陳建麗，張永喜，馬國靖，吳 華，陳曉文，陳余英，蔣宇杰

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)三科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 524000；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，廣東 湛江 524000；4.廣東農(nóng)墾中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 湛江 524000)

乳腺癌是全球女性死亡的主要原因之一，能否有效地識別預(yù)后不良的乳腺癌患者并及早地采取干預(yù)措施具有非常重要的意義。目前，常用的乳腺癌預(yù)后評估指標(biāo)往往存在特異性及準(zhǔn)確性不高的缺點(diǎn)，尋找合適的標(biāo)志物已成為研究的熱點(diǎn)。Notch1、Pim1和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)因與乳腺癌的密切相關(guān)性可能作為評估乳腺癌預(yù)后的潛在基因標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，Pim1蛋白表達(dá)上調(diào)和Notch1信號通路激活促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生及進(jìn)展[1-5]，而STAT3上調(diào)可促進(jìn)Pim1蛋白表達(dá)和Notch1信號激活[6-10]。但目前關(guān)于Notch1、STAT3和Pim1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性研究甚少。本研究旨在探討乳腺癌組織中Notch1、STAT3和Pim1表達(dá)與患者生存的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年1月至2014年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院和廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的80例乳腺癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均行乳腺癌改良根治術(shù)；(2)術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌；(3)年齡30～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受放射治療、化學(xué)治療或內(nèi)分泌治療的患者；(2)合并有其他嚴(yán)重疾病患者。本研究獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院和廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院人類倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得了參與所有患者的書面同意。隨訪截止日期為2019年1月，生存期的計算從手術(shù)日期到隨訪結(jié)束日期或死亡日期。

1.2 主要試劑與儀器Pim1一抗購自美國Novus公司,STAT3一抗、鼠單克隆IgM-Notch1抗體購自美國Affinity公司，二抗鼠抗兔單克隆抗體購自美國Abcam公司，二甲苯購自汕頭市西隴科學(xué)股份有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液購自上海信帆生物科技有限公司，檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖溶液、內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑、蘇木精均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 資料收集通過患者病歷資料和原始病理報告收集可能影響乳腺癌進(jìn)展及預(yù)后的臨床和病理學(xué)參數(shù)，包括年齡、組織學(xué)分級(1、2、3級)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無或有)、TNM分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)狀態(tài)(陰性或陽性)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)狀態(tài)(陰性或陽性)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)狀態(tài)(陰性或陽性)以及輔助治療方法(化學(xué)治療、放射治療和內(nèi)分泌治療)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表達(dá)水平取所有患者術(shù)中切除的乳腺癌組織和癌旁組織(距癌組織4 cm以上的正常乳腺組織)固定后制作石蠟切片，使用二甲苯中脫蠟，并在梯度乙醇中水化。經(jīng)脫蠟水化后的切片浸入檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后使用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行沖洗。在待測組織區(qū)域內(nèi)滴加100 μL內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑，室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖溶液沖洗。加入一抗Pim1(1100)、Notch1(1300)、STAT3(1800)，室溫下孵育60 min。加入鼠抗兔單克隆抗體IgG作為二抗，室溫下孵育15 min。最后，將組織切片用蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、中性樹膠封片后在顯微鏡下閱片。參考XIE等[11]和WU等[12]對免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果的判讀方法，計算陽性染色細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量評分。由2位病理醫(yī)師顯微鏡下觀察，采用雙盲法進(jìn)行獨(dú)立評估。隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，每個視野連續(xù)計數(shù)100個細(xì)胞，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計數(shù)后取平均值，并計算陽性細(xì)胞的百分比。Notch1、STAT3和Pim1蛋白陽性表達(dá)染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分、淺黃色為1分、黃色為2分、棕色為3分。陽性細(xì)胞百分比評分標(biāo)準(zhǔn)： ≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。Notch1、STAT3和Pim1蛋白相對表達(dá)水平評分為染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比分值相乘，得分范圍0～12分，≥4分為高表達(dá)，<4分為低表達(dá)。計數(shù)高表達(dá)和低表達(dá)的樣本數(shù)并分別除以總樣本數(shù)，分別獲得高表達(dá)率和低表達(dá)率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。計數(shù)資料用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析；采用Kaplan-Meier法分析Pim1、Notch1、STAT3表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系；采用Cox回歸分析臨床病理特征及Notch1、Pim1和STAT3表達(dá)對生存期的影響；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌和癌旁組織中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表達(dá)結(jié)果見表1和圖1。Notch1和STAT3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，Pim1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中。在乳腺癌組織中， Notch1、STAT3和Pim1蛋白高表達(dá)率均顯著高于低表達(dá)率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=24.711、4.056、2.205，P<0.05)。在癌旁組織中，Notch1、STAT3和Pim1蛋白高表達(dá)率均顯著低于低表達(dá)率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.042、16.039、16.437，P<0.05)。乳腺癌組織中Notch1、STAT3和Pim1蛋白高表達(dá)率均顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=76.306、97.605、83.265，P<0.05)。

