譚政委 李 磊 余永亮 許蘭杰 楊紅旗 董 薇馬新明 梁慧珍

(1河南省農業(yè)科學院芝麻研究中心，河南 鄭州 450002；2河南農業(yè)大學信息與管理科學學院，河南 鄭州 450002)

S－腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase，SAMS，EC:2.5.1.6)是植物代謝過程中的一個關鍵酶，它能催化ATP 和甲硫氨酸反應生成S－腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，SAM)[1]。SAM是主要的甲基供體以及乙烯、多胺、生物素生物合成的前體[2－4]。另外，SAM 還具有轉氨丙基[5]、轉硫[6]的作用。乙烯、多胺在植物體內參與了多種生物和非生物脅迫響應過程[7－8]。研究表明，高鹽[9]、干旱[10－11]、高溫[12]、低溫[13]等多種非生物脅迫都能誘導SAMS基因表達上調，并通過過量表達SAMS提高轉基因植物對低溫和干旱的耐受性[14]。

紅花(Carthamus tinctoriusL.)，別名紅藍花、刺紅花、草紅花，是菊科紅花屬一年生雙子葉草本植物，是集油用、藥用和工業(yè)用于一體的特種經濟作物，在世界各地廣泛栽培，在我國已有2 000 多年的栽培歷史[15]。紅花有很強的耐寒、抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等不良環(huán)境條件的特性[16]。紅花適應性強，種植范圍廣，全世界每年種植紅花約110 萬公頃。我國是紅花種植大國，年種植面積3～4 萬公頃，主要分布在新疆、云南、四川、河南等地[17]。目前已從玉米(Zea maysL.)[18]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[19]、紫花苜蓿(Medicago truncatulasubsp. falcata)[14]、蝴蝶蘭(Phalaenopsis amabilis)[20]等植物中克隆得到了SAMS基因并對其相關功能進行了初步研究，但紅花SAMS基因的克隆、表達及其在植物逆境脅迫中的作用尚鮮見報道。本研究通過分析NCBI 數(shù)據庫比對紅花高通量轉錄組數(shù)據，利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術和實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 技術在紅花中克隆SAMS基因的cDNA 全長，命名為CtSAMS1，對其序列進行生物學信息分析，通過qRT-PCR 技術分析其在不同組織、不同發(fā)育時期的表達差異，并研究其在鹽、干旱、低溫脅迫和外源茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(Gibberellin 3，GA3)處理下的表達情況，探究CtSAMS1 在逆境脅迫和激素處理下的響應機制，以期為深入研究CtSAMS1 的功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

豫紅花1 號品種(由河南省農業(yè)科學院芝麻研究所選育)種植于河南省農業(yè)科學院現(xiàn)代農業(yè)研究開發(fā)基地大田中，自然條件下長至開花期，選取5～10 株在開花第1 天的頂果球紅花花冠連同分枝一起剪下，放入1/2 濃度的Hoagland 標準營養(yǎng)液中，移至光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為26±1℃、16 h/8 h(光照/黑暗)，培養(yǎng)24 h 后，分別經NaCl(200 mmol·L－1)、 低溫(4℃)、聚乙二醇6000(polythylene glycol 6000，PEG 6000)(20%)3 種非生物脅迫及MeJA(100 μmol·L－1)、SA(150 μmol·L－1)、ABA(150 μmol·L－1)和GA3(150 μmol·L－1)4 種外源激素處理，每個處理3 次重復，處理0、3、6、12、24 h 后采集紅花花瓣，并立即置入液氮中保存，轉移至－80℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA 提取。

選取大田中自然生長狀態(tài)一致的豫紅花1 號頂果球，在花冠從總苞片中露出的第1(S1 期)、第3(S2 期)、第5(S3 期)、第7 天(S4 期)取樣，為減小試驗誤差，將采集不同植株的不帶子房的花冠均勻混合，每個時間點取3 個重復，將采集的紅花花冠立即置入液氮中保存，轉移至－80℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA 提取。

