鄧浩東 余鎂霞 吳光亮 羅 鑫 宋貴庭 陳利平 賀浩華 邊建民

(1作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2作物生理生態(tài)與遺傳育種江西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；3江西省水稻高水平工程研究中心，江西 南昌 330045)

水稻(Oryza sativaL.)起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是目前世界上主要的糧食作物之一。低溫脅迫使水稻種植受到限制，大部分水稻分布在中國(guó)、美國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家和地區(qū)[1]。低溫脅迫會(huì)對(duì)水稻整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期造成危害。芽期遭遇冷害，水稻幼芽生長(zhǎng)緩慢且成活率降低[2]，后期分蘗數(shù)也會(huì)降低[3－4]。孕穗階段遭到冷害，穗數(shù)和穗粒數(shù)減少，產(chǎn)量降低[5－6]。因此，提高水稻耐冷性是水稻抵御低溫脅迫，提高產(chǎn)量的必然要求。

水稻耐冷性屬于數(shù)量性狀，受主效基因和微效多基因共同控制[7]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)分子標(biāo)記已在水稻的所有12 條染色體上定位了多個(gè)水稻芽期耐低溫相關(guān)數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，QTL)[8]。曾亞文等[9]以農(nóng)林20 和沖腿為親本，發(fā)現(xiàn)水稻孕穗期耐冷性QTL 主要分布在第1、第3～第8、第10 和第12 號(hào)染色體上。詹慶才等[10]以我國(guó)南方稻區(qū)苗期不耐冷的早熟秈稻品種二九青和日本北海道地區(qū)耐冷粳稻品種Yukihikari 自交得到的重組自交系(rcombinant ibred lnes，RILs)群體為材料，以葉綠素含量為指標(biāo)，共定位11 個(gè)苗期耐冷相關(guān)的QTL。楊永霞等[11]以秈粳交組合IR64/Azucena 產(chǎn)生的105個(gè)雙單倍體(duble hploid，DH)為遺傳材料，在水稻三葉期定位了17 個(gè)苗重耐冷性動(dòng)態(tài)QTL。吳杏春等[12]利用Lemont/Dular 雜交衍生的RILs 群體為材料，定位到5 個(gè)苗期耐冷相關(guān)的QTL:qGRP－2a、qGRP－2b、qGRP－2c、qGRP－7a和qGRP－7b。鄒德堂等[13]以黑龍江高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻品種東農(nóng)422 和耐冷性強(qiáng)的空育131雜交衍生的F2∶3群體為遺傳材料，定位到21 個(gè)分蘗期耐冷相關(guān)的QTL。張艷梅等[14]以140 份東北粳稻品種(系)為材料進(jìn)行耐冷分析，鑒定到18 個(gè)與分蘗期耐冷顯著相關(guān)的QTL。林靜等[15]以秈稻品種9311 為受體、粳稻品種日本晴為供體構(gòu)建的染色體片斷置換系(chromosome segment subctitution lines，CSSLs)群體為材料，鑒定到4 個(gè)與芽期耐冷相關(guān)的QTLs:qCTB－5－1、qCTB－5－2、qCTB－5－3 和qCTB－7。在目前已定位的影響水稻耐冷的QTL 中，只有少數(shù)得到了克隆。如，qLTG3－1[16]和OsSAP16[17]控制水稻芽期低溫耐受性，bZIP73[18]、LTG1[19]、COLD1[20]、HAN1[21]和qBSR10[22]控制水稻幼苗低溫耐受性，Ctb1[23]和CTB4a[24]控制水稻孕穗期低溫耐受性。分析其原因可能是定位水稻低溫脅迫相關(guān)QTL 多采用RIL 等群體，復(fù)雜的遺傳背景增加了QTL 克隆和育種應(yīng)用的難度。通過(guò)對(duì)這些QTL 進(jìn)行克隆，為研究復(fù)雜遺傳和分子機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[25]。

CSSLs 群體是以一水稻親本為供體，另一水稻親本為受體，并將供體的一個(gè)或部分染色體片段導(dǎo)入受體所構(gòu)建的群體。該群體與受體水稻親本相比，只在個(gè)別染色體區(qū)段上有所差別，大部分染色體片段與受體親本一致，定位的QTL 可以通過(guò)構(gòu)建次級(jí)分離群體進(jìn)行快速克隆[26]。該群體目前已用于水稻非生物脅迫耐受性[27－28]、產(chǎn)量性狀[29]、粒形[30]等相關(guān)性狀QTL的定位。

