陳 芳，宋春蘭，陳 梅，朱 琳，崔亞杰，成怡冰，付書琴，崔君浩

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，河南省兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院急重癥醫(yī)學(xué)科，鄭州市兒童急危重癥醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450003)

手足口病(hand-food and mouse disease,HFMD)為一種腸道病毒感染引起的傳染病[1]。朱敏杰等[2]調(diào)查顯示，389例HFMD患者中腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsackie virus A16,CA16)感染分別占30.59%、21.34%，其他腸道病毒感染占48.07%。EV71病毒感染有暴發(fā)流行特點(diǎn)，其神經(jīng)毒性可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜炎、腦脊髓膜炎與急性遲緩性麻痹等，甚至死亡[3]，準(zhǔn)確對(duì)其進(jìn)行診斷和評(píng)估病情有重要意義。在HFMD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，機(jī)體細(xì)胞免疫與體液免疫會(huì)發(fā)生復(fù)雜變化，而細(xì)胞免疫為免疫系統(tǒng)重要組成部分，機(jī)體感染病原體后，體液中迅速產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫攻擊[4]。其中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，參與機(jī)體血管形成與創(chuàng)傷愈合，與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[5]。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)參與腦組織破壞、腦水腫形成等多種繼發(fā)性腦損傷炎癥反應(yīng)過(guò)程[6]，有廣泛誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)與調(diào)節(jié)免疫的作用。但目前關(guān)于血清MMP-9、IL-1β、IL-10與HFMD患者的關(guān)系研究甚少。本研究主要分析EV71、CA16感染的HFMD患兒血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平變化，探討HFMD發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，以期為全面評(píng)估HFMD患兒的各臟器功能并盡早進(jìn)行干預(yù)和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年4月至2019年4月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的腸道病毒感染HFMD患兒72例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合HFMD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室病毒檢測(cè)確定為EV17或CA16感染，均為1種病毒感染；(3)無(wú)重大器官損傷且未接受院外治療；(4)患兒臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病史者；(2)除EV17或CA16感染外有其他病毒感染的患兒；(3)入院前接受過(guò)其他藥物治療的患兒。根據(jù)感染的病毒類型將患兒分為EV71組(n=32)和CA16組(n=40)。另選擇同期入院體檢的健康兒童30例為對(duì)照組，均無(wú)胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病。EV71組32例，男19例，女13例；年齡1～4(2.94±0.32)歲;病情程度[7]：輕度15例，重度17例。CA16組40例，男27例，女13例；年齡0～4(3.05±0.36)歲；病情程度：輕度21例，重度19例。對(duì)照組30例，男16例，女14例；年齡1～4(2.96±0.34)歲。3組患兒的性別分布、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)(1)臨床資料:記錄EV71組和CA16組患兒入院前7 d內(nèi)的病程、熱程，計(jì)算臨床癥狀發(fā)生率；(2)血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平:于入院第2 天抽取所有患兒晨起空腹靜脈血3 mL置于EP管中，1 000 r·min-1離心(離心半徑10 cm)15 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定受試者血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平，試劑盒均購(gòu)自上海易利生物科技有限公司，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 EV71組和CA16組患兒臨床資料比較結(jié)果見(jiàn)表1。EV71組患兒病程、熱程顯著長(zhǎng)于CA16組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EV71組與CA16組患兒的手足部出疹發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.981，P>0.05)。EV71組患兒嗜睡、易驚、肢體抖動(dòng)發(fā)生率顯著低于CA16組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.113、4.194、4.500，P<0.05)；EV71組患兒咳嗽、驚厥、嘔吐、肌肉攣縮發(fā)生率顯著高于CA16組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.937、4.800、8.733、5.946，P<0.05)。

表1 EV71組和CA16組患兒臨床資料比較

2.2 3組患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平比較結(jié)果見(jiàn)表2。EV71組和CA16組患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EV71組患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平顯著高于CA16組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平比較

2.3 EV71組和CA16組不同病情程度患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平比較結(jié)果見(jiàn)表3。EV71組和CA16組重度患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平顯著高于輕度患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CA16組輕度患兒血清MMP-9水平顯著低于EV71組輕度患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CA16組重度患兒血清MMP-9水平顯著低于EV71組重度患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組輕度和重度患兒的血清IL-1β、IL-10 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 EV71組與CA16組不同病情程度患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平比較

2.4 EV71組和CA16組患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平與病情程度的關(guān)系EV71組患兒血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平與病情程度呈正相關(guān)(r=0.345、0.412、0.309，P<0.05)。CA16組患兒血清MMP-9、IL-1β與病情程度呈正相關(guān)(r=0.405、0.367，P<0.05)，血清IL-10水平與病情程度無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.135，P>0.05)。

3 討論

HFMD為一種易感染低齡兒童的急性傳染病，常起病急、病情發(fā)展快、臨床表現(xiàn)多樣化，EV71和CA16為引起HFMD的主要病原體，其中EV71在HFMD發(fā)病中占據(jù)重要地位，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，因而了解2種腸道病毒感染患兒臨床特征及機(jī)制有重要臨床意義[7-9]。機(jī)體遭受病毒感染后，體內(nèi)可分泌大量細(xì)胞因子，因此多種細(xì)胞因子可能參與患兒HFMD的發(fā)生發(fā)展。正常細(xì)胞內(nèi)僅有微量MMP-9表達(dá)，因而MMP-9過(guò)多分泌常提示存在神經(jīng)細(xì)胞破壞及腦組織損傷[10]。劉感哲等[11]研究顯示，MMP-9水平升高可促進(jìn)血腦屏障組織中細(xì)胞間質(zhì)成分中膠原纖維降解，增加其通透性，促進(jìn)病情進(jìn)展。因此，HFMD患兒病情進(jìn)展可能與MMP-9水平有關(guān)。此外，機(jī)體感染病毒后也會(huì)釋放多種細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-10，其中IL-1β為具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，對(duì)免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)有重要調(diào)節(jié)作用[12-13]，但其與HFMD發(fā)病的關(guān)系研究甚少。