1.2 紅花CtSAMS1 基因全長的克隆

按照北京華越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit 試劑盒說明書提取盛花期紅花花冠的總RNA，采用M-MLV 反轉錄酶試劑盒(大連寶生物工程有限公司)反轉錄合成單鏈cDNA，用DNAMAN 軟件設計引物(表1)，進行CtSAMS1 基因核心片段克隆，PCR 擴增體系為20 μL，含10×buffer 2 μL，上下游引物(10 μmol·L－1)各1 μL，dNTP(2 mmol·L－1)2 μL，cDNA 模板1 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR 擴增程序為: 95℃變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min?；厥漳康钠?，連接到pMD19-T 載體上，轉入大腸桿菌DH5α，進行測序。根據測序結果設計3′端、 5′ 端引物(表1)，按美國 Clontech 公 司SMARTTM RACE Amplification Kit 說明書，擴增得到3′端、5′端目的片段，將目的片段回收并連入pMD19-T載體 上，轉入大腸桿菌DH5α，進行測序。通過DNAMAN 軟件拼接出CtSAMS1 基因全長序列，根據全長序列設計引物(表1)，進行CtSAMS1 基因全長克隆，通過測序鑒定全長序列是否與拼接結果一致。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 紅花CtSAMS1 生物信息學分析

CtSAMS1 蛋白的氨基酸組成、蛋白質分子質量、理論等電點及穩(wěn)定性等參數(shù)分析通過在線軟件ProtParam tool 完成；通過ExPASy 中的SOPMA 工具對CtSAMS1蛋白的二級結構進行分析；采用SWISS-MODEL 在線軟件預測CtSAMS1 蛋白的三級結構；通過TMHMM Server v2.0 對CtSAMS1 蛋白的跨膜結構域進行分析；CtSAMS1蛋白保守區(qū)預測采用NCBI 的蛋白保守區(qū)數(shù)據庫(conserved domain database，CDD)完成；以CtSAMS1 蛋白序列為模板，通過NCBI 數(shù)據庫Blast P 查找CtSAMS1的同源氨基酸列，找出其他物種中CtSAMS1 蛋白的同源序列，利用DNAMAN 對CtSAMS1 蛋白與其他物種的SAMS1 同源蛋白的同源性進行分析；通過MEGA 7.0 軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)構建CtSAMS1 蛋白系統(tǒng)進化樹，并通過Bootstrap 方法對進化樹進行檢測，Bootstrap 值設置為1 000。

1.4 紅花CtSAMS1 基因在不同組織和不同脅迫時間的表達分析

按照北京華越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit 試劑盒說明書提取不同非生物脅迫和不同激素處理的樣品的總RNA，按照天根生物科技北京有限公司的Fast Quant RT Super Mix 說明書進行逆轉錄反應，根據CtSAMS1 基因全長序列設計qRT-PCR 引物，以Ct60s作為內參基因，引物序列如表1 所示，用天根生物科技北京有限公司的Super Real Pre Mix(SYBR Green)試劑盒進行qRT-PCR 反應，擴增體系20 μL:2×SuperReal Pre Mix 10 μL、上游引物(10 μmol·L－1)0.5 μL、下游引物(10 μmol·L－1)0.5 μL、cDNA 模板5 μL、ddH2O 3 μL。qRT-PCR 反應程序:95℃變性20 s、55℃退火20 s、72℃延伸20 s，擴增45 個循環(huán)，于熒光定量PCR 儀(德國Eppendorf Mastercycler ep Realplex 2.2 Detection System)上進行。相對定量分析采用2－ΔΔCt方法。

