王明剛

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (廣西 南寧，530023)

肝衰竭以肝細(xì)胞大量壞死及/或凋亡為基本病理特征，肝細(xì)胞大面積死亡后肝組織出現(xiàn)不同程度的異構(gòu)，較為直接的表現(xiàn)形式即為肝微循環(huán)障礙，特別是遠(yuǎn)端微血管受累，這也是中醫(yī)肝臟“瘀血內(nèi)阻”的生物學(xué)機制[1,2]。改善肝臟微循環(huán)以營造促進(jìn)肝再生的良好內(nèi)環(huán)境是肝衰竭研究的熱點和難點。中藥大黃-赤芍具有活血化瘀、瀉熱解毒功效，研究發(fā)現(xiàn)其能提高肝衰竭大鼠存活率，改善肝功能的急劇惡化[3]，提高血清白細(xì)胞介素(IL-6)含量[4]，促進(jìn)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)接頭蛋白Gab1是遠(yuǎn)端微血管再生的上游關(guān)鍵信號分子[6]，通過Gab1-Akt信號通路發(fā)揮效應(yīng)。本研究通過觀察大黃-赤芍中藥顆粒溶解物對肝衰竭大鼠模型肝組織Gab1與Akt表達(dá)的影響，探索其“祛瘀生新”的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠45只，雄性，體重為(250±30)g(長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供)。隨機分為3組：空白組15只、模型對照組15只、大黃-赤芍中藥顆粒溶解物處理組(簡稱大黃-赤芍組)15只。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥物組成及主要試劑 大黃10 g、赤芍30 g采用配方顆粒(江陰天江藥業(yè))，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。使用雙蒸水充分溶解藥物，藥物濃度設(shè)定為3.6 g/ml。Gab1(9272S)、Akt(3232S)及β-actin(3700S)抗體購于CST公司。

1.3 肝衰竭動物模型建立 D氨基半乳糖600 mg/kg聯(lián)合LPS 20 μg/kg一次腹腔注射復(fù)制肝衰竭大鼠模型。大黃-赤芍中藥顆粒溶解物在造模前48 h開始灌胃給藥，給藥劑量為7.2 g/(kg·d)，一直延續(xù)至造模后48 h。模型對照組給予等量蒸餾水代替。

1.4 標(biāo)本采集與處理 造模48 h后，用1%戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠，腹主動脈采血，離心收集血清；剖取肝臟，PBS洗凈肝組織，濾紙吸干，稱重后分別予10%甲醛液固定及液氮保存，用于Western Blot及熒光定量PCR檢測。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 WesternBlot檢測肝組織中Gab1、Akt蛋白表達(dá) 提取各組大鼠肝組織總蛋白，Bio-Rad法測定蛋白含量。取蛋白30 μg作SDS-PAGE電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1.5 h，PBST洗3次后分別加入抗Gab1(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)多克隆抗體，4℃孵育過夜。分別加入相應(yīng)的過氧化物酶標(biāo)記二抗，脫色搖床搖1 h，PBST洗3次，每次5 min。DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照分析。IPP 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.5.2 熒光定量PCR檢測肝組織Gab1、Akt mRNA表達(dá) 提取各組大鼠肝組織總RNA，紫外-分光光度計測定總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，配置 20 μl qPCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，RNase Free Water 6.4 μl，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μl，合成的cDNA 2 μl。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s(40個循環(huán))；72℃延伸5 min。擴增反應(yīng)在Roche LightCycler 480熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 大黃-赤芍中藥顆粒溶解物上調(diào)肝衰竭大鼠肝組織Gab1表達(dá) 肝衰竭模型大鼠肝組織中Gab1蛋白和mRNA均出現(xiàn)應(yīng)激性升高，mRNA表達(dá)量與空白組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃-赤芍組大鼠肝組織Gab1蛋白和mRNA同樣被上調(diào)表達(dá)，且與模型組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，研究結(jié)果提示大黃-赤芍中藥顆粒溶解物可上調(diào)肝衰竭大鼠肝組織Gab1蛋白及mRNA表達(dá)水平，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織Gab1蛋白及mRNA表達(dá)情況

