楊三東, 李乃杰, 馬 周, 唐 濤, 李 彤,3*

(1.中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所, 江蘇 蘇州 215163; 2.大連依利特分析儀器有限公司, 遼寧 大連 116023; 3.依利特(蘇州)分析儀器有限公司, 江蘇 蘇州 215123)

液相色譜技術經(jīng)過一個多世紀的發(fā)展,已成為應用最廣泛的分離分析技術之一。液相色譜原理、分離技術、液相色譜儀器的不斷創(chuàng)新,擴展了液相色譜的應用范圍,為分析化學家?guī)砀痈咝У姆蛛x工具。在液相色譜的眾多發(fā)展方向中,降低色譜柱的內(nèi)徑所帶來的優(yōu)勢使其得到了長期的關注與研究[1-6]。色譜柱內(nèi)徑的降低可減少樣品和流動相的消耗,不僅特別適合樣品量受限時的分離分析,而且符合綠色化學的發(fā)展理念。當色譜柱單位截面積的進樣濃度大于常規(guī)色譜柱時,樣品的稀釋效應會小于常規(guī)色譜柱,展現(xiàn)出更高的檢測靈敏度[7]。色譜柱內(nèi)徑的降低也會使色譜柱的溫度控制更加容易,降低高壓分離帶來的溫度效應[8]。此外,由于分離流速的降低,更易于與質(zhì)譜儀聯(lián)用。然而,柱外效應是限制這一發(fā)展方向的主要問題,且色譜柱內(nèi)徑越小,柱外效應的影響越顯著[9]。

納升液相色譜是伴隨著色譜柱內(nèi)徑的不斷降低而出現(xiàn)的技術?！凹{升”往往指的是流速范圍每分鐘幾十至上百納升,樣品量幾納升至上百納升,有時也包括檢測池體積幾納升至幾十納升,其使用的色譜柱內(nèi)徑一般介于10～100 μm之間[10]。目前,納升液相色譜已成為蛋白質(zhì)組學[11]、代謝組學[12]、脂質(zhì)組學[13]等領域的重要研究工具,并且在食品分析[14]、藥物分析[15]、環(huán)境污染物分析[16]等常規(guī)分析領域有所應用。

相較于使用常規(guī)流速與常規(guī)尺寸色譜柱的液相色譜技術,納升液相色譜技術發(fā)展緩慢,主要是受限于穩(wěn)定可靠的儀器系統(tǒng)的研發(fā)[17]。在納升液相色譜系統(tǒng)中,溶劑輸送裝置需要產(chǎn)生準確、穩(wěn)定的納升級流速,并且能夠?qū)崿F(xiàn)納升級的梯度輸液;進樣裝置需要能夠在不產(chǎn)生明顯柱外效應的情況下實現(xiàn)準確重復進樣;檢測裝置需要在納升級流速下不產(chǎn)生明顯的柱外效應,且具有較高的靈敏度;管路及連接也需要進行優(yōu)化以最大限度地減小色譜峰展寬,適配納升級的分析流速。對這些模塊的研究和改進是提高納升液相色譜系統(tǒng)的性能,使其能夠在更多應用領域發(fā)揮作用與優(yōu)勢的關鍵。

目前,納升液相色譜系統(tǒng)多與質(zhì)譜儀串聯(lián)使用,應用紫外檢測器或熒光檢測器的相對較少。一些商品化儀器甚至僅將輸液泵和自動進樣器進行集成,不配置檢測器。因此,本文主要從輸液裝置、進樣裝置、管路及連接3個方面綜述構成納升液相色譜儀器主要模塊的研究進展,對檢測裝置僅作簡要介紹,并對部分商品化的納升液相色譜系統(tǒng)的技術路線及性能參數(shù)進行了對比。

1 溶劑輸送裝置

1.1 氣動放大泵

氣動放大泵是最早應用于納升液相色譜中的輸液系統(tǒng)。在MacNair等[18,19]對超高效分離填料的研究中,分別用直徑1.5 μm、1.0 μm的顆粒裝填到30 μm內(nèi)徑的不同長度毛細管中,由于反壓可達100 MPa左右,故使用多級的氣動放大裝置,以恒壓模式進行毛細管色譜柱的裝填與評價。雖然這種輸液裝置能夠產(chǎn)生非常大的輸液壓力,并可利用穩(wěn)定氣源實現(xiàn)穩(wěn)定地輸液,但氣動放大泵在往復運動或補充流動相時會產(chǎn)生較大的脈動,且難以通過直接控制輸出流速實現(xiàn)梯度輸液,限制了其進一步的實際應用。目前,這種模式的輸液裝置一般在需要極高壓力下裝填納升色譜柱時才會有所應用[20]。

