賴呈純 賴恭梯 張靜 闕秋霞 潘若 高慧穎 王琦

摘 要：以2個刺葡萄愈傷組織細(xì)胞系為材料，利用比色和分光光度法測定不同刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物的總抗氧化活性，分析不同培養(yǎng)階段和肉桂酸、光照條件、黑暗條件、溫度（4℃、37℃）、殼聚糖、中波紫外線（UV-B）等不同處理方式對刺葡萄愈傷組織總抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：不同培養(yǎng)階段的刺葡萄紅色愈傷組織花色苷和非花色苷多酚提取液均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，不同培養(yǎng)階段的刺葡萄紅色愈傷組織花色苷提取液抗氧化活性呈雙峰，最高可達(dá)7.43 U·mg-1（FW），非花色苷多酚提取液抗氧化活性最高達(dá)28.36 U·mg-1（FW），而不同培養(yǎng)階段的淺黃綠色愈傷組織花色苷和非花色苷多酚提取液的抗氧化活性均非常低。經(jīng)不同處理后的刺葡萄愈傷組織其花色苷和非花色苷多酚提取液總抗氧化活性存在較豐富的變化，4℃處理對于提高紅色刺葡萄愈傷組織花色苷提取液抗氧化活性最為有效，而殼聚糖處理可最高效地提高非花色苷多酚提取液的總抗氧化活性。淺黃綠色愈傷組織花色苷和非花色苷多酚提取液抗氧化活性均極低，肉桂酸、光照條件、溫度、殼聚糖、UV-B處理對其抗氧化活性幾乎沒有影響。

關(guān)鍵詞：刺葡萄;愈傷組織;提取物;花色苷;抗氧化活性

中圖分類號：S 663.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號：0253-2301（2021）06-0040-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.06.007

Abstract： In this study， by using two callus cell lines of Vitis davidii as the materials， the total antioxidant activities of different callus cell cultures of Vitis davidii were determined by using the colorimetric method and spectrophotometric method， thus to analyze the effects of different culture stages and methods such as cinnamic acid， light conditions， dark conditions， temperature （4℃， 37℃）， chitosan and ultraviolet-B （UV-B） on the total antioxidant activity of Vitis davidii callus. The results showed that the anthocyanin and non-anthocyanin polyphenol extracts from the red callus of Vitis davidii at different culture stages had strong antioxidant activities. The antioxidant activity of anthocyanin extracts from the red callus of Vitis davidii at different culture stages showed double peaks， with the maximum value of 7.43 U·mg-1 （FW）， and that of non-anthocyanin polyphenol extracts was up to 28.36 U·mg-1 （FW）. However，the antioxidant activities of anthocyanin and non-anthocyanin polyphenol extracts from light yellow-green callus at different culture stages were very low. The total antioxidant activities of anthocyanin and non-anthocyanin polyphenol extracts from the callus of Vitis davidii under different treatments had abundant variations. The treatment with temperature of 4℃ was the most effective in improving the antioxidant activity of anthocyanin extracts from the red callus of Vitis davidii， while the treatment with chitosan was the most effective in improving the total antioxidant activity of non-anthocyanin polyphenol extracts. The antioxidant activities of anthocyanin and non-anthocyanin polyphenol extracts from light yellow-green callus were extremely low， and the treatments with cinnamic acid， illumination condition， temperature， chitosan and UVB had little effect on their antioxidant activities.