2.2 大黃-赤芍中藥顆粒溶解物上調(diào)肝衰竭大鼠肝組織Akt蛋白及mRNA表達(dá) Akt蛋白生物活性廣泛，其也是Gab1下游的鏈接分子，參與微血管新生過程。研究中，肝衰竭模型大鼠肝組織中Akt蛋白和mRNA表達(dá)量升高，其中mRNA表達(dá)量與空白組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃-赤芍組大鼠肝組織Akt蛋白和mRNA被上調(diào)表達(dá)，且與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，研究結(jié)果提示大黃-赤芍中藥顆粒溶解物可上調(diào)肝衰竭大鼠肝組織Gab1下游Akt表達(dá)水平，見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織Akt蛋白及mRNA表達(dá)情況

2.3 大黃-赤芍中藥顆粒溶解物改善肝衰竭大鼠肝組織微循環(huán)狀態(tài) 大黃-赤芍是中藥活血化瘀、瀉熱解毒的常用藥對，在肝衰竭臨床防治中出現(xiàn)頻率極高。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃-赤芍能提高肝衰竭大鼠肝組織Gab1及Akt表達(dá)，二者與遠(yuǎn)端微血管新生關(guān)系密切。結(jié)合前期研究結(jié)果：大黃-赤芍能改善肝衰竭大鼠肝功能，促進(jìn)PCNA表達(dá)，提高肝再生能力，提高肝組織NO含量[7]。由此推測，大黃-赤芍改善肝衰竭大鼠肝組織遠(yuǎn)端微血管循環(huán)狀態(tài)，糾正惡化的血液流變，為肝再生營造良好的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，提高肝再生能力，以盡快恢復(fù)肝臟功能。

3 討論

肝衰竭是臨床常見的嚴(yán)重肝病癥候群，病死率極高。肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)是肝臟正常生理活動的基礎(chǔ)，在肝衰竭狀態(tài)下肝內(nèi)微環(huán)境狀態(tài)出現(xiàn)嚴(yán)重偏移。這些微環(huán)境不僅包括了肝內(nèi)微循環(huán)狀態(tài)(血管微環(huán)境及血液流變學(xué)狀態(tài))，還囊括了免疫/炎癥微環(huán)境、缺氧微環(huán)境及干細(xì)胞微環(huán)境等，臨床治療的根本著眼點還是在改善以上微環(huán)境以營造良好肝再生狀態(tài)，以期能夠保障肝臟功能快速代償。這對肝衰竭的臨床綜合治療手段提出了極高的要求，至少來說，關(guān)鍵的微環(huán)境狀態(tài)必須得到快速糾正，否則肝臟功能將失去重新代償?shù)年P(guān)鍵時間窗。我國的肝衰竭綜合治療手段起步較晚，第一部《肝衰竭診療指南》于2006年頒布，至此肝衰竭的臨床治療才有了規(guī)范化的指引標(biāo)準(zhǔn)[8]。2019年1月我國對《肝衰竭診療指南》進(jìn)行全面更新，極大提高了臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)化操作及預(yù)期的臨床療效目標(biāo)[9]。

從肝衰竭發(fā)病的病理特點來看，其實肝內(nèi)微循環(huán)障礙貫穿的整個疾病過程，特別是肝臟遠(yuǎn)端的一些微小血管。首先，肝組織大面積死亡后肝臟正常結(jié)構(gòu)被異構(gòu)，微循環(huán)的空間間隙被壓縮，肝臟遠(yuǎn)端部分區(qū)域直接形成壞死區(qū)塊；其次，難以避免的進(jìn)一步出現(xiàn)肝臟內(nèi)部血液流變學(xué)改變，進(jìn)而誘發(fā)微小血管血栓形成，加重循環(huán)障礙與灌注區(qū)域缺血血氧；并且，惡化的肝臟代謝合成能力，對整個凝血機制的穩(wěn)態(tài)維持出現(xiàn)深層次偏移，直接波及肝臟內(nèi)部凝血微環(huán)境，加重肝內(nèi)微循環(huán)障礙[2]。能否適時的改善肝衰竭時肝內(nèi)微循環(huán)，為肝再生營造良好的內(nèi)環(huán)境是進(jìn)一步提高肝衰竭臨床救治水平的關(guān)鍵突破點之一。