1.2 分流輸液裝置

分流是實驗室研究中最常使用的一種納升流速輸液技術[21],也是部分商品化儀器所采用的技術。分流的原理是利用三通裝置將常規(guī)輸液泵的輸出流速進行分流,分流比為兩條流路阻力比的倒數(shù)。其優(yōu)勢在于結構比較簡單,易于實現(xiàn),利用細內(nèi)徑毛細管調(diào)整分離流路和廢液流路的阻力比,即可將毫升或微升級流速分流為納升級流速。對于等度的分離條件來說,盡管分流比很大,但可以將廢液流路中的流體回流至溶劑瓶中,節(jié)省流動相消耗。然而在梯度分離模式下,由于梯度的混合過程在分流三通之前,無法將廢液流路的流動相回收利用,因而流動相浪費較多。盡管分流技術能夠簡單快速地實現(xiàn)納升級流速的輸出,但由于不同的色譜柱具有不同的反壓,因而無法在更換色譜柱或色譜柱狀態(tài)變化后維持恒定的分流比,分流重復性難以保證。此外,在梯度運行過程中,由于兩條流路總體積的不同,二者的流路阻力會隨流動相比例的變化而發(fā)生非同步變化,從而使分流比和分流流速無法保持恒定。

主動分流調(diào)節(jié)技術能夠緩解系統(tǒng)分流比的改變,如圖1所示。圖1a[22]和圖1b[23]中的分流裝置由固定分流比和可調(diào)分流比兩部分組成,且分別使用壓力傳感器和流量傳感器來反饋調(diào)控可調(diào)流路的阻尼。當系統(tǒng)阻力出現(xiàn)變化,使總分流比發(fā)生改變時,通過調(diào)整可調(diào)分流比部分的阻尼,維持總分流比的恒定。圖1c[24]則是通過電磁比例閥(electro-magnetic proportional valve, EMPV)直接調(diào)整分流比,并利用在線流量計的反饋信號控制分流輸出流速。上述技術的應用盡管緩解了分流過程中壓力變化的影響,但未能解決梯度輸液過程中的流動相浪費問題。

圖1 主動分流調(diào)節(jié)技術示意圖

1.3 不分流輸液裝置

不分流的納升流速輸液裝置由于能夠極大地節(jié)省流動相,且流速穩(wěn)定性較高,是納升流速輸液裝置研制與應用的主流。目前主要有兩種基本結構,一種是基于雙柱塞交替輸液的連續(xù)輸液泵結構[25,26],一種是基于高精度電機驅(qū)動的注射泵結構[27],如圖2所示。

圖2 不分流納升輸液裝置示意圖

連續(xù)輸液泵的工作原理與常規(guī)HPLC或UHPLC的輸液泵相近,每種流動相由高精度電機驅(qū)動兩個柱塞交替輸送,根據(jù)流路連接以及柱塞的交替方式,又可分為串聯(lián)與并聯(lián)結構。與常規(guī)輸液泵不同的是,由于納升流速的輸出容易受到影響,因此在每種流動相的出口處需設置在線流量傳感器,根據(jù)實時測量的流速值反饋調(diào)控電機的轉(zhuǎn)速,提高納升流速的準確性和穩(wěn)定性。

注射泵的工作原理是每種流動相僅由單一柱塞輸送,當泵腔內(nèi)溶劑輸送完全后,此次輸液過程結束,開始吸液過程并準備下一次輸液。這種注射泵的泵頭由于只有一個出口,一般利用高壓切換閥來選擇泵頭出口與溶劑瓶還是與系統(tǒng)相通。同時,也同樣需要在每種流動相的出口處設置在線流量傳感器,反饋調(diào)控納升級的輸出流速。這種結構的最大問題是穩(wěn)定輸液時長受到泵腔容積的限制,無法實現(xiàn)長時間連續(xù)輸液。但由于納升液相色譜常用的流速為每分鐘幾百納升,且分析時間多在1～2 h以內(nèi),因此增大泵腔的容積則能夠滿足大多數(shù)的色譜分離需求。Sharma等[28]構建了一種便攜式納升梯度液相色譜系統(tǒng),泵頭總?cè)莘e為74 μL,若輸液泵以800 nL/min的流速運行,理論最長運行時間可超過90 min。

目前商品化的納升液相色譜系統(tǒng)多數(shù)采用不分流的納升流速輸液裝置,兩種結構的優(yōu)缺點見表1。盡管商品化納升液相色譜輸液泵均利用在線流量傳感器反饋調(diào)節(jié)電機轉(zhuǎn)速,從而提高流速的準確性,但使用時需要注意的是,在線流量傳感器只能保證校準流動相的流速準確性。若更換流動相,則需要以更換后的流動相對在線流量傳感器進行重新校準。

