張谷香,李書萍,李 波
(長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖南 長(zhǎng)沙 410006)
卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,發(fā)病率和病死率均較高,嚴(yán)重危害女性健康[1]。卵巢生理結(jié)構(gòu)復(fù)雜,隱藏較深不易觸及,多數(shù)卵巢癌患者確診時(shí)已是中晚期,患者5 a生存率為40%~50%[2]。目前,卵巢癌以手術(shù)及放射治療和化學(xué)治療為主,但有研究顯示,手術(shù)后50%以上的卵巢癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā),且多數(shù)伴隨腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;放射治療和化學(xué)治療雖然效果較好,但其毒副作用較大,影響預(yù)后[3-4]。因此,研發(fā)新的抗卵巢癌藥物已經(jīng)成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。
中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)為腫瘤的臨床治療提供了新的思路。蟲草素是從冬蟲夏草和蛹蟲草中提取的有效成分,其具有廣譜抗腫瘤活性[5]。但蟲草素抗卵巢癌的作用機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步研究。Fra-1是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族中的一員,其作為原癌基因,能夠促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)及發(fā)展[6]。p53基因具有促進(jìn)損傷細(xì)胞修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞基因合成及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[7]。基于此,本研究通過探討蟲草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及Fra-1、p53表達(dá)的影響,進(jìn)一步分析其對(duì)卵巢癌的作用機(jī)制。
1.1 細(xì)胞、藥品、試劑與儀器人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所;蟲草素購(gòu)自河南希望生物技術(shù)有限公司;p53抗體購(gòu)自深圳豪地華拓生物科技有限公司,F(xiàn)ra-1抗體購(gòu)自上海士峰生物科技有限公司,Hoechst試劑盒購(gòu)自北京晶美科技,RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、2.5 g·L-1胰蛋白酶消化液購(gòu)自中盛溯源生物技術(shù)有限公司;二氧化碳(carbon dioxide,CO2)培養(yǎng)箱購(gòu)自濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司,EPS200電泳儀購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)將低溫冷藏的SKOV3細(xì)胞快速移入37 ℃水中溶解,3 000 r·min-1離心10 min后棄上清液,加入含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d傳代1次。
1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞活性取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞,加入2.5 g·L-1胰蛋白酶100 μL消化后,將SKOV3細(xì)胞制成懸浮液,以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為A組、B組、C組和D組,分別加入0、10、30、60 μmol·L-1蟲草素,培養(yǎng)48 h后,每孔加入10 μL CCK-8 試劑盒溶液,然后置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)4 h,使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞活性,具體計(jì)算公式參考文獻(xiàn)[6]。
1.2.3 Hoechst染色檢測(cè)SKOV3細(xì)胞凋亡率將0、10、30、60 μmol·L-1蟲草素處理后的SKOV3細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板,40 g·L-1多聚甲醛固定0.5 h,采用TrintonX-100透明處理,Hoechst熒光染料室溫染色30 min后,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算細(xì)胞凋亡率,細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。
1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞侵襲能力將50 mg·L-1的Mtrigel膠用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)按照18比例進(jìn)行稀釋,自然風(fēng)干后吸出殘存的液體。將4組細(xì)胞全部接種在處理好的上室內(nèi),細(xì)胞密度為 1×106L-1,在下室內(nèi)加入FBS進(jìn)行培養(yǎng)。使用棉簽將 Transwell小室內(nèi)壁膜上的細(xì)胞拭去,體積分?jǐn)?shù)95%乙醇固定30 min,結(jié)晶紫染色,顯微鏡視野中出現(xiàn)的有核細(xì)胞即為侵襲細(xì)胞,隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。
1.2.5 免疫印跡法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53蛋白相對(duì)表達(dá)量培養(yǎng)72 h的SKOV3細(xì)胞,PBS沖洗,300×g離心5 min;加入100 μL 2.5 g·L-1胰蛋白裂解液,二辛可寧酸定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量,1 200×g離心10 min,用5×上樣緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中,按照41的比例進(jìn)行混合,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用蛋白質(zhì)定量法檢測(cè)總蛋白濃度,每孔蛋白上樣量20 μg,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺鈉凝膠電泳,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶室溫封閉60 min,分別加入稀釋后的Fra-1一抗(11 000)、p53一抗(11 000),4 ℃封閉過夜;加入稀釋后過氧化物酶標(biāo)記的二抗(15 000),室溫?fù)u床孵育2 h,緩沖液振蕩清洗(3×10 min),增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng) 3 min,最后用X線膠片壓片,顯影、定影后攝片并分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參,以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。