接頭蛋白Gab1是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣泛的Gab家族蛋白，其能被多種酪氨酸激酶受體或非酪氨酸激酶受體激活，接受胞外多種生長因子、細(xì)胞因子和一些T/B細(xì)胞抗原的刺激，介導(dǎo)AKT、JNK、MAPK等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有調(diào)控生長發(fā)育、血管形成、免疫適疫等廣泛的生物學(xué)功能[10]。早年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Gab1能通過與血管內(nèi)皮生長受體(VEGFR)2 形成多分子的復(fù)合體，激活PLC-r和Erk1/2促進(jìn)細(xì)胞增殖，激活A(yù)kt促進(jìn)細(xì)胞的遷移和存活[11]，若在內(nèi)皮細(xì)胞中降低Gab1的表達(dá)，磷酸化FOXO1明顯降低，細(xì)胞存活直接受到影響[12]。至于Gab1在血管再生扮演什么角色及下游的效應(yīng)分子一直沒有明確，直到近年來，采用基因敲除技術(shù)將大鼠Gab1基因剔除，以致?lián)p傷的血管根本無法再生，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮效應(yīng)的主要是通過“Gab1-Akt-eNOS”實現(xiàn)。

肝衰竭歸屬于中醫(yī)“黃疸”病范疇，進(jìn)而有分為陽黃和陰黃兩大類，近代以來對該病病因、病機的全新認(rèn)識，使臨床療效大為提高。項目組繼承肝衰竭“毒邪病因”新學(xué)說[13]，“熱毒內(nèi)蘊、瘀血內(nèi)阻”是肝衰竭發(fā)病的核心中醫(yī)病機。大黃味苦性大寒，歸肝、脾、胃、大腸經(jīng)，不僅有解毒、活血化瘀、利膽退黃之功，且有推陳出新、蕩滌腸胃、釜底抽薪的功效，通腑瀉熱其效最優(yōu)；赤芍味苦性微寒，入肝、脾經(jīng)，為祛血分瘀血的要藥，是肝臟活血化瘀的必用之藥，也是肝衰竭臨床應(yīng)用出現(xiàn)頻次最高藥物。大黃-赤芍兩藥的功效與肝衰竭中醫(yī)病機機制最為切合。2009年毛德文教授研究小組收集了1997～2007年國內(nèi)專業(yè)期刊文獻(xiàn)共328篇，在治療肝衰竭的503方個中藥復(fù)方中，藥物配伍分布發(fā)現(xiàn)，大黃-赤芍配伍同時出現(xiàn)在218個方劑中[14]，大黃-赤芍作為治療本病的要藥已被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同。

本研究中發(fā)現(xiàn)模型對照組大鼠Gab1及Akt表達(dá)升高，與正常組比較其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這可能與大面積肝損傷后，肝組織應(yīng)激性啟動肝再生機制以試圖挽救瀕臨崩潰的肝臟功能。肝衰竭大鼠經(jīng)過大黃-赤芍中藥顆粒溶解物干預(yù)處理后，肝組織中Gab1及Akt表達(dá)也同樣升高，與模型組比較其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，研究結(jié)果提示大黃-赤芍可增強Gab1-Akt信號傳導(dǎo)強度，促進(jìn)下游微血管新生等改善肝臟微循環(huán)的功能作用，這與大黃-赤芍活血化瘀、祛瘀生新的功能特性高度吻合。深入闡明大黃-赤芍活血化瘀、祛瘀生新以防治肝衰竭的分子機制是需要重點突破的關(guān)鍵科學(xué)問題，以此演化出某些具備功能活性的小分子化合物或小分子團(tuán)，持續(xù)優(yōu)化大黃-赤芍劑型設(shè)置將帶來廣闊的臨床應(yīng)用空間與前景。