Key words： Vitis davidii; Callus; Extract; Anthocyanins; Antioxidant activity

刺葡萄Vitis davidii Fox為葡萄科葡萄屬東亞種群的一個野生種[1-2]。刺葡萄果實(shí)富含酚類、黃酮、丹寧、花色苷等化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化活性[3-5]。研究表明，葡萄酚類[6]、黃酮[7]、花色苷[8]和原花青素[9]等天然活性化合物對人類健康有重要的生理和藥理功能，在食品、藥品和化妝品工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用前景。隨著市場需求的不斷擴(kuò)大，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物天然活性化合物越來越受到重視，并且有些已開始規(guī)?；a(chǎn)[10]。利用刺葡萄幼胚誘導(dǎo)獲得了2個刺葡萄愈傷組織細(xì)胞系[11]，其中紅色愈傷組織富含酚類、黃酮、花色苷和非花色苷多酚等天然活性化合物[12-14]。為了進(jìn)一步了解刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物提取物的抗氧化活性，本研究以刺葡萄愈傷組織不同階段細(xì)胞培養(yǎng)物和不同處理細(xì)胞培養(yǎng)物為材料，利用總抗氧化活性測定（TAOC）方法，對細(xì)胞不同提取液的抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)分析，為通過刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以長期繼代保持的2個刺葡萄愈傷組織細(xì)胞系為材料，其中一個愈傷組織為紅色，富含花色苷和原花青素;另一個愈傷組織為淺黃綠色[11]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同階段刺葡萄愈傷組織的獲取 2個刺葡萄愈傷組織細(xì)胞系培養(yǎng)20 d后，挑取生長旺盛愈傷組織，接種到附加2，4

D 1.0 mg·L-1的MS固體培養(yǎng)基中，于光照下培養(yǎng)。培養(yǎng)到第10 d后開始隨機(jī)取樣，以后每隔5 d取樣1次，一直取樣到第60 d，即取樣時間分別為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d，共取樣11次;每次隨機(jī)取樣21瓶，刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物收集后均勻混合，分裝后于液氮中速凍2～3 min，-80℃下保存?zhèn)溆?。試?yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 刺葡萄愈傷組織不同處理與培養(yǎng) 2個刺葡萄愈傷組織細(xì)胞系培養(yǎng)20 d后，挑取生長旺盛愈傷組織，接種到附加2，4D 1.0 mg·L-1的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。試驗(yàn)分別設(shè)7個處理，分別為（1）光照條件處理（CK）：于25℃ 24 h光照條件下培養(yǎng)25 d后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物;（2）黑暗條件處理：于25℃ 24 h黑暗條件下培養(yǎng)25 d后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物;（3）肉桂酸處理：將培養(yǎng)24 d的刺葡萄愈傷組織從培養(yǎng)瓶中取出，平鋪在肉桂酸40 mg·L-1（用培養(yǎng)基溶解定容）浸泡過的無菌濾紙，并置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)物;（4）殼聚糖處理：將培養(yǎng)24 d的刺葡萄愈傷組織從培養(yǎng)瓶中取出，平鋪在殼聚糖800 mg·L-1（用培養(yǎng)基溶解定容）浸泡過的無菌濾紙，并置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)物;（5）UV-B處理：將培養(yǎng)24 d的刺葡萄細(xì)胞去除瓶蓋后，置于0.15 W·m-2 UV-B照射3 h后，培養(yǎng)1 d收集細(xì)胞培養(yǎng)物;（6）4℃處理：將培養(yǎng)24 d的刺葡萄細(xì)胞從培養(yǎng)室中取出，置于4℃培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)物;（7）37℃處理：將培養(yǎng)24 d的刺葡萄細(xì)胞從培養(yǎng)室中取出，置于37℃培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)物。試驗(yàn)另外設(shè)觀察對照：將刺葡萄愈傷組織接種到附加 KT 0.5 mg·L-1和 2，4D 1.0 mg·L-1的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)物。各處理所獲細(xì)胞培養(yǎng)物混合均勻后于液氮中速凍2～3 min，-80℃下保存?zhèn)溆?。試?yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 制備刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物提取液 花色苷提取液采用鹽酸乙醇法提取，非花色苷多酚提取液用80%甲醇提取法提取，具體方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.4 總抗氧化活性（TAOC）測定 葡萄細(xì)胞提取液總抗氧化活性（TAOC）測定按照南京建成生物工程研究所、南京建成科技有限公司試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)整理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理分析，利用DPS軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，使用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)階段的刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物花色苷提取液總抗氧化活性