1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53 mRNA表達(dá)量將2 mL密度為1 × 109L-1的SKOV3細(xì)胞接種于6孔板中,將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,按照TRIzol說明書進(jìn)行總RNA提取和純化。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR Green qRT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。Fra-1上游引物序列為5′-GAACCGGAGGAAGGAACTGACC3′,下游引物序列為5′-CCCAGATTTCTCATCTTCCAGTTTG-3′;p53上游引物序列為5′-GGACAGCCACGTCTGTGACTTG-3′,下游引物序列為5′-CCAGTGGTTTCTTCTTTGGCTG-3′;內(nèi)參β-action上游引物序列為5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′,下游引物序列為5′-GTCACGCACGATTTCCGCT -3′。擴(kuò)增條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);95 ℃15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Fra-1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量。
2.1 不同濃度蟲草素對(duì)SKOV3細(xì)胞活性的影響A組、B組、C組、D組SKOV3細(xì)胞活性分別為(100.00±10.50)%、(94.35±8.85)%、(65.01±6.44)%、(48.90±5.22)%,各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.610,P<0.001)。A組與B組SKOV3細(xì)胞活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);C組及D組SKOV3細(xì)胞活性低于A組及B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組SKOV3細(xì)胞活性低于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.2 不同濃度蟲草素對(duì)SKOV3凋亡率的影響結(jié)果見圖1。A組、B組、C組、D組SKOV3細(xì)胞凋亡率分別為(6.63±0.55)%、(8.44±1.25)%、(23.90±3.22)%、(37.50±4.01)%,各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=149.200,P<0.001)。A組與B組SKOV3細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);C組及D組SKOV3細(xì)胞凋亡率高于A組及B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組SKOV3細(xì)胞凋亡率高于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖1 不同濃度蟲草素對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響(Hoechst染色,×200)
2.3 不同濃度蟲草素對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響結(jié)果見圖2。A組、B組、C組、D組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(245±12)、(233±10)、(160±11)、(95±8)個(gè),各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=215.600,P<0.001)。A組與B組穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);C組及D組穿膜細(xì)胞數(shù)少于A組、B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組穿膜細(xì)胞數(shù)少于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖2 不同濃度蟲草素對(duì)SKOV3侵襲數(shù)目的影響(結(jié)晶紫染色,×200)
2.4 4組SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖3。 A組、B組、C組、D組SKOV3細(xì)胞中Fra-1及p53蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FFra-1蛋白=191.300,F(xiàn)p53蛋白=160.900;P<0.001)。A組與B組SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);C組及D組SKOV3細(xì)胞中Fra-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于A組及B組,p53蛋白相對(duì)表達(dá)量高于A組、B組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組SKOV3細(xì)胞中Fra-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于C組,p53蛋白相對(duì)表達(dá)量高于C組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖3 4組SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53蛋白的表達(dá)(Western blot)
表1 4組SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53蛋白相對(duì)表達(dá)量比較