本研究以新構(gòu)建的一套9311(受體)/日本晴(供體)CSSLs 群體為材料，在芽期進(jìn)行不同低溫處理，測(cè)定低溫脅迫后水稻種子存活率并定位相關(guān)QTL，以期為克隆和應(yīng)用水稻芽期耐冷QTL 奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以秈稻9311 作為輪回親本，粳稻日本晴作為供體親本，經(jīng)過(guò)一輪雜交、三輪回交和六輪自交，獲得了BC3F6遺傳群體。從BC3F6群體中選擇性狀穩(wěn)定的121 個(gè)株系中的單株用于CSSLs 群體構(gòu)建。

1.2 基因分型和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)121 個(gè)單株進(jìn)行基因分型。具體方法:提取親本及121 個(gè)單株的基因組DNA；利用物理法斷裂DNA，并構(gòu)建～300 bp 的文庫(kù)；通過(guò)深圳華大基因的MGISEQ－2000 設(shè)備對(duì)文庫(kù)測(cè)序?；跍y(cè)序結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記的篩選并分類，然后將連續(xù)多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記且具有相同基因型的概括為一個(gè)bin 標(biāo)記[31]，利用這些bin 標(biāo)記結(jié)合JoinMap 4.2軟件構(gòu)建CSSLs 群體的高密度圖譜。

1.3 試驗(yàn)方法

從親本和CSSLs 群體每個(gè)家系所收獲的種子中選取40 粒飽滿的種子，先經(jīng)5.5%次氯酸鈉消毒后，再用蒸餾水漂洗干凈。將該40 粒種子置于9 mm 無(wú)菌培養(yǎng)皿中，底部放置一層濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入蒸餾水，至剛好浸沒(méi)種子，并置于28℃條件下浸種催芽。待種子萌發(fā)后，選擇其中整齊一致的30 粒種子，置于恒溫培養(yǎng)箱7℃低溫條件下處理7 d，最后在28℃恢復(fù)生長(zhǎng)3 d，測(cè)定種子存活率。15℃低溫處理與7℃低溫處理過(guò)程相同。種子存活率標(biāo)準(zhǔn):低溫處理后幼芽迅速生長(zhǎng)的種子記為正常發(fā)芽的種子，幼芽死亡和生長(zhǎng)不明顯的種子記為異常發(fā)芽的種子。種子存活率＝正常發(fā)芽的種子粒數(shù)/30×100%，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，并計(jì)算平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用IciMapping V4.2 軟件對(duì)CSSLs 群體進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和QTL 定位，利用完備區(qū)間作圖法(inclusive composite interval Mapping，ICIM)檢測(cè)QTL，當(dāng)QTL 的或然率的對(duì)數(shù)LOD 值超過(guò)3.0 時(shí)，被認(rèn)為是可信的QTL。參考McCouch[32]的原則命名QTL，即q＋目標(biāo)性狀＋所在染色體號(hào)數(shù)或連鎖群代號(hào)，名稱用斜體[33]。用SPSS 22軟件與Microsoft Excel 2017 內(nèi)置公式進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳圖譜構(gòu)建

以100 kb 為一個(gè)bin 窗口，滑動(dòng)所有子代樣品的每條染色體，根據(jù)每個(gè)樣品基因型來(lái)源，以bin 為單位得到該群體每個(gè)子代的maker 信息(與親本日本晴相同的基因型轉(zhuǎn)化為標(biāo)記2，與親本9311 相同的基因型轉(zhuǎn)化為標(biāo)記0，無(wú)法判斷的基因型轉(zhuǎn)化為標(biāo)記－1)。經(jīng)過(guò)篩選，最終獲得655 個(gè)平均分布在12 條染色體上bin 標(biāo)記。其中，標(biāo)記最少的是9 號(hào)染色體，僅為33個(gè)，標(biāo)記最多的是11 號(hào)染色體，為76 個(gè)(表1)。進(jìn)一步利用這些bin 標(biāo)記分析121 個(gè)家系，經(jīng)過(guò)基因型分析，保留其中背景相對(duì)純合的117 個(gè)家系構(gòu)建了染色體片段置換系圖譜。該圖譜總距離為1 480.2 Mb，約97%的基因組被日本晴片段置換覆蓋(圖1)。其中，2個(gè)相鄰標(biāo)記之間的平均距離為0.60 Mb，11 號(hào)染色體的平均距離最小，為0.38 Mb，8 號(hào)染色體上的平均距離最大，為0.84 Mb。