對2個刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)10～60 d的細(xì)胞培養(yǎng)物花色苷提取液總抗氧化活性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，2種刺葡萄愈傷組織的總抗氧化活性變化趨勢差異很大，刺葡萄淺黃綠色愈傷組織在整個培養(yǎng)過程的總抗氧化水平都維持在一個很低的水平，并且隨著后期細(xì)胞的衰老，總抗氧化活力會逐步降低。從刺葡萄紅色愈傷組織的總抗氧化活性看，從培養(yǎng)10～35 d總抗氧化活力隨著細(xì)胞的增殖生長先略微下降后逐漸增強(qiáng)，最低點(diǎn)在培養(yǎng)15 d時，為0.73 U·mg-1FW，到35 d時達(dá)到1個高峰，此時總抗氧化活力為7.12 U·mg-1FW，是最低點(diǎn)的9.75倍，隨后迅速下降，培養(yǎng)40 d時總抗氧化活力為5.34 U·mg-1FW，之后又迅速上升;培養(yǎng)45 d時達(dá)到最高峰，為7.43 U·mg-1FW，是最低點(diǎn)的10.18倍;培養(yǎng)45～60 d，隨著細(xì)胞的衰老和死亡，總抗氧化活力迅速下降，到培養(yǎng)60 d時總抗氧化活力只有2.50 U·mg-1FW。

2.2 不同培養(yǎng)階段的刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物非花色苷多酚提取液總抗氧化活性分析

2個刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)10～60 d的細(xì)胞培養(yǎng)物非花色苷多酚提取液總抗氧化活性的分析見圖2。從圖2可以看出，2種刺葡萄愈傷組織的總抗氧化活性變化趨勢差異很大，刺葡萄淺黃綠色愈傷組織在整個培養(yǎng)過程的總抗氧化水平都維持在一個很低的水平，并且變化不大。刺葡萄紅色愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物非花色苷多酚提取液的總抗氧化活性表現(xiàn)為先略微下降后快速增加，最低點(diǎn)在培養(yǎng)15 d時，為4.60 U·mg-1FW;培養(yǎng)35～40 d有一個平臺區(qū)，培養(yǎng)45 d達(dá)到最高峰，為28.36 U·mg-1FW，是15 d時的6.17倍;培養(yǎng)45 d后隨著細(xì)胞的衰老死亡，總抗氧化活性迅速下降，到培養(yǎng)60 d時只有9.00 U·mg-1FW。

2.3 不同處理下刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物花色苷提取液總抗氧化活性

將2個刺葡萄愈傷組織分別經(jīng)肉桂酸、光照條件、黑暗條件、溫度（4℃、37℃）、殼聚糖、UVB處理后，對其花色苷提取液的總抗氧化活性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，對于刺葡萄淺黃綠色愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物，花色苷提取液中的總抗氧化活性都維持在一個較低的水平，為0.1452～0.4357 U·mg-1FW。不同處理對刺葡萄紅色愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物花色苷提取液總抗氧化活性差異較大，其中采用4℃處理的花色苷提取液總抗氧化活性最高，為3.01 U·mg-1FW，是光照條件（CK）的2.15倍;其次是殼聚糖處理，為2.58 U·mg-1FW;第3是采用37℃處理，總抗氧化活性為2.30 U·mg-1FW;隨后分別為UVB（1.73 U·mg-1FW）、CK（1.40 U·mg-1FW）、肉桂酸（0.76 U·mg-1FW）和黑暗條件處理（0.08 U·mg-1FW）;黑暗條件處理的總抗氧化活性最低，遠(yuǎn)低于光照條件（CK），說明花色苷的合成需要光的參與。

