李君霞 秦 娜 朱燦燦 王春義 代書桃 宋迎輝 陳宇翔

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，河南鄭州 450002)

葉片是植物進行光合作用的主要器官，其結(jié)構(gòu)和功能與植物的光合作用十分密切。葉色突變是綠色植物一種非常重要的突變，會直接或間接影響葉綠素的合成和降解，因此，研究葉色突變對解析植物光合作用分子機理、葉綠素生物合成與降解機制等具有十分重要的作用[1－3]。

Wang 等[4]、Vytautas 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，葉色突變是相關(guān)基因通過直接或間接作用影響葉綠素、類胡蘿卜素等植物光合色素合成而產(chǎn)生的葉色變化[4－5]。也有研究表明，葉色突變導(dǎo)致光合酶活性降低引起光合作用減弱[6－8]，如1，5 二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose－1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCO)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ( phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPCase)、 蘋果酸酶( NADP-Malate dehydrogenase，NADP-ME)等活性下降或失活，進而影響光合作用強度[9－11]，使突變體在生產(chǎn)上的應(yīng)用受到較大的限制。然而也有葉色突變引起光合特性增強的報道，歐立軍[12]研究水稻淡黃綠葉自然突變體時發(fā)現(xiàn)，大田條件下突變體具有較高的光合速率和光合酶活性，進一步分析表明突變體呈現(xiàn)黃綠葉色是光合色素總量降低所致。Zhou 等[13]通過研究雜交水稻黃葉色突變體發(fā)現(xiàn)，突變體光合色素總含量降低，而光合作用和耐光抑制性明顯增強，其中光系統(tǒng)Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)實際利用光量子產(chǎn)額、最大光能轉(zhuǎn)換效率和原初光能轉(zhuǎn)化效率顯著提高。Tan 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，自然條件下大麥黃葉色突變體光合色素含量和光合作用顯著低于野生型，而在光飽和條件下其光合作用與野生型無顯著差異，表明自然條件下黃葉色突變體光合作用減弱是其光合色素總量降低所致。Dai 等[15]研究葉綠素b 突變體發(fā)現(xiàn)，突變體截光率顯著低于野生型，而其強光耐受性顯著提高，表明葉綠素b 突變體截光能力降低時，其吸光與光能利用力顯著提高，削弱了由強光產(chǎn)生的活性氧化物帶給突變體葉片保護酶的破壞。林秋云等[16]分析水稻黃葉色突變體ylg3，發(fā)現(xiàn)孕穗期突變體葉綠體基粒數(shù)和葉綠素含量顯著低于野生型，表現(xiàn)為總?cè)~綠素含量和葉綠素b 含量顯著下降，而光合速率、光飽和點、光補償點、暗呼吸速率、表觀羧化效 率、Fv/Fm、 PSⅡ和非光化學(xué)率滅系數(shù)(nonphotochemical quenching，NPQ)則顯著高于野生型，表明突變體ylg3 具有較強的光合作用和較高的光能轉(zhuǎn)換效率。

本研究以豫谷1 號的黃葉色突變株系ylm－1、ylm－2 為試驗材料，分析其遺傳性狀、光合色素含量、光合速率日變化、光強度響應(yīng)曲線、CO2濃度響應(yīng)曲線、熒光特性、氣孔特性、光合關(guān)鍵酶活性，解析突變體葉色變黃的機理，旨在闡明突變體光合作用增強的生理機制，為谷子高光效育種及分子標記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ylm－1、ylm－2 是2013年河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所通過甲基磺酸酯(ethy methysulforate，EMS)誘變常規(guī)谷子品種豫谷1 號篩選的兩個黃葉色突變株(yellow leaf mutant)。其特點是植株在苗期為黃色，孕穗后期開始變?yōu)榈S色。經(jīng)連續(xù)篩選種植，已表現(xiàn)為穩(wěn)定遺傳。2018年6月和2019年6月分別以野生型豫谷1 號為對照，ylm－1、ylm－2 為試驗材料，播種于河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地(河南新鄉(xiāng))，每個材料種植小區(qū)面積為3.6 m2(3 m×1.2 m，長×寬)，各小區(qū)隨機排列種植，常規(guī)管理同大田種植。

