祝日榮 楊溢 倪強(qiáng) 孫睿 雷雨

摘要： 目的 研究藤茶的藥代分布情況及其與牛蒡子配伍的臨床功效。方法 采用不同劑量喂養(yǎng)大鼠36天，末次給藥1 h測量其心、肺、肝、脾、腎、心血組織樣品中的二氫楊梅素含量;選取105例慢性咽炎人志愿受試者，隨機(jī)分為試食組和對照組，分別為53例、52例，連續(xù)給藥30天，觀察試食前后的安全性和功效性指標(biāo)，采用自身對照，組間對照統(tǒng)計分析。結(jié)果 大鼠各項組織中均未檢出二氫楊梅素;臨床試食未見明顯不良反應(yīng)，安全性指標(biāo)正常，試食組臨床癥狀及清咽體征有效率分別為62.05%、57.63%，高于對照組改善率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 藤茶與牛蒡子配伍具有良好的清咽功效，且在該試驗劑量下安全性高。

關(guān)鍵詞：藤茶 ; 牛蒡子 ; 高效液相 ; 慢性咽炎

Abstract： Objective To study the Pharmacokinetics distribution of Ampelopsis grossedentata and the clinical efficacy of compatibility with Fructus arctiine. Methods The rats were fed with diffe-rent doses for 36 days， and the content of dihydromyricetin in the heart， lung， liver， spleen， kidney， heart and blood tissue samples was measured 1 hour after the last dose ; Choose 105 patients with chronic pharyngitis who are voluntarily tested， and randomly divide them into a test group with 53 cases and a control group with 52 cases. The drugs are continuously administered for 30 days. The safety and efficacy indicators of each group before and after the test are observed. Contrast statis-tical analysis.Results No residues of dihydromyricetin were detected in rat tissues ; There were no obvious adverse reactions in the clinic， and the safety indicators were normal. The effective rates of clinical symptoms and pharynx clearing signs in the test group were 62.05% and 57.63%， respectively， which were higher than the improvement rate in the control group， and the difference was statistically significant. Conclusion The compatibility of Ampelopsis grossedentata and Fructus arctiine has a good pharynx clearing effect， and the safety is high at this test dose.

Key words：Ampelopsis grossedentata ; Fructus arctiine ; HPLC ; Chronic pharyngitis

【中圖分類號】R4 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）09-056-02

顯齒蛇葡萄葉（Ampelopsis grossedentata），是葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄的莖葉，貴州等地多稱作藤茶或霉茶。2013年顯齒蛇葡萄葉被批準(zhǔn)為新食品原料，藤茶具有清熱降壓，平肝利濕，活血通絡(luò)的功效。藤茶中富含黃酮類化合物，其中二氫楊梅素（dihydromyricelin，DMY）高達(dá)18%以上，是其標(biāo)志性成分。有許多試驗研究發(fā)現(xiàn)藤茶和二氫楊梅素具有抗氧化、抗炎癥、解酒醒酒、保肝、抗病原體、抗微生物、抗腫瘤及調(diào)血脂等多方面的藥理作用[1-2]。蘇東林等[3]利用二氫楊梅素對大鼠灌胃14天，實驗毒性小，可耐受劑量為5 g/kg。鐘正賢等[4]證明大鼠長期進(jìn)食藤茶中總黃酮成分后未發(fā)現(xiàn)明顯毒性，推段臨床擬用劑量安全。歐賢紅等[5]給予家兔口服二氫楊梅素，結(jié)果表明二氫楊梅素進(jìn)入家兔體內(nèi)后表現(xiàn)出吸收迅速、分布范圍廣泛、代謝速度快、半衰期短的特征。牛蒡子，藥典載明其為菊科二年生草本植物牛蒡（Arctium lappa L.）的干燥成熟果實，藥物功效包括疏散風(fēng)熱、宣肺祛痰、利咽透疹和解毒消腫[6-7]。本項目組通過研究藤茶中二氫楊梅素藥代動力學(xué)分布特征及其與牛蒡子配伍的臨床觀察，充分研究該配伍的安全性及功效性。確保藤茶牛蒡子配伍用藥安全的前提下，對后續(xù)清咽功能的保健食品開發(fā)提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

藤茶（采購自貴州江口梵凈山云峰野生植物開發(fā)有限公司，批號20180620）;牛蒡子（采購自安國市深豪藥業(yè)有限公司，批號171101）;藤茶牛蒡子受試物（牛蒡子以生藥量計，服用量約4 g/d）;藤茶牛蒡子濃縮液（藤茶牛蒡子受試物與無菌水按比例提取、濃縮，即得）;二氫楊梅素對照品（18031501，成都曼斯特生物科技有限公司）;二氫槲皮素對照品（AF20041364，成都埃法生物科技有限公司）;甲醇、磷酸、乙酸乙酯、醋酸、醋酸鈉、生理鹽水等均購自北京化工廠。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫，型號：Agilent 1290，檢測器：DAD）;電子天平（QHAMS型）;微型渦旋混勻器（IKA VORTEX GENIUS 3）;低溫離心機(jī)（SIGMA3-16P）;手持微量電動組織勻漿器（LEOPARD S-18KS）;氮氣吹掃儀（QGC-12T）。