表1 乳腺癌患者乳腺癌組織和癌旁組織中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表達(dá)比較

圖1 乳腺癌患者乳腺癌組織和癌旁組織中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.2 乳腺癌組織中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果見表2。乳腺癌組織中STAT3表達(dá)水平與患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，Notch1、Pim1表達(dá)水平與患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。乳腺癌組織中Notch1、STAT3、Pim1表達(dá)水平與患者的ER狀態(tài)有關(guān)(P<0.05)。乳腺癌組織中Notch1、STAT3、Pim1表達(dá)水平與患者的年齡、TNM分期、組織學(xué)分級、PR狀態(tài)、HER2狀態(tài)、輔助治療方法無關(guān)(P>0.05)。

表2 Notch1、STAT3和Pim1蛋白表達(dá)水平與臨床病理變量的關(guān)系

2.3 乳腺癌患者乳腺癌組織中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性乳腺癌患者的乳腺癌組織中Notch1與Pim1、STAT3與Pim1、Notch1與Pim1蛋白表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)(r=0.267、0.307、0.204，P<0.05)。

2.4 乳腺癌組織中Notch1、STAT3和Pim1表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)果見圖2。Pim1高表達(dá)和低表達(dá)患者的中位生存期分別為61、62個月，Notch1高表達(dá)和低表達(dá)患者的中位生存期分別為58、61個月，STAT3高表達(dá)和低表達(dá)患者的中位生存期分別為57、70個月。Pim1高表達(dá)與低表達(dá)患者的中位生存期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.927，P>0.05)。Notch1高表達(dá)與低表達(dá)患者的中位生存期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.152，P>0.05)。STAT3高表達(dá)患者的中位生存期顯著低于STAT3低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.154，P<0.05)。

A：Pim1；B：Notch1；C：STAT3。

2.5 乳腺癌患者多因素生存分析結(jié)果見表3。Cox多因素回歸分析顯示，年齡、組織學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、Her-2狀態(tài)及Notch1、Pim1、 STAT3蛋白表達(dá)水平與乳腺癌患者的生存期無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表3 乳腺癌患者臨床病理特征及Notch1、Pim1和 STAT3表達(dá)的Cox多因素生存分析

3 討論

乳腺組織的癌變和進(jìn)展由多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路參與調(diào)控，是發(fā)生遺傳學(xué)改變的復(fù)雜過程，Notch1信號通路是其中研究較多的信號通路之一。Notch1信號通路激活與乳腺癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[1-3]。DIéVART等[13]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌大鼠模型中Notch1為潛在癌基因。人乳腺癌組織中Notch1呈高表達(dá)且預(yù)示著腫瘤轉(zhuǎn)移和生存狀態(tài)較差[14-15]。Notch1信號通路激活可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)換,促進(jìn)乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移[4]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Notch1高表達(dá)率顯著高于低表達(dá)率，且乳腺癌組織Notch1高表達(dá)率顯著高于癌旁組織，證實(shí)Notch1信號激活促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生及進(jìn)展。