1.2 試驗方法

1.2.1 遺傳表型分析 種植突變體ylm－1 與野生型豫谷1 號雜交的F2、ylm－2 與保谷22 雜交的F2，后代材料分別種植536 和572 株，開花期統(tǒng)計F2正常葉色與黃葉色分離比，χ2檢驗黃葉色突變體控制葉色基因的遺傳分離模式。

1.2.2 葉片光合色素含量的測定 葉片光合色素含量采用分光光度法測定[17]，計算公式參照Li 等[18]的方法。每個材料于開花期選取長勢一致的植株各6株，取其旗葉葉片分別測定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，每個材料測定時設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 光合速率日變化測定 在谷子開花期，選擇晴朗無云的天氣，于上午6:00 至下午18:00，采用LI－6400 便攜式光合儀(美國LI-COR 公司)每隔1 h 測定旗葉光合速率1 次。光強、溫濕度、CO2濃度均為自然條件，每個材料選取6 株旗葉葉片進行測定，連續(xù)測定2 d。

1.2.4 光強度和CO2響應(yīng)光合曲線 谷子開花期，選擇晴朗無云的天氣，于上午9:30－11:30，利用LI－6400 便攜式光合儀測定突變體與野生型植株在不同光強與不同CO2濃度下的光合速率。光響應(yīng)曲線利用儀器內(nèi)自帶測定系統(tǒng)進行設(shè)定，CO2濃度設(shè)定為380 μmol·mol－1，葉室溫度設(shè)為30℃，光強分別設(shè)定為0、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 μmol·m－2·s－1，不同光強由儀器自帶LED 光源調(diào)節(jié)產(chǎn)生，根據(jù)不同光強度下光合速率和光強產(chǎn)生的斜率擬合光合速率－光響應(yīng)曲線。CO2響應(yīng)曲線制定時，光強設(shè)為1 500 μmol·m－2·s－1，葉室溫度設(shè)為30℃，CO2由光合測定專用小鋼瓶提供，濃度分別設(shè)置為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 μmol·mol－1，根據(jù)測定的光合速率結(jié)果，利用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析并擬定光合速率-CO2響應(yīng)曲線。

1.2.5 氣孔導(dǎo)度及超微結(jié)構(gòu)的測定 在谷子開花期，利用LI－6400 便攜式光合儀測定突變體和野生型旗葉葉片的氣孔導(dǎo)度。氣孔超微結(jié)構(gòu)參照邱義蘭等[19]的方法，將葉片制成切片，在H－600 透射電鏡(日本Hitachi 公司)下觀察其超微結(jié)構(gòu)并照相。

1.2.6 葉片熒光參數(shù)測定 熒光特性測定參照Xu等[20]的方法，采用便攜式FMS－2 型脈沖調(diào)制熒光儀(英國Hansatech 公司)進行測定。選取自然光下生長的突變體與野生型谷子各6 株，于晴天6:00－18:00 測定熒光參數(shù)，重復(fù)3 次。首先將突變體與野生型暗適應(yīng)15 min 的旗葉在弱調(diào)制測量光(0.05 μmol·m－2·s－1)誘導(dǎo)產(chǎn)生初始熒光(minimal flourescence，F(xiàn)0)，隨后用強飽和脈沖(700 μmol·m－2·s－1)激發(fā)產(chǎn)生最大熒光(maximal flourescence，F(xiàn)m)。參照Zhong 等[21]的方法分別計算可變熒光(variable fluorescence，F(xiàn)v)、PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(optimal quantum yield of PSⅡ，F(xiàn)v/Fm)、 非光化學(xué)猝滅系數(shù)( non － photochemical quenching，NPQ)、光合電子傳遞速率(electron transport rate，ETR)等參數(shù)。