2 結果與分析

2.1 紅花CtSAMS1 基因全長cDNA 的克隆

以擬南芥SAMS2(GenBank 登錄號:NP_001078345)氨基酸序列為參考序列，通過BLAST 與NCBI 中的紅花轉錄組數(shù)據比對，擴增獲得紅花CtSAMS的核心片段(圖1-A)，根據核心片段序列設計特異引物，進行3′-RACE 和5′-RACE 擴增(圖1-B)，測序結果表明，3′-RACE 和5′-RACE 擴增片段均勻核心片段序列有重疊區(qū)域，將擴增片段通過DNAMAN 軟件進行組裝，通過NCBI 中的ORF Finder 模塊對CtSAMS的開放閱讀框進行預測，然后根據開放閱讀框序列設計全長引物，進行PCR 擴增，擴增結果如圖1-D 所示，擴增序列的全長為1 173 bp，編碼390 個氨基酸，測序結果與拼接結果一致，將該基因命名為CtSAMS1。

2.2 CtSAMS1 的生物學信息分析

2.2.1 CtSAMS1 理化性質分析、亞細胞定位、跨膜區(qū)域預測 通過ExPASy 中的ProtParam tool 對CtSAMS1基因編碼蛋白的理化性狀進行預測。CtSAMS1 編碼的蛋白相對分子質量為42 677.42，理論等電點為5.64，分子式為C1884H2975N517O581S16，其中該蛋白中甘氨酸含量最高，為9.0%，色氨酸含量最低，為0.8%，不穩(wěn)定系數(shù)為21.99，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)81.72，總平均親水 性(grand average of hydropathiaty，GRAVY) 為－0.300，為親水性蛋白； 利用SignalP5.0 預 測CtSAMS1 無信號肽，利用TMHMM 2.0 預測紅花CtSAMS1 的跨膜區(qū)域，預測結果表明CtSAMS1 沒有跨膜區(qū)域。

2.2.2 CtSAMS1 蛋白的二級結構分析及三維結構預測 通過ExPASY 中的SOPMA 工具預測CtSAMS1 基因編碼蛋白的二級結構，結果顯示CtSAMS1 蛋白的二級結構主要由無規(guī)則卷曲(random coil)組成，共有172個，占比為44.1%，其次為α－螺旋(α-helices)，共有130個，占比為33.33%，有延伸鏈(extended strand)58 個，占比為14.87%，有β－折疊(β-turn)30 個，占比為7.69%。推測無規(guī)則卷曲是其最大量的二級結構元件，而α－螺旋、延伸鏈和β－折疊散布于整個蛋白中(圖2-A)。

將紅花 CtSAMS1 的氨基酸序列通過SWISSMODEL Workspace 在線分析軟件建立了CtSAMS1 的三維結構模型(圖2-B)，三級結構預測結果表明，CtSAMS1 與擬南芥的S－腺苷甲硫氨酸合成酶1(PDB code: 6vcx)序列一致性為89.92%。

2.2.3 CtSAMS1 氨基酸序列分析和系統(tǒng)進化樹分析 利用NCBI 的蛋白保守區(qū)數(shù)據庫(conserved domain database，CDD) 對 CtSAMS1進行保守區(qū)預測，CtSAMS1 具有甲硫氨酸腺苷轉移酶的保守結構域，屬于S－腺苷甲硫氨酸合成酶家族，利用Prosite 數(shù)據庫進行蛋白功能結構域預測，該蛋白含有3 個SAMS 蛋白的特征序列 GHPDK、 GAGDQGHMFGY 和GGGAFSGKD(圖3)。

多重序列分析表明，紅花CtSAMS1 氨基酸序列與擬 南 芥(Arabidopsis thaliana)、 苜蓿(Medicagotruncatula)、蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)和玉米(Zea maysL.)中SAMS 氨基酸序列相似性分別為88.04%、94.62%、98.72%和87.59%，說明CtSAMS1的氨基酸序列與其他植物中氨基酸序列之間具有較高的同源性(圖3)。為進一步分析CtSAMS1 基因與其他植物SAMS基因的進化關系，通過NCBI 搜索到其他植物的21 條SAMS 蛋白序列，利用MEGA7.0 構建了系統(tǒng)進化樹(圖4)，結果發(fā)現(xiàn)CtSAMS1 與來自菊科的洋薊(Cynara cardunculusvar. scolymus)、 黃花蒿(Artemisia annua)、 萵苣(Lactuca sativa)、 除蟲菊(Tanacetum cinerariifolium)的SAMS 親緣關系最近，與其他科中的SAMS 親緣關系相對較遠。