2.5 4組SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見表2。A組、B組、C組及D組SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FFra-1 mRNA=142.300,F(xiàn)p53 mRNA=113.500,P<0.001)。A組與B組SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);C組及D組SKOV3細(xì)胞中Fra-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于A組及B組,p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于A組及B組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組SKOV3細(xì)胞中Fra-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于C組,p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于C組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表2 4組SKOV3細(xì)胞中Fra-1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較
近年來,隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變及環(huán)境因素的影響,惡性腫瘤患者不斷增多。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞活性升高、凋亡機(jī)制失衡等密切相關(guān)。卵巢癌是導(dǎo)致女性死亡率逐年攀升的主要誘因,患者手術(shù)治療后易復(fù)發(fā),需要反復(fù)治療,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)在惡性腫瘤的治療中越來越受到重視。蟲草素是我國(guó)較為名貴的中藥提取物,既往體外實(shí)驗(yàn)表明,蟲草素能夠抑制乳腺癌、宮頸癌細(xì)胞增殖,起到抗腫瘤效果,改善患者預(yù)后[9]。本研究通過體外培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞,并經(jīng)不同濃度蟲草素干預(yù),觀察其對(duì)SKOV3細(xì)胞生物活性及信號(hào)通路的影響。
卵巢癌細(xì)胞存在多種表型異常,最顯著的特征是癌細(xì)胞生長(zhǎng)異常,細(xì)胞凋亡失調(diào),發(fā)生機(jī)制與癌細(xì)胞生長(zhǎng)缺少對(duì)調(diào)控信號(hào)應(yīng)答有關(guān)。卵巢癌細(xì)胞快速增殖,主要表現(xiàn)特征是促癌基因快速?gòu)?fù)制,蛋白質(zhì)加快合成,細(xì)胞體積增大后不斷分裂,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[10]。臨床通常采用藥物干預(yù)加快腫瘤細(xì)胞凋亡,達(dá)到治療疾病的目的。腫瘤細(xì)胞侵襲是癌細(xì)胞從原有宿主細(xì)胞內(nèi)分離出來,向癌旁組織或細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)浸潤(rùn)生長(zhǎng)。有研究顯示,癌細(xì)胞能夠進(jìn)入淋巴,通過特有的通道進(jìn)入靶向部位,黏附后又穿過血管壁,在基質(zhì)層內(nèi)不斷增殖,形成與原發(fā)腫瘤相似的繼發(fā)腫瘤[11]。蟲草素起初是由德國(guó)學(xué)者從蛹蟲草提取的腺苷類似物抗生素,生物活性廣泛。近期研究發(fā)現(xiàn),蟲草素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲并加快其凋亡,其機(jī)制可能為通過結(jié)合A3腺苷受體,激活G蛋白,抑制環(huán)單磷腺苷形成,減少糖原合酶激酶-3β/β-聯(lián)蛋白及細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá),從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的效果[12-13]。WANG等[14]研究表明,蟲草素通過結(jié)合DR3受體誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡,從而激活促凋亡蛋白caspase-8/-3,抑制癌細(xì)胞活性。本研究結(jié)果顯示,隨著蟲草素濃度的升高,SKOV3細(xì)胞生物活性減弱,凋亡加劇,說明蟲草素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞活性,控制腫瘤生長(zhǎng)。
Fra-1基因存在于轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族的Fos亞家族中,其可通過激活促分裂原活化蛋白激酶等信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。有研究顯示,F(xiàn)ra-1在多種癌細(xì)胞內(nèi)呈過表達(dá),并參與癌細(xì)胞的惡性侵襲及分裂等過程[15]。Fra-1能夠加快卵巢癌細(xì)胞活性,促進(jìn)癌細(xì)胞有絲分裂,對(duì)腫瘤的發(fā)展有正向促進(jìn)作用[16]。在人乳頭狀瘤病毒(human papilloma rirus,HPV)感染相關(guān)的舌癌中,外源性敲除Fra-2基因,舌癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9、cyclinD和HPV E6/E7下調(diào),細(xì)胞增殖率、遷移及侵襲數(shù)量均顯著降低,表明沉默F(xiàn)ra-1具有抗腫瘤作用[17]。WU等[18]研究顯示,通過siRNA技術(shù)沉默F(xiàn)ra-1后,卵巢癌細(xì)胞活性降低,化學(xué)治療敏感性升高,其作用機(jī)制與靶向細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/C-Jun N末端激酶信號(hào)通路有關(guān)。p53進(jìn)化相對(duì)保守,能夠修復(fù)損傷細(xì)胞,加快細(xì)胞滅活。在卵巢癌細(xì)胞p53呈低表達(dá),且隨著卵巢癌細(xì)胞活性增加,p53表達(dá)水平逐漸降低[19]。張瑞濤等[20]研究顯示,當(dāng)機(jī)體發(fā)生p53信號(hào)突變時(shí),對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用減弱。本研究結(jié)果顯示,不同濃度蟲草素干預(yù)SKOV3細(xì)胞后,隨著蟲草素濃度的增加,p53表達(dá)升高,F(xiàn)ra-1表達(dá)降低。盧群等[21]和劉建兵等[22]研究顯示,蟲草素誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡與激活p53蛋白表達(dá)、降低Bcl-2/Bax水平、誘導(dǎo)caspase-3活化有關(guān)。武亭宇等[23]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),蟲草素可作用于p53等多個(gè)癌癥靶點(diǎn)基因,參與線粒體膜電位調(diào)節(jié),通過調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,降低鉑類耐藥性,可作為潛在的抗癌藥物進(jìn)一步研究。
綜上所述,蟲草素可抑制SKOV3細(xì)胞活性,降低其侵襲能力,促進(jìn)其凋亡,且呈現(xiàn)濃度依賴性,其機(jī)制可能與升高p53表達(dá)、降低Fra-1表達(dá)相關(guān)。