhuǎn)基因植株可以抑制病毒模板數(shù)目的增加。

2.5 RNAi 干擾V1、C1 抑制TYLCV 病毒基因的表達(dá)

為了檢測RNAi 干擾V1、C1 株系RNAi-CP－2 和RNAi-Rep－12 對TYLCV 病毒復(fù)制的抑制作用，通過定量PCR 技術(shù)檢測了TYLCV 接種4 周后，6 個(gè)基因V1、V2、C1、C2、C3 和C4 的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示(圖6)，RNAi-CP－2 和RNAi-Rep－12 株系6 個(gè)基因的相對含量極顯著低于WT，更重要的是RNAi-CP－2 株系不僅可以抑制V1 基因的表達(dá)，而且可以抑制TYLCV 其他5 個(gè)基因的表達(dá)，而RNAi-Rep－12 株系不僅可以抑制C1 基因的表達(dá)，同樣可以抑制其他5 個(gè)基因的表達(dá)，表明RNAi 技術(shù)可以抑制病毒基因的表達(dá)，暗示RNAi的傳遞現(xiàn)象。

3 討論

目前，在番茄抗TYLCV 研究領(lǐng)域主要通過化學(xué)方法防止粉虱傳毒，或者常規(guī)育種將野生材料抗性標(biāo)記滲透到栽培品種中[36]，前者不僅會(huì)造成環(huán)境污染，而且會(huì)引起傳毒介體的耐藥性，后者耗時(shí)長，抗性不穩(wěn)定。本研究通過RNAi 技術(shù)將編碼CP 和Rep 的基因V1 和C1 作為靶標(biāo)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入番茄，獲得轉(zhuǎn)基因番茄株系RNAi-CP－2 和RNAi-Rep－12。轉(zhuǎn)基因株系RNAi-CP－2 和RNAi-Rep－12 前期均表現(xiàn)出一定的抗性，對病毒的復(fù)制和擴(kuò)散有一定的抑制作用，延緩病癥的發(fā)生，表明通過RNAi 技術(shù)干擾病毒V1 和C1 基因可以有效提高番茄植株的抗病性。目前RNAi 技術(shù)抗病毒已經(jīng)應(yīng)用于多種雙生病毒[27，40－44]。雖然本研究分別單獨(dú)干擾V1 或C1 基因，但轉(zhuǎn)基因株系TYLCV其他基因的表達(dá)也會(huì)受到抑制，表明RNAi 技術(shù)可以在靶標(biāo)基因附近傳遞干擾，這可能是因?yàn)镽NAi 病毒的一個(gè)基因會(huì)影響病毒的完整性，從而影響其他基因的表達(dá)。Moissiard 等[45]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中RNAi 的傳遞現(xiàn)象需要DCL2 酶(Dicer-like 2，DCL 2)和DCL4酶(Dicer-like 4，DCL 4)參與，RNAi 沉默抑制子可以抑制RNAi 的傳遞現(xiàn)象。

本研究后期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系也會(huì)表現(xiàn)出典型的TYLCV 病毒癥狀，推斷可能是病毒復(fù)制的能力超過轉(zhuǎn)基因植株的干擾能力。很多因素都會(huì)影響RNAi 干擾效果，如DNA 甲基化、干擾序列的不同以及RNAi 沉默抑制子等[41－42]。V2 屬于TYLCV 重要基因之一，具有RNA 沉默抑制子功能，可以抑制RNAi[46]。Zrachya等[41]通過RNAi 技術(shù)干擾TYLCV CP 合成，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可以延遲病癥的出現(xiàn)，但是后期仍會(huì)有病毒癥狀，這與本研究結(jié)果一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)在無病癥植株中可以檢測到病毒的存在，這與前人研究發(fā)現(xiàn)幾乎在所有的抗病材料中都存在病毒復(fù)制的結(jié)論一致[47]，如西農(nóng)2011 攜帶有抗性基因Ty－1/Ty－3，商業(yè)品種(3761，A.B.seeds，Ness Ziona，以色列)攜帶有抗性基因Ty－1，均可檢測到TYLCV[46－47]，但是病毒的相對含量比敏感番茄材料低，說明抗病材料中同樣存在病毒的復(fù)制，可能病毒水平低不足以誘導(dǎo)植株病癥出現(xiàn)。通過RNAi 技術(shù)可以抑制病毒在植株體內(nèi)復(fù)制，降低病毒的相對含量，但如何提高RNAi 抗病毒效果，降低病毒復(fù)制水平，仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過RNAi 技術(shù)干擾TYLCVV1 和C1，可以在一定程度上抑制病毒的復(fù)制與表達(dá)，提高番茄植株對TYLCV 抗性。RNAi 技術(shù)不僅可以干擾病毒靶標(biāo)基因V1 和C1 的表達(dá)，而且可以影響病毒其他4 個(gè)基因V2、C2、C3 和C4 的表達(dá)，暗示RNAi 技術(shù)可以在靶標(biāo)基因附近傳遞蔓延。