1.2.7 光合相關(guān)酶活性測定 取開花期旗葉，稱取0.5 g 葉片，放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入2 mL 0.1 mol·L－1Tris-HCl 緩沖液(含1 mmol·L－1乙二胺四乙酸鈉、7 mmol·L－1巰基乙醇、50%甘油、1% 聚乙烯吡咯烷酮，pH 值8.0)，研磨成勻漿，于4℃、13 000 r·min－1條件下離心15 min，保留上清液。采用檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)分別測定1，5－二磷酸核酮糖羧化酶( Rubisco)、 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPCase)、蘋果酸酶(NADP-Malate dehydrogenase，NADP-ME)的活性，并計算酶活性值。

1.2.8 產(chǎn)量相關(guān)性狀測定 谷子成熟后，突變體與野生型各取15 株分別調(diào)查株高、穗長、穗粗、單穗質(zhì)量、穗粒質(zhì)量、千粒重，并利用Microsoft Office Excel 2010和SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 20. 0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，采用Excel 2010 和DPS 軟件進行作圖和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃葉色突變體的遺傳分析

ylm－1 與豫谷1 號(ylm－1/豫谷)和ylm－2 與保谷22(ylm－2/保谷22)雜交F1葉色均為正常綠色，表明黃葉色突變體性狀為隱形基因控制。由表1 可知，F(xiàn)2表現(xiàn)出正常葉色與黃葉色性狀的分離，χ2檢驗結(jié)果表明，2個組合均符合一對基因3 ∶1分離模式。

表1 F2 正常葉色與黃葉色性狀分離比及χ2 檢驗Table 1 Segregation and χ2 test of normal and yellow leaf colour in F2 population

2.2 開花期光合色素含量分析

開花期突變體ylm－1、ylm－2 的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和光合色素含量均顯著低于野生型豫谷1號，約為野生型的50%～60%(表2)。突變體與野生型類胡蘿卜素與光合色素的比值無顯著差異。上述表明，突變體黃葉色是由于葉綠素、光合色素含量降低所致。

表2 黃葉色突變體與野生型葉片光合色素含量比較Table 2 Comparision of photosynthetic pigments content between mutants and wild type leaves

2.3 光合速率日變化分析

由圖1 可知，ylm－1、ylm－2 和豫谷1 號的凈光合速率日變化呈現(xiàn)不同的趨勢。ylm－1、ylm－2 兩突變株系凈光合速率日變化只有單峰，凈光合速率隨著光強的增強和減弱分別呈現(xiàn)增強和降低趨勢。豫谷1 號凈光合速率日變化則有明顯的“雙峰現(xiàn)象”，表明豫谷1 號在正午強光條件下光合速率受到抑制，出現(xiàn)“午休睡眠現(xiàn)象”。豫谷1 號在弱光條件下(上午6:00—8:00 和下午16:00—18:00)的光合速率低于ylm－1、ylm－2 兩突變株系速率，但差異不顯著(P>0. 05)。

2.4 光強度響應(yīng)曲線和CO2 濃度響應(yīng)曲線分析

由圖2－A 可知，在溫度為30℃、光照強度為1 500 μmol·m－2·s－1條件下，ylm－1、ylm－2 和豫谷1 號的凈光合速率隨CO2濃度升高而上升，當CO2濃度達到800 μmol·m－2·s－1時，ylm－1、ylm－2 和豫谷1 號均達到CO2飽和點，CO2濃度繼續(xù)增加但光合速率不再增加。同一CO2濃度下，ylm－1、ylm－2 凈光合速率較豫谷1 號高。

由圖2－B 可知，在380 μmol·mol－1CO2濃度下和一定光強范圍內(nèi)，突變體ylm－1、ylm－2 和野生型豫谷1 號的光合速率均隨光強增加而上升。當光強達到1 600 μmol·m－2·s－1，豫谷1 號光合速率不再增加，處于平穩(wěn)狀態(tài)，而ylm－1、ylm－2 光合速率仍呈現(xiàn)緩慢增加趨勢。表明突變體ylm－1、ylm－2 的CO2同化效率及光量子利用效率高于野生型豫谷1 號。