表1 染色體標(biāo)記信息及遺傳距離信息Table 1 The bin marker number and genetic distance between adjacent bins

2.2 親本和置換系群體低溫處理表型分析

兩種不同低溫處理后，親本及CSSLs 群體種子存活率表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表2。7℃低溫處理后，親本日本晴種子存活率明顯高于9311；15℃低溫處理后，親本日本晴和9311 種子存活率均在95%以上，表明日本晴和9311 芽期種子存活率在兩種低溫處理下表現(xiàn)不同。而CSSLs 群體種子存活率在兩種溫度處理后表現(xiàn)出不同程度的差異(表2)。經(jīng)偏度及峰度檢驗(yàn)表明，CSSLs 群體種子存活率在兩種不同溫度處理后均表現(xiàn)為連續(xù)分布，具有廣泛的變異幅度，并存在明顯的超親分離現(xiàn)象(表2、圖2)。表明CSSLs 群體芽期在不同溫度處理后，種子的存活率表現(xiàn)出典型的數(shù)量性狀特征，符合QTL 定位要求。

表2 親本及CSSLs 群體芽期7℃和15℃低溫處理后種子存活率表型值Table 2 Phenotypic analysis of seed survival rate after 7℃and 15℃treatments at the bud bursting period for parents and CSSLs population

2.3 不同溫度處理相關(guān)性分析

對(duì)CSSLs 群體芽期7℃和15℃低溫處理后種子存活率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，7℃和15℃處理后種子存活率相關(guān)系數(shù)僅為0.07，相關(guān)性不顯著。表明該CSSLs 群體7℃和15℃低溫處理后的芽期種子存活率表現(xiàn)沒(méi)有直接聯(lián)系。

2.4 低溫處理QTL 定位分析

對(duì)兩個(gè)不同溫度處理后種子存活率進(jìn)行QTL 分析，共定位到3 個(gè)芽期耐低溫主效QTL(表3、圖3)，貢獻(xiàn)率(phenotypic variance explaines，PVE)為14.92%～25.69%。在7℃處理后定位到2 個(gè)芽期耐低溫相關(guān)的主效QTL:qCS7T10 和qCS7T11，分別位于水稻的第10和第11 號(hào)染色體上，其LOD 值分別為7.26 和5.87，貢獻(xiàn)率分別為18.85%和14.92%，其增效等位基因均來(lái)自9311。15℃低溫處理后定位到1 個(gè)與芽期耐低溫相關(guān)的主效QTL:qCS15T5，位于水稻第5 號(hào)染色體上，LOD 值為7.61，貢獻(xiàn)率為25.69%，其增效等位基因來(lái)自9311。

表3 CSSLs 群體定位的芽期7℃和15℃低溫處理后影響種子存活率的QTLTable 3 QTL mapping of seed survival rate after 7℃and 15℃treatments at the bud bursting period using CSSLs population