1.3 動物及飼料

SPF級SD雄性大鼠48只，10周齡，體重170g—200g，從北京華阜康生物科技股份有限公司采購（簡稱：華阜康），華阜康許可證號：SCXK（京）2019-0008。SD大鼠飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)的應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心動物室，實驗室級別為SPF級，動物室許可證號：SYXK（京）2017-0038。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，動物室的室溫控制在（25±2）℃，試驗期間大鼠均為自由攝食、飲水模式。維持飼料由華阜康生產(chǎn)提供。

1.4 研究對象篩選

由CDC倫理委員會批準(zhǔn)，自2021年初于天津市第三中心醫(yī)院隨機(jī)抽取慢性咽炎者105例，受試者納入與排除標(biāo)準(zhǔn)詳見2012年食藥監(jiān)局發(fā)布的“抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法印發(fā)[8]”中附件9“清咽功能評價方法”。本次試食試驗開始前召集所有受試者開展了座談會，同時簽署了試驗知情同意書。

2 方法

2.1 動物試食分組

大鼠隨機(jī)平分4組，分別設(shè)定空白對照組、低、中、高三個劑量組，即0.38 g/kg、0.75 g/kg、2.25 g/kg，灌胃給藥劑量均以生藥計。經(jīng)口給予大鼠受試物36 d，實驗結(jié)束當(dāng)天給受試物1 h后，將大鼠斷頸處死。將受試大鼠的心、肺、肝、脾、腎、心血組織樣品剝離留樣，獨立分裝稱重。按W ： V加入6倍量生理鹽水，冰上勻漿，4000 r/min離心15 min，取組織勻漿上清液200 ?L，置于10 mL的具塞離心管里，再加入甲醇50 ?L，然后加入10 ?L1內(nèi)標(biāo)溶液（101 ?L/mL），最后再加入400 ?L醋酸緩沖液（pH 4.5），渦旋1 min，然后加入4 mL乙酸乙酯。再次渦旋2 min，轉(zhuǎn)速4000 r/min，離心時間10 min，吸取上清液，于常溫下用氮氣吹干，取150 ?L流動相溶解殘留物，渦旋30 s，然后離心3 min，最后吸取適量上清液，用HPLC液相色譜法進(jìn)行檢測。

2.2 檢測方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（柱參數(shù)：250 mm × 4.6 mm ， 5 ?m）;流動相：甲醇 - 0.05 %磷酸水溶液（30 ： 70）;流動相流速：1 ml/min;檢測波長291 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 ?l;運行時間20 min;理論塔板數(shù)按二氫楊梅素計算不低于3 000[7]。二氫楊梅素保留時間為6.68 min，二氫槲皮素保留時間為13.75 min，如圖1所示獲得樣品色譜圖。

2.2.2 方法學(xué)考察

樣品同日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，連續(xù)進(jìn)樣3天，考察該方法儀器的精密度。樣品常溫放置4 h、反復(fù)凍融3次以及冰箱4 ℃放置12 h，考察該樣品的穩(wěn)定性。冷凍（-20 ℃）保存15 d，考察該樣品的長期穩(wěn)定性。參照“2.1”樣品處理方法，考察該處理方法的加樣回收率。

結(jié)果顯示，二氫楊梅素在0.019 9～0.318 mg / ml范圍內(nèi)線性良好，定量下限為0.019 9mg/ml，日內(nèi)、日間精密度RSD絕對值均小于8.4 %;樣品穩(wěn)定性RSD絕對值均小于11.5 %;加樣回收率均大于85%，RSD絕對值均小于9.3 %，符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則。圖2為專屬性考察中空白組織與加入對照品二氫楊梅素及外標(biāo)品二氫槲皮素的專屬性指紋圖譜。

2.3 人體試食分組

藤茶牛蒡子受試物由某研究所提供，以袋泡茶為劑型，連續(xù)飲用30天，每日3次，每次1袋，沸水沖泡后飲用，對照組采用空白對照。試驗期間受試者保持原有的飲食習(xí)慣，用組間對照和自身對照兩種試驗設(shè)計。受試者按咽部癥狀體征隨機(jī)分為試食組和對照組，分組時考慮病程、年齡和性別等因素，進(jìn)行均衡性比較。

2.4 安全性與功效性觀察指標(biāo)[8-9]

記錄受試者試食前后的精神、睡眠、飲食、大小便等項目，進(jìn)行血、尿、便常規(guī)及血生化指標(biāo)檢查。試食前進(jìn)行胸透、心電圖和腹部B超檢查，試驗開始及結(jié)束時觀察癥狀體征。