2.5 氣孔特性分析

由表3 可知，突變體ylm－1、ylm－2 和野生型豫谷1 號氣孔發(fā)育程度、結(jié)構(gòu)、分布規(guī)律性均相同，ylm－1、ylm－2 和豫谷1 號氣孔密度、氣孔長度和氣孔寬度無顯著差異。而在光強為1 600 μmol·m－2·s－1條件下，ylm－1、ylm－2 氣孔導(dǎo)度明顯高于豫谷1 號，表現(xiàn)較高的光合速率，由此可見，氣孔導(dǎo)度顯著增加是突變體ylm－1、ylm－2 光合速率提高的主要原因之一。

表3 突變體與野生型葉片氣孔特性比較Table 3 Comparision of stomatal traits between mutants and wild type leaves

2.6 熒光特性分析

突變體ylm－1、ylm－2 的F0顯著低于野生型豫谷1 號，這與ylm－1、ylm－2 光合色素含量顯著低于豫谷1 號結(jié)果一致，而Fv/Fm顯著高于野生型，表明PSⅡ反應(yīng)中心最大光能轉(zhuǎn)換效率和原初光能轉(zhuǎn)化效率較高；突變體ylm－1、ylm－2 的qN 顯著低于野生型豫谷1號，表明其光合色素吸收的光能非光化學(xué)猝滅系數(shù)較低(表4)。綜上所述，突變體ylm－1、ylm－2 的光能利用效率和轉(zhuǎn)化效率明顯高于野生型，這與ylm－1、ylm－2 具有較高的光合速率結(jié)果一致。

表4 開花期突變體與野生型葉片熒光特性比較Table 4 Comparision of fluorescence characteristics between mutants and wild type leaves at flowering stage

2.7 光合作用相關(guān)酶活性分析

突變體ylm－1、ylm－2 與野生型豫谷1 號旗葉中均存在C3和C4途徑的光合相關(guān)酶。突變體中C3途徑光合酶Rubisco 活性顯著低于野生型豫谷1號，而C4途徑關(guān)鍵酶PEPCase 和NADP-ME 活性顯著高于豫谷1 號，分別較豫谷1 號增加了23. 3%、24. 4%和12. 9%、15. 5%(表5)。由此推測，突變體中C4途徑光合相關(guān)酶PEPCase 和NADP-ME 活性的提高可能補償了其光合色素含量的降低，從而增強了其光合特性。

表5 開花期突變體與野生型葉片光合作用相關(guān)酶活性比較Table 5 Comparision of activity of photosynthetic key enzymes between mutants and wild type at flowering stage

2.8 單株產(chǎn)量性狀分析

由表6 可知，成熟期突變體ylm－1、ylm－2 與野生型豫谷1 號產(chǎn)量性狀有較大差異，突變體株高、穗長、穗粗、單穗質(zhì)量、穗粒質(zhì)量及千粒質(zhì)量均顯著高于野生型。結(jié)果表明，突變體具有較高的單株產(chǎn)量，主要表現(xiàn)為單穗質(zhì)量、穗粒質(zhì)量及千粒質(zhì)量的顯著增加。

表6 谷子突變體與野生型相關(guān)產(chǎn)量性狀比較Table 6 Comparision of yield characteristics between mutants and wild type

3 討論

關(guān)于植物葉色突變體中葉綠素含量與光合效率的關(guān)系，吳自明[22]通過研究水稻葉色突變體ygl－1 發(fā)現(xiàn)，隨著突變體葉片逐漸成熟，葉綠素合成酶基因YGL1 編碼區(qū)發(fā)生堿基突變，使得葉綠素合成酶活性下降，葉綠素合成與積累速率減緩，呈現(xiàn)出葉綠素含量降低的趨勢，而突變體ygl－1 對光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ保持了較高效率的響應(yīng)，表現(xiàn)出光合效率較野生型顯著增加，此研究也表明，葉色突變體中葉綠素含量與光合效率無明顯的相關(guān)性。本研究結(jié)果與以上研究報道一致，突變體在保持一定光合色素和葉綠素含量的基礎(chǔ)上，其光合效率較野生型顯著增加。