3 討論

3.1 秈稻和粳稻芽期耐低溫遺傳分析

在水稻生長(zhǎng)早期，低溫脅迫會(huì)使秈稻和粳稻生長(zhǎng)受到不同程度的抑制[31]。本研究利用9311 和日本晴進(jìn)行芽期不同低溫脅迫處理。結(jié)果顯示，7℃處理后，日本晴種子存活率明顯高于9311，而在15℃處理后，兩親本間種子存活率接近，表明不同低溫處理下控制水稻芽期種子存活率的機(jī)制可能不同。為了解析其中存在的遺傳差異，利用9311/日本晴衍生的CSSLs 群體，在7℃和15℃條件下對(duì)水稻芽期耐低溫主效QTL進(jìn)行定位分析。結(jié)果顯示不同低溫處理后，控制芽期種子存活率的QTL 不同，表明7℃和15℃條件下，控制9311 和日本晴芽期耐低溫的表達(dá)基因(QTL)確實(shí)存在差異。此外，定位的3 個(gè)水稻芽期耐低溫QTL 的增效等位基因均來(lái)自9311，表明秈稻9311 中存在控制芽期耐低溫的主效QTL，而日本晴中可能存在控制芽期耐低溫的微效QTL。這與CSSLs 群體中芽期耐低溫表型的超親分離現(xiàn)象相吻合，類似的結(jié)論在Baruah等[34]、Miura 等[35]和Wang 等[36]關(guān)于水稻耐冷的研究中也有提及。表明水稻生長(zhǎng)早期，秈稻中可能存在耐低溫的主效QTLs。

3.2 QTL 比較

通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，15℃低溫處理后定位的芽期耐低溫主效QTLqCS15T5(物理位置:Chr5: 4.8～6.3 Mb)與Kusumi 等[37]檢測(cè)的V1 位點(diǎn)位置接近。Mao 等[21]在11 號(hào)染色體定位到苗期耐冷QTLHAN1，但與本試驗(yàn)定位的qCS7T11(物理位置:Chr11: 24.25～24.6 Mb)不在同一位點(diǎn)。目前鮮有與qCS7T10(物理位置:Chr10: 2.3～2.75 Mb)相同或接近的水稻耐冷QTLs相關(guān)報(bào)道。

林靜等[15]以類似的CSSLs 群體在5℃處理10 d，30℃恢復(fù)10 d 后測(cè)定水稻種子成苗率，共鑒定到4 個(gè)芽期耐低溫QTL 位點(diǎn)(qCTB－5－1、qCTB－5－2、qCTB－5－3 和qCTB－7)。這4 個(gè)QTL 與本試驗(yàn)定位的3 個(gè)芽期耐低溫主效QTL 位置不同，分析其原因可能是由于低溫處理和恢復(fù)時(shí)間不同造成的。本研究關(guān)注的是低溫處理7 d 后水稻種子快速(3 d)恢復(fù)發(fā)芽的能力，而林靜等[15]關(guān)注的則是低溫處理10 d 后種子長(zhǎng)時(shí)間(10 d)恢復(fù)發(fā)芽的能力。水稻芽期耐冷性是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不同低溫處理和不同處理時(shí)間調(diào)控水稻耐冷的遺傳機(jī)制可能存在差異。因此，后續(xù)對(duì)水稻芽期耐冷的深入研究是很有必要的。

3.3 水稻低溫脅迫后快速恢復(fù)發(fā)芽能力的重要性

隨著氣候變化加劇，低溫冷害已經(jīng)成為影響水稻正常生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害之一。南方秈稻品種，特別是早秈品種，在播種萌發(fā)后經(jīng)常遭遇低溫冷害。因此，如何提高水稻芽期耐冷性成為育種家關(guān)心的重要生產(chǎn)問(wèn)題之一。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記進(jìn)行耐冷QTL(基因)的聚合已成為提高水稻耐冷性的一條有效途徑。傳統(tǒng)研究定位的芽期耐低溫QTL多來(lái)源于粳稻品種，由于遺傳背景的不同，這些芽期耐低溫QTL 很難直接在秈稻上轉(zhuǎn)育利用。本研究利用CSSLs 群體定位了3 個(gè)芽期耐低溫QTL，其增效等位基因均來(lái)自秈稻9311。因此，可以利用秈稻9311 作為中間材料，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將這些芽期耐低溫的主效QTL 轉(zhuǎn)入其他秈稻品種中，提高秈稻品種的芽期耐低溫能力。

4 結(jié)論

本研究以9311(受體)/日本晴(供體)染色體片段置換系群體為材料，在7℃和15℃低溫處理后，共檢測(cè)到3 個(gè)水稻芽期耐低溫QTL。其中，qCS15T5 與已報(bào)道的基因可能是同一基因或等位基因，位于第10 號(hào)染色體上的qCS7T10 和第11 號(hào)染色體上的qCS7T11可能是新的低溫脅迫QTL。本研究結(jié)果為水稻芽期耐低溫QTL 的基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了一定的理論基礎(chǔ)。