Pim家族編碼產(chǎn)物Pim1蛋白激酶具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性。Pim1可發(fā)揮多方面的生物學(xué)功能，在乳腺癌的發(fā)生及進(jìn)展中扮演著促癌基因的角色[5]。Pim1的mRNA及蛋白水平在包括乳腺癌的大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)異常上調(diào)。Pim1可降低乳腺癌細(xì)胞對藥物治療的敏感性[16]，還可導(dǎo)致針對人類表皮生長因子受體-2的靶向治療出現(xiàn)耐藥[17]。Pim1可參與微RNA-486-5p及骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因的調(diào)控，從而作用于乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18-19]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Pim1高表達(dá)率顯著高于低表達(dá)率，且乳腺癌組織Pim1高表達(dá)率顯著高于癌旁組織，進(jìn)一步證實(shí)Pim1異常表達(dá)與乳腺癌變密切相關(guān)。

目前，關(guān)于乳腺癌中Pim1表達(dá)上調(diào)與Notch1信號激活間關(guān)系很少被注意到。有研究表明，Pim1可通過磷酸化作用使乳腺癌細(xì)胞中Notch1胞內(nèi)域轉(zhuǎn)錄活性增加，與單獨(dú)抑制Pim1或Notch1治療相比，同時抑制Pim1和Notch1能更有效地消除細(xì)胞反應(yīng)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch1與Pim1蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，提示乳腺癌組織中Pim1表達(dá)上調(diào)與Notch1信號激活之間可能存在協(xié)同的促進(jìn)作用。

STAT3是一種DNA結(jié)合蛋白，乳腺癌中普遍存在STAT3活性增強(qiáng)的現(xiàn)象，STAT3可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)換[6]。STAT3可能是乳腺癌中Pim1異常表達(dá)與Notch1信號傳導(dǎo)間發(fā)生相互作用的關(guān)鍵因子。Notch1可通過調(diào)節(jié)STAT3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)換以及維持乳腺癌干細(xì)胞特性[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌細(xì)胞中，Pim1的表達(dá)受c-Jun氨基末端激酶/STAT3信號通路調(diào)控[9-10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中Notch1、STAT3和Pim1高表達(dá)率均顯著高于低表達(dá)率，且Notch1、STAT3和Pim1高表達(dá)率均顯著高于癌旁組織；此外，Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌患者的乳腺癌組織中Notch1與Pim1、STAT3與Pim1、Notch1與Pim1蛋白表達(dá)水平間均呈顯著正相關(guān)；表明STAT3可能介導(dǎo)Notch1和Pim1的相互作用從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生及進(jìn)展，針對上述基因的聯(lián)合靶向治療有望成為乳腺癌治療的新的突破點(diǎn)。

ER也可能是Pim1與Notch1之間相互作用的關(guān)鍵因子。Notch1可增加ERα的轉(zhuǎn)錄活性[21]，同時雌激素也增加Notch1的表達(dá)水平[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，Pim1是受ERα直接調(diào)控的一個靶基因[23]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Notch1、STAT3、Pim1表達(dá)水平與患者的ER狀態(tài)有關(guān)，提示Notch1、STAT3、Pim1高表達(dá)的乳腺癌患者使用靶向ER的內(nèi)分泌治療方法可能獲得較好的療效。

本研究通過Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，Pim1、 Notch1高表達(dá)與低表達(dá)患者的生存期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，STAT3高表達(dá)患者的生存期顯著低于STAT3低表達(dá)患者，提示STAT3高表達(dá)會導(dǎo)致乳腺癌患者生存期降低。此外，本研究通過COX模型多因素分析顯示，年齡、組織學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、Her-2狀態(tài)及Notch1、Pim1、 STAT3蛋白表達(dá)水平與乳腺癌患者的生存期無顯著相關(guān)性，均不是乳腺癌患者生存期縮短的獨(dú)立預(yù)后因素，究其原因可能與樣本量偏少、隨訪時間較短、乳腺癌患者術(shù)后5 a生存率較高等因素有關(guān),提示Notch1、STAT3和Pim1的聯(lián)合檢測可能會在術(shù)后更長時間體現(xiàn)出其預(yù)后評估價值。

綜上所述，Pim1與Notch1之間在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展的過程中可能存在協(xié)同的促進(jìn)作用，ER和STAT3可能是二者間發(fā)生作用的關(guān)鍵因子，但具體機(jī)制有待細(xì)胞學(xué)水平和動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。Notch1、STAT3和Pim1等基因的聯(lián)合檢測在長期預(yù)后評估中可能具有一定的價值，這有待繼續(xù)增加樣本量以及更長時間隨訪的研究證實(shí)。