陳磊

摘 要：本文建立液相色譜配備三重四級桿質譜儀測定水生軟體動物中氯霉素的檢測方法。樣品經Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液提取，HLB固相萃取柱凈化，采用C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以乙腈和10 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相進行梯度洗脫，電噴霧負離子多反應監(jiān)測模式對氯霉素進行定性、定量測定。在線性范圍0.1～10.0 ng/mL范圍內，檢出限為0.10 μg/kg，平均回收率為73.3%～95.0%，相對標準偏差為0.62%～1.50%。建立此方法可實現(xiàn)對水生軟體動物中氯霉素的高效檢測。

關鍵詞：液相色譜;三重四級桿質譜儀;水生軟體動物;氯霉素

氯霉素是一種廣譜抗菌藥物，由Ehrlichz在1947年首次分離得到[1]。氯霉素不僅對多數革蘭氏陽（陰）性菌有很好的抑制作用，而且對沙門氏菌病和大腸桿菌病有很好的治療作用，因此在疾病的預防和治療方面得到了廣泛的應用[2-3]。但隨著廣泛應用后發(fā)現(xiàn)，氯霉素可導致人類再生障礙性貧血、粒細胞缺乏病、灰嬰綜合癥、溶血性貧血等，具有毒副作用[4-5]。當前許多國家在食品生產環(huán)節(jié)都禁止使用氯霉素，我國農業(yè)部于2019年頒布第250號公告《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留量》中規(guī)定氯霉素在動物源性食品中不得檢出[6-7]。目前現(xiàn)行有效的氯霉素檢測標準中樣品處理的步驟煩瑣，試劑耗材使用量大，因此本文提出一種高效、準確、環(huán)保的方法來檢測氯霉素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

AB 3500型液相色譜配備三重四級桿質譜儀（美國，SCIEX）;ME204/02型萬分之一天平（瑞士，梅特勒-托利多）;Arium-Pro型純水系統(tǒng)（德國，賽多利斯）;S-700B型多參數測試儀（瑞士，梅特勒-托利多）;T18型分散機（德國，IKA）;0.22 μmPTFE微孔濾膜（德國，CNW）;HC-3018型離心機（中國，中科中佳）;HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）（美國，waters）;24位固相萃取裝置（德國，CNW）;N-EVAP 5085型氮吹儀（美國，Organomation Associates）。

1.1.2 實驗試劑

氯霉素、D5-氯霉素均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供;乙腈（LC-MS級，默克）;甲酸（LC-MS級，TCI）;甲醇（LC-MS級，默克）;乙酸乙酯（色譜純，TEDIA）;氨水（優(yōu)級純，國藥）;檸檬酸（分析純，阿拉?。?磷酸氫二鈉（分析純，阿拉丁）;氫氧化鈉（分析純，國藥）;乙二胺四乙酸二鈉（分析純，國藥）;實驗室用水均為超純水。

1.1.3 試劑配制

①Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。稱取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 mL溶解，用1 mol/L氫氧化鈉調pH至4.0±0.5，加水定容至1 000 mL。②氯霉素標準儲備液（100 μg/mL）。準確稱取0.01 g

的氯霉素標準物質，用乙腈配制成 100 μg/mL標準儲備液。③氯霉素標準中間液（10 μg/mL）：移取1 mL 的氯霉素標準儲備液，用乙腈配制成10 μg/mL標準儲備液。④D5-氯霉素標準儲備液（100 μg/mL）。準確稱取0.01 g 的D5-氯霉素標準物質，用乙腈配制成100 μg/mL標準儲備液。

⑤D5-氯霉素標準中間液（1 μg/mL）。移取1 mL 的D5-氯霉素標準儲備液，用乙腈配制成1 μg/mL標準儲備液。

⑥D5-氯霉素標準工作液（0.1 μg/mL）。移取1 mL 的D5-氯霉素標準中間液，用乙腈配制成0.1 μg/mL標準儲備液。⑦氯霉素標準工作液。分別移取0.01 ml、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL 的氯霉素中間液和1 mLD5-氯霉素標準工作液至10 mL容量瓶中，并用初始流動相定容至刻度配制濃度為0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL，的工作液，混勻。

1.2 色譜條件與質譜條件

1.2.1 色譜條件

月旭Ultimate C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;柱溫：30 ℃;流速：0.3 mL/min;進樣量：2 μL;流動相：10 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B）;梯度洗脫程序見表1。