2.4 不同處理下刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物非花色苷多酚提取液總抗氧化活性

2個刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)肉桂酸、光照條件、黑暗條件、溫度（4℃、37℃）、殼聚糖、UVB處理后的非花色苷多酚提取液總抗氧化活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，無論采用什么處理方式，刺葡萄淺黃綠色愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物非花色苷多酚提取液的總抗氧化活性都極低，這也從間接說明，淺黃綠色愈傷組織合成非花色苷多酚的能力極低。從刺葡萄紅色愈傷組織看，殼聚糖處理的效果最佳，總抗氧化活性達(dá)到29.80 U·mg-1FW，是CK（10.49 U·mg-1FW）的2.84倍，其次是37℃處理，總抗氧化活性為22.97 U·mg-1FW;第3是肉桂酸，為18.39 U·mg-1（FW），結(jié)合花色苷提取液分析，說明肉桂酸對花色苷合成有抑制作用，而對非花色苷多酚合成有促進(jìn)作用;其后是4℃、黑暗條件、UVB。UVB對非花色苷多酚的合成有強(qiáng)烈的抑制作用，其總抗氧化活性遠(yuǎn)低于光照條件（CK）的總抗氧化水平。

3 結(jié)論與討論

植物細(xì)胞提取液抗氧化活性水平高低，不僅跟提取液中抗氧化活性物質(zhì)含量有關(guān)，還與提取液中不同抗氧化物質(zhì)組分相關(guān)，是綜合作用的結(jié)果。在藍(lán)莓、紫薯、巨峰葡萄等提取液抗氧化活性的研究中，發(fā)現(xiàn)提取液抗氧化活性與提取液中抗氧化物質(zhì)含量呈正相關(guān)[15]，同時在葡萄皮[16]和6個葡萄品種[17]的抗氧化活性研究中，總抗氧化活性也與提取液中抗氧化物質(zhì)含量呈正相關(guān)。結(jié)合本研究前期不同階段和不同處理的刺葡萄愈傷組織花色苷和非花色苷多酚含量變化研究[13]，發(fā)現(xiàn)本研究中刺葡萄愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物提取液的總抗氧化活力無論是不同培養(yǎng)階段的細(xì)胞培養(yǎng)物提取液，還是不同處理均與其細(xì)胞培養(yǎng)物提取液中花色苷和非花色苷多酚的含量成正相關(guān)，其總抗氧化活性的變化趨勢與花色苷和非花色苷多酚含量變化的趨勢相似。

由于刺葡萄淺黃綠色愈傷組織合成花色苷和非花色苷多酚的效率極低，或沒有花色苷和非花色苷多酚的合成能力，所以其花色苷和非花色苷多酚提取液的總抗氧化活性極低，并且本研究所采用的處理方式均不能有效地增加其總抗氧化能力，其與刺葡萄紅色愈傷組織細(xì)胞系合成花色苷和非花色苷多酚能力的差別，可能是基因水平上的差異，這有待今后進(jìn)一步研究。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，刺葡萄紅色愈傷組織細(xì)胞系出現(xiàn)2個花色苷合成的高峰，其花色苷提取液也相對應(yīng)的有兩個總抗氧化活性的高峰，并且最高的總抗氧化活性是最低的10.18倍;刺葡萄紅色愈傷組織細(xì)胞系非花色苷多酚提取液的總抗氧化活性高峰也與其非花色苷多酚含量的高峰相一致，是最低點(diǎn)的6.17倍。本研究采用肉桂酸、光照條件、黑暗條件、溫度（4℃、37℃）、殼聚糖、UVB不同方式處理刺葡萄愈傷組織發(fā)現(xiàn)，花色苷和非花色苷多酚含量變化比較復(fù)雜，相對應(yīng)的花色苷和非花色苷多酚提取液總抗氧化活性也存在較豐富的變化，4℃處理對于提高花色苷的含量最為有效，總抗氧化活性是光照條件處理的2.15倍。而殼聚糖處理可最高效地提高非花色苷多酚的合成能力，對應(yīng)的總抗氧化活性是光照條件處理的2.84倍。對總抗氧化活性的測定也進(jìn)一步間接證實(shí)了肉桂酸會抑制花色苷的合成而促進(jìn)非花色苷多酚的合成;而UVB的作用卻與之相反，UVB可以促進(jìn)花色苷的合成而抑制非花色苷多酚的合成，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：林玲娜）