本研究結(jié)果顯示，EV71組患兒病程、熱程顯著長(zhǎng)于CA16組，EV71組患兒嗜睡、易驚、肢體抖動(dòng)發(fā)生率顯著低于CA16組，EV71組患兒咳嗽、驚厥、嘔吐、肌肉攣縮發(fā)生率顯著高于CA16組，與謝瑞玉等[14]的報(bào)道結(jié)果一致；表明EV71感染的HFMD患兒病情可能較CA16感染患兒更嚴(yán)重，且發(fā)病不易被察覺(jué)，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(嗜睡、易驚、肢體抖動(dòng)等)不明顯，需及時(shí)診治；而CA16感染的HFMD患兒發(fā)病后更易被察覺(jué)，可及時(shí)接受治療，可能與CA16病毒載量低有關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，EV71及CA16感染的HFMD患兒病毒載量與病情無(wú)明顯相關(guān)性[15]，因此僅依據(jù)臨床表現(xiàn)或病毒載量難以對(duì)HFMD進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

相對(duì)穩(wěn)定的免疫平衡狀態(tài)對(duì)維持機(jī)體正常功能有重要意義，而HFMD患兒感染病毒后，機(jī)體免疫平衡被破壞，體內(nèi)出現(xiàn)免疫紊亂[16]。本研究結(jié)果顯示，EV71組和CA16組患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平顯著高于對(duì)照組，EV71組患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平顯著高于CA16組；表明EV71或CA16感染均會(huì)影響HFMD患兒的免疫功能，而EV71感染對(duì)HFMD患兒免疫功能影響更大，神經(jīng)組織受損更嚴(yán)重，這可能是因?yàn)镋V71為小核糖核苷酸病毒科單正鏈RNA病毒，其引起的HFMD患兒病情發(fā)展較快[17]。促炎因子如IL-1β是引起發(fā)熱、激活神經(jīng)內(nèi)分泌與自主神經(jīng)系統(tǒng)的最強(qiáng)促炎因子，其可經(jīng)c-Jun氨基末端激酶、蛋白激酶C等信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平。IL-1β可通過(guò)激活MMP-9而介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡或發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，在顱腦損傷、顱內(nèi)感染者中IL-1β的表達(dá)水平、活性均呈顯著增高趨勢(shì)。因而檢測(cè)IL-1β、MMP-9可反映腦組織內(nèi)炎癥反應(yīng)情況[18-19]。IL-10為抗炎因子，其主要由輔助型T細(xì)胞2及B細(xì)胞分泌，對(duì)促炎因子有調(diào)控作用。王玉潔等[20]研究發(fā)現(xiàn)，EV71感染的HFMD患兒血清中IL-10呈高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，EV71組患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平顯著高于CA16組；說(shuō)明EV71感染后既存在免疫抑制也有免疫亢進(jìn)，即分泌促炎因子也分泌抗炎因子，使機(jī)體處于復(fù)雜的免疫功能紊亂與動(dòng)態(tài)平衡，因此全身免疫性炎癥反應(yīng)可能是其發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制；同時(shí)不同腸道病毒毒力、嗜神經(jīng)性、免疫反應(yīng)及感染后引起體液因子水平變化差異大，這也可能是EV71組患兒細(xì)胞因子水平升高較CA16組更明顯的原因。

本研究結(jié)果顯示，EV71組和CA16組重度患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平顯著高于輕度患兒，表明HFMD病情進(jìn)展與MMP-9、IL-1β及IL-10等細(xì)胞因子密切相關(guān)，且不論是EV71還是CA16感染均檢測(cè)到這種趨勢(shì)，提示MMP-9、IL-1β及IL-10可作為HFMD患兒病情診斷的指標(biāo)。正常情況下細(xì)胞因子水平較低，當(dāng)機(jī)體受到病毒等攻擊后，會(huì)刺激免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，分泌的炎癥因子持續(xù)作用可導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元破壞，使細(xì)胞水腫變性、壞死溶解，血腦屏障通透性升高，血液中細(xì)胞因子進(jìn)入腦脊液，細(xì)胞因子大量持續(xù)存在對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步造成破壞，從而使病情惡化[21]，因此，隨病情加重可檢測(cè)到HFMD患兒血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平升高，這可能也是本研究Spearman相關(guān)分析中EV71組、CA16組患兒MMP-9、IL-1β水平與病情呈正相關(guān)的原因。CA16組患兒IL-10水平與病情無(wú)明顯相關(guān)性，一方面可能與EV71感染機(jī)體后直接造成的組織細(xì)胞破壞有關(guān)，另一方面可能與機(jī)體感染EV71后所發(fā)生的異常免疫應(yīng)答有關(guān)，二者最終可導(dǎo)致組織細(xì)胞與器官損害[22]。

綜上所述，HFMD患兒尤其是EV17感染患兒的血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平顯著升高，且其中MMP-9、IL-1β與患兒病情程度呈顯著正相關(guān)，臨床可對(duì)HFMD患兒血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以輔助診斷HFMD感染類型。