2.3 CtSAMS1 基因組織表達特性分析

為了對CtSAMS1 基因的表達特性性進行研究，通過qRT-PCR 對紅花不同組織中的基因表達進行定量分析，提取了紅花根、莖、葉、花(盛花期)、苞片的RNA，反轉錄成cDNA，通過qRT-PCR 檢測其表達情況，結果表明，CtSAMS1 基因在花中表達量最高，其次是莖，在根、葉、苞片中表達量極低，說明CtSAMS1 基因表達具有組織特異性(圖5)。通過qRT-PCR 對不同發(fā)育時期紅花花冠中CtSAMS1 基因表達量進行了定量分析，結果表明，CtSAMS1 基因表達量隨著紅花花瓣的衰老而增加(圖5)，說明CtSAMS1 基因可能參與紅花花瓣的衰老過程。

2.4 CtSAMS1 基因在不同非生物脅迫和激素誘導下的表達分析

2.4.1CtSAMS1 基因在不同非生物脅迫下的表達分析 通過qRT-PCR 對不同非生物脅迫處理的紅花花冠基因表達進行定量分析，結果表明鹽、干旱和低溫(4℃)處理都能誘導CtSAMS1 基因的表達。經鹽脅迫處理后，CtSAMS1 基因表達在12 h 達到高峰，而20%PEG6000 誘導產生的干旱脅迫條件下，CtSAMS1 基因的表達在6 h 即達到高峰，4℃低溫處理后，CtSAMS1基因在3 h 表達量最大，隨后降低，在24 h 又出現(xiàn)上升趨勢(圖6)。

2.4.2CtSAMS1 基因在不同激素誘導下的表達分析 為了研究CtSAMS1 基因表達是否受到激素的調控，對離體培養(yǎng)紅花花冠進行MeJA、SA、ABA、GA3 處理，通過qRT-PCR 對其表達變化進行定量分析，結果表明，MeJA、SA 和ABA 對CtSAMS1 基因的表達都具有誘導作用。MeJA 處理后，隨著時間推移基因表達量逐漸升高；SA 處理后6 h，基因表達量達到最高峰，隨后表達量迅速下降；ABA 處理后3 hCtSAMS1 基因表達量達到高峰，隨著時間的推移，其表達水平一直維持在較高水平，而GA3 處理對CtSAMS1 基因的表達有一定的抑制作用，但抑制效果不明顯(圖7)。

3 討論

SAMS 是S－腺苷甲硫氨酸代謝途徑的關鍵酶，催化反應的產物S－腺苷甲硫氨酸是生物合成乙烯和多胺的前體，而乙烯和多胺參與植物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫等多個生理過程。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)SAMS 也參與多種生物和非生物脅迫[7－8]。

植物中的SAMS 由一個多基因家族編碼，同一植物基因組中往往有多個拷貝，它們的表達方式有所不同，從而在植物生長發(fā)育的不同階段或不同生理狀態(tài)下發(fā)揮作用。所以對紅花中CtSAMS在不同非生物脅迫和激素處理下的表達分析，有利于研究CtSAMS基因在紅花抗逆境脅迫中的作用。本研究利用RACE、qRT-PCR 技術在紅花中克隆得到1 條CtSAMS基因全長，對其進行了生物信息學分析，三維結構預測結果表明紅花中CtSAMS與擬南芥SAMS 的三維結構相似[21]，多重序列分析發(fā)現(xiàn)，CtSAMS與其他物種具有較高的同源性，并且具有3 個SAMS 的特征序列，進化序列分析結果表明CtSAMS與菊科SAMS 蛋白的相似性較高。