葉綠素熒光參數(shù)是用于描述植物光合作用機理和光合生理狀況的變量或常數(shù)值，反映了植物“內(nèi)在性”的特點，被視為研究植物光合作用與環(huán)境關(guān)系的內(nèi)在探針，已逐漸應(yīng)用于環(huán)境脅迫對作物光合作用的影響研究，具有快速、靈敏和無損傷的優(yōu)點[23]。與光合參數(shù)“外在性”指標相比，葉綠素熒光參數(shù)主要反映葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等情況，與碳代謝密切相關(guān)[24]。Fv/Fm是PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，揭示了PSⅡ光化學(xué)反映的熱耗散過程[25]。本研究結(jié)果表明，谷子黃葉色突變體較低的光合色素含量限制了其對光能的捕獲，而其較高的光電子傳遞速率減少了光能不足的不利效應(yīng)，表現(xiàn)出較強的光合特性和較低的熱耗散值。

氣孔導(dǎo)度及氣孔結(jié)構(gòu)的變化對谷子光合特性的增強起著重要作用。陳吉玉等[26]通過分析不同光照下大豆苗期葉片氣孔特征，揭示葉片氣孔開放的增加可以提高大豆苗期凈光合速率，增加碳水化合物積累量，進而提高大豆產(chǎn)量。葉片氣孔是作物光合作用的重要組織結(jié)構(gòu)，對光強有較強的適應(yīng)性[27]，其中氣孔導(dǎo)度與細胞內(nèi)CO2濃度有密切關(guān)系，因此，氣孔開閉和氣孔導(dǎo)度增加對作物光合特性和生物量的提高起著關(guān)鍵性作用。本研究中黃葉色突變體ylm－1、ylm－2 與野生型豫谷1 號的氣孔密度與大小無顯著性差異，所以氣孔密度和大小不是突變體光合速率增加的原因。而氣孔導(dǎo)度直接決定了細胞間隙CO2的供應(yīng)，因此氣孔導(dǎo)度的改變無疑可以顯著促進光合的進行。

已有研究證明，C4植物光合關(guān)鍵酶對增強作物光合特性與耐脅迫能力具有重要的作用，且葉片保衛(wèi)細胞上蘋果酸酶活性與氣孔導(dǎo)度有密切的正相關(guān)[28]。目前科學(xué)家們已成功將C4植物的光合關(guān)鍵酶基因PEPC、PPDK、NADP-ME 等導(dǎo)入C3植物水稻[29]、小麥[30]、擬南芥[31]等作物中。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻、小麥、擬南芥等作物中的PEPCase、丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK) 和NADPME 活性顯著增加，光合速率及氣孔導(dǎo)度均顯著提高。本試驗中，突變體ylm－1、ylm－2 的PEPCase 和NADPME 活性分別較野生型豫谷1 號增加了23.3%、24.4%和12.9%、15.5%，初步推測突變體光合特性的增強及氣孔導(dǎo)度的增加與C4光合酶活性的提高有一定關(guān)系。一般情況下，Rubisco 活性與羧化效率及光合速率呈顯著正相關(guān)[28，32]，本研究發(fā)現(xiàn)，突變體Rubisco 活性顯著低于野生型，而光合速率高于野生型，二者呈負相關(guān)關(guān)系，表明黃葉色突變體中PEPCase 和NADP-ME 活性對光合作用的增強具有重要作用，這可能與植物中代償生理機制有關(guān)。

4 結(jié)論

突變體ylm－1、ylm－2 在葉綠素降低后具有比野生型高的光合速率是多因素互作的結(jié)果。黃葉色突變體通過提高光能轉(zhuǎn)換效率并降低光化學(xué)猝滅系數(shù)來提高暗反應(yīng)同化能力，氣孔導(dǎo)度及PEPCase 活性的增加使其積累和固定更多的CO2，促使光反應(yīng)增強，從而提高突變體光合速率。黃葉色突變體ylm－1、ylm－2 不僅可作為葉色標記應(yīng)用于雜交育種中后代純度的鑒定，而且可以通過篩選高光效品系應(yīng)用于生產(chǎn)。