1.2.2 質譜條件

電噴霧電離源（ESI）;負離子掃描，多反應監(jiān)測（MRM）;離子源溫度（TEM）：550 ℃;電噴霧電壓：-4 500 V;氣簾氣：35 psi;噴霧氣（GS1）：55 psi;輔助加熱氣（GS2）：55 psi;其他質譜條件見表2。

1.3 實驗方法

稱取2.0 g（精確至0.1 mg）置于50 mL離心管中加入100 μL，

20 mLNa2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，10 000 r/min勻漿提取1 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液以2 mL/min的速度過HLB固相萃取柱（使用前分別用6 mL甲醇和6 mL水活化），待試樣完全流出后，依次用8 mL水和5 mL甲醇水溶液（甲醇∶水體積比為1∶19）淋洗，棄去全部流出液，抽干，用8 mL甲醇洗脫，在40 ℃水浴下氮氣吹至近干，用2 mL初始流動相復溶，過0.22 μmPTFE濾膜，待上機測試。氯霉素測試結果見圖1。

2 結果與分析

2.1 提取液的選擇

本文分別選用乙腈-Mcllvaine、堿化乙酸乙酯以及Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取液，對氯霉素進行提取。發(fā)現(xiàn)這3種提取液對氯霉素的提取效率沒有明顯差異，為減少有機試劑的使用量，本文最終選擇了Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液為提取液。

2.2 固相萃取柱的選擇

HLB固相萃取柱中的填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其對非極性至中等極性的酸性、中性、堿性目標化合物均有高而穩(wěn)定的回收率。即使柱床干涸，回收率也不受影響。相同規(guī)格下HLB固相萃取柱的柱容量是傳統(tǒng)C18固相萃取柱的3倍。因此選用HLB固相萃取柱進行樣品分析。

2.3 工作曲線和檢出限

按照實驗方法，對濃度分別為0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL標準系列溶液進行測定，以氯霉素的質量濃度為橫坐標，與其對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結果表明，氯霉素的質量濃度與其對應的峰面積之間呈線性關系。線性回歸方程和相關系數見表3。將混標添加在空白基質樣品中，在相同條件下進行6次平行試驗，按照3倍信噪比考察了氯霉素的檢出限（見表3）。

2.4 加標回收試驗

分別稱取4種水生軟體動物陰性樣品2.0 g（精確至

0.1 mg），按照實驗方法對其進行不同濃度水平的加標回收試驗，每個濃度平行進行6次實驗，計算回收率，結果見表4。

3 結論

本文建立了Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液為提取液，連用HLB固相萃取柱凈化的方法對市售水生軟體動物進行前處理，使用液相色譜聯(lián)用三重四級桿質譜儀測定氯霉素。該方法操作簡便、準確度高，經濟適用型好，分離度符合要求，適合軟體動物中氯霉素的定性和定量分析，為水生軟體動物的市場監(jiān)管提供了有力的技術支持。

參考文獻

[1]KIKUCHI H，SAKAI T，NEMOTO S，et al.Total determination of residual flut-olanil and its metabolites in livestock products and seafood using liquid chromato-graphy-tandem spectrometry[J].Food Additives and Contaminants：Part A，2018，35（12）：12366-92374.

[2]梅英杰，史新宇，董瑾，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時檢測雞肉中氯霉素、四環(huán)素、金霉素和土霉素[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2017，43（8）：240-245.

[3]李曉晶，潘幼嫻，于鴻，等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定水中氯霉素、氟甲砜霉素和4種四環(huán)素類抗生素[J].中國衛(wèi)生檢疫雜志，2013，23（11）：2426-2428.

[4]王安偉，劉天密，萆銳，等.水產品中氯霉素殘留檢測方法研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（11）：4259-4264.

[5]崔榮飛，趙興鑫，田梅，等.動物源性食品中非法添加物殘留危害及檢測技術[J].今日畜牧獸醫(yī)，2019，35（12）：1-3.

[6]國務院.中華人民共和國國務院令第404號《獸藥管理條例》[EB/OL].（2004-04-09）[2021-04-13].http：//www.gov.cn/zhengce/content/2008-03/28/content_3051.htm.

[7]農業(yè)部.動物性食品中獸藥最高殘留限量（中華人民共和國農業(yè)部第235號）[EB/OL].（2002-12-24）[2021-04-12].http：//www.eshian.com/laws/17195.html.