研究發(fā)現(xiàn)不同植物的SAMS具有不同的表達模式，如擬南芥基因組中有4 個SAMS基因，其中AtSAMS1 和AtSAMS2 在根和莖中表達量最高[22]，豌豆中PsSAMS1 和PsSAMS2 在不同發(fā)育時期表達量不同[23－24]；玉米基因組中共有4 個SAMS 基因，它們在不同組織部位和不同脅迫條件下的表達模式有很大差異性[25]；本研究表明，紅花中的CtSAMS1 基因表達具有組織特異性，在花中表達量最高，其次是莖，在根、葉、苞片中表達量極低。大量研究表明乙烯信號途徑在植物器官衰老和成熟中發(fā)揮重要作用，其中，SAMS作為乙烯合成途徑的關鍵酶，通過調節(jié)乙烯合成量參與植物的生長發(fā)育過程。本研究對表達量較高的紅花花瓣不同發(fā)育時期CtSAMS1 基因表達量進行了分析，結果表明隨著紅花花瓣的衰老CtSAMS1 基因的表達量增加，推測CtSAMS1 基因參與紅花花瓣衰老生理過程。

植物在生長過程中會受到干旱、鹽、低溫等多種非生物脅迫，這些非生物脅迫會引起植物代謝途徑及信號途徑相關基因的表達變化[26－28]。目前，大量研究發(fā)現(xiàn)，SAMS基因受多種逆境脅迫因子的誘導，如蝴蝶蘭MtSAMS基因受到低溫脅迫處理后表達量明顯上升[20]，Guo 等[14]研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿葉片的MfSAMS1能被低溫、ABA、H2O2和一氧化氮(NO)誘導，并且過量表達MfSAMS1 基因能夠顯著提高紫花苜蓿的抗冷能力；長春花中的3 個SAMS基因表達也都受到鹽脅迫處理的誘導[25]。本研究結果表明鹽、干旱和低溫等非生物脅迫均能促進CtSAMS1 基因的表達，說明CtSAMS1 基因參與紅花的非生物脅迫防御反應。

大量研究發(fā)現(xiàn)，SAMS基因的表達還受多種激素的調控[29－31]，如ABA 處理番茄后，番茄SlSAMS1 和SAMS3 基因表達量明顯升高[19]；ABA 對鹽地堿蓬的SgSAMS2 基因表達也具有顯著的誘導作用[32]；MeJA、SA、ABA、GA3 處理白木香(Aquilaria sinensis)愈傷組織后，白木香AsSAMS1 的基因表達明顯升高[7]，本研究表明CtSAMS1 基因也受MeJA、SA 和ABA 誘導，GA3 對CtSAMS1 基因表達有一定的抑制作用，說明不同激素CtSAMS1 基因受多種激素交叉調控。對CtSAMS基因非生物脅迫和激素處理下的表達分析，為進一步研究紅花S－腺苷甲硫氨酸生物合成及調控分子機制奠定了基礎，同時有利于豐富植物的防御反應研究。

4 結論

本研究克隆了紅花CtSAMS1 基因的全長cDNA 序列，其ORF 序列長1 173 bp，編碼390 個氨基酸，具有甲硫氨酸腺苷轉移酶的保守結構域(PLN02243)，屬于S－腺苷甲硫氨酸合成酶家族，對該基因的表達特性進行分析表明，CtSAMS1 基因表達具有組織特異性，主要在花和莖中表達，在其他組織部位中表達量較低，并且隨著花衰老其表達量呈上升趨勢；鹽、干旱和低溫非生物脅迫處理能誘導CtSAMS1 基因表達，MeJA、SA 和ABA 處理也能夠誘導CtSAMS1 基因表達，GA3 對CtSAMS1 基因具有一定抑制作用。本研究為后續(xù)深入研究CtSAMS1 基因功能奠定了基礎。