按咽部癥狀的輕重計算積分（1度1分、2度2分、3度3分），檢查咽部粘膜充血、咽后壁濾泡增生、粘膜水腫等體征，按輕、中、重分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級。記錄試食前后癥狀、體征積分和改善情況。癥狀減輕1度、咽部體征檢查結(jié)果減輕Ⅰ級為有效，癥狀、體征均無顯著性改善為無效。

2.5 質(zhì)量控制[9]

試食過程中調(diào)查記錄員和操作員均都經(jīng)過了規(guī)范化培訓(xùn)，全都考核合格?，F(xiàn)場調(diào)查及試食均由他們?nèi)踢M(jìn)行監(jiān)督，及時進(jìn)行查漏補(bǔ)缺，嚴(yán)格按照操作規(guī)程開展試驗，按要求進(jìn)行樣本的采集、儲運和檢測。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，采用t檢驗;計數(shù)數(shù)據(jù)以率（%）表示，采用X2檢驗，P < 0.05為顯著性差異，P < 0.01為極顯著性差異，均證明該數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 樣品檢測

大鼠經(jīng)灌胃給予不同劑量的受試物1 h后，其心、肺、肝、脾、腎、心血組織樣品均未檢出二氫楊梅素，表明該指標(biāo)成分在大鼠體內(nèi)迅速得實現(xiàn)消解，即在體內(nèi)不容易產(chǎn)生蓄積，胃腸道吸收快，也就是說藥效能夠快速實現(xiàn)。由此推斷二氫楊梅素的血藥濃度達(dá)峰迅速，半衰期不超過0.5 h。

3.2人體試食實驗

清咽功能人體試食實驗原理是試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，咽部臨床癥狀、體征積分明顯降低，且癥狀、體征改善率較對照組有明顯增加，差異有顯著性，可判定該受試樣品具有清咽功能。

3.2.1一般情況

初始試驗時113例符合要求的受試者（對照組56例，試食組57例），試食組和對照組各有4例未在規(guī)定時間復(fù)查，按標(biāo)準(zhǔn)排除，試食有效病例105例（對照組52例、試食組53例），各失訪4例，試驗脫離率分別為7.1%，7.0%。試食期間對照組58.44±6.76歲（男12人、女40人;病程2.38±0.95年）;試食組57.55±7.89歲（男9人、女44人;病程2.13±0.86年），兩組差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2.2安全性觀察

飲用30天后，兩組人員的精神、睡眠、飲食、大小便、體重、血壓和心率未見明顯異常;血、尿、便常規(guī)等血生化指標(biāo)結(jié)果均正常，未見過敏及其他不良反應(yīng)（惡心、脹氣、腹瀉、腹痛等）。

試食前后上述各項指標(biāo)均基本在正常范圍。

3.2.3臨床癥狀、體征改善有效率

試食后試食組咽痛、咽癢、咽干、干咳、咽異物感和多言加重等咽部癥狀減輕有效率均高于對照組;試食組總有效率（62.05%）高于對照組（9.63%），見表1。

試食后試食組黏膜充血、水腫、咽喉壁淋巴濾泡增生和分泌物附著等體征檢查結(jié)果減輕有效率均高于對照組;試食組總有效率（57.63%）高于對照組（10.53%），見表2。

3.2.4 臨床癥狀、體征積分值比較

試食組試食后的癥狀與體征積分均有一定程度的降低，與試食前自身、試食后對照組比較，差異都有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001），數(shù)據(jù)詳見表3。

4 討論

慢性咽炎以臟腑虧損、虛火上炎多見，如《醫(yī)學(xué)綱目》卷十五曰：“喉瘡多虛火，游行不利客于咽喉”。吸煙、飲酒等不良習(xí)慣，可大大加重群眾患慢性咽炎的概率，具有清咽功能保健食品的開發(fā)迫在眉睫[10]。本著未病先治的中醫(yī)理論，本文利用藤茶與傳統(tǒng)中藥牛蒡子配伍治療慢性咽炎，探究其安全性與功效性。參照國家食品藥品監(jiān)督管理總局2012年保健食品評價方法中心附件9清咽功能的評價方法，采用自身和組間對照兩種實驗，驗證該配伍劑量下的藤茶牛蒡子受試物對人體健康無明顯不良影響。指標(biāo)性成分二氫楊梅素動物體內(nèi)半衰期較短，消除快且不易蓄積，兩者配伍在該劑量下安全性高。

在配伍安全的前提下進(jìn)行功效驗證可知，受試人體病情癥狀及體征改善明顯，有效率遠(yuǎn)高于對照組。另外，茶飲的方式更有利于藥物作用于局部，加速咽部炎癥好轉(zhuǎn)，從而起到局部與全身治療的雙重作用，進(jìn)一步提高療效[11]。且茶飲簡便易行，患者依從性好，適宜居家緩解咽部不適。

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