表1 兩種不分流納升輸液裝置的優(yōu)缺點

在“十二五”國家重大科學儀器設備開發(fā)專項的支持下,本團隊承擔了“多微生物色譜儀及液質(zhì)聯(lián)用關鍵部件的研制”項目的子任務“超高壓微納液相色譜系統(tǒng)的研制”。本團隊[29]在此項目的研究工作中,研制了一種注射式納升梯度輸液泵,泵腔總?cè)莘e可達180 μL。該納升輸液泵利用2個高精度直驅(qū)電機作為動力源,同時使用剛性的柱塞連接裝置,確保電機的運動精度可直接傳遞至輸液柱塞。在其流路結構設計上取消了傳統(tǒng)的單向閥模塊,采用耐超高壓的二位十通閥作為輸液吸液狀態(tài)轉(zhuǎn)換的接口,解決了納升級的流體微滲問題,使輸液泵耐壓超過100 MPa。流速與梯度輸液測試結果表明,在500 nL/min條件下的流速準確性、穩(wěn)定性以及梯度偏差均低于1%。以BSA酶解液及Hela細胞蛋白質(zhì)酶解液進行評價,評價結果與進口儀器相當,可應用于蛋白質(zhì)組學的分析研究中。

1.4 基于其他物理現(xiàn)象的輸液裝置

由于納升流速比較微小,一些能夠產(chǎn)生輕微形變或位移的物理現(xiàn)象,也可以用于驅(qū)動液體流動,實現(xiàn)無分流的納升流速輸液。

電滲泵是研究較多的一種微流量泵,其原理是利用載流的電滲現(xiàn)象驅(qū)動流動相運動[30],載流微通道可為空管[31]、填充柱[32]、整體柱[33]、多孔膜[34]等形式,如圖3所示。通過控制驅(qū)動電壓的極性,控制載液的流動方向,配合閥結構實現(xiàn)輸液和吸液。Zhou等[35]利用整體柱作為載流微通道,構建了一種二元梯度電滲泵,最大輸出流速為490 nL/min。盡管電滲泵能夠?qū)崿F(xiàn)納升流速的輸送,裝置成本較低,但由于最大輸液壓力一般不超過40 MPa,且輸液的流速與色譜柱背壓有關,是一種恒壓泵,因此應用受到一定限制。

圖3 電滲泵結構示意圖

磁致伸縮泵[36]是通過外加磁場改變磁致伸縮體的形狀,驅(qū)動柱塞或隔膜的前后運動,再配合閥結構,實現(xiàn)輸液和吸液。磁致伸縮體的形變量較小,通過設計隔膜或柱塞與磁致伸縮體的直徑比,調(diào)節(jié)輸出的流速范圍。磁致伸縮泵的優(yōu)點是機械結構簡單,流速下限低。但目前尚無用該泵進行梯度輸液的研究,且磁致伸縮體的形變控制比較復雜,離實際應用還有一段距離。

熱膨脹泵[37]是一種基于液體受熱膨脹的物理現(xiàn)象驅(qū)動流動相流動的輸液泵,由于液體受熱膨脹量較小,因而能夠輸出納升級的流速。張祥民等[38]研制了一種可實現(xiàn)梯度輸液的熱膨脹泵,在500 nL/min的流速條件下,流速重復性的RSD為4%,色譜分離保留時間的重復性RSD為2%。

本團隊[39]基于物質(zhì)發(fā)生固液相變時能夠產(chǎn)生體積變化,研制了一種相變泵。若物質(zhì)發(fā)生固液相變時體積增大,則可通過對固態(tài)物質(zhì)加熱使其發(fā)生相變,利用體積膨脹的作用,驅(qū)動流動相。實驗測試這種相變泵的最低輸出流速可低至100 nL/min,輸液壓力可達80 MPa。但由于均勻、精確且迅速的控溫過程難以實現(xiàn),流速的穩(wěn)定性并不理想。

基于不同原理實現(xiàn)納升流速的輸液裝置匯總見表2。

表2 納升流速輸液裝置匯總

2 進樣裝置

樣品的進樣過程不僅影響定量結果的重現(xiàn)性和準確性,同時也會因為柱外效應,對色譜分離效果產(chǎn)生影響[40-42]。特別是對于納升液相色譜,隨著色譜柱尺寸的明顯減小,進樣量也需要隨之大幅降低,以避免發(fā)生質(zhì)量超載或體積超載[43]。根據(jù)估算[10],納升色譜柱的進樣體積一般在幾納升至幾百納升之間。因此,適合納升液相色譜系統(tǒng)的進樣方式主要有納升體積進樣和捕集進樣兩種模式。

2.1 納升體積進樣

常規(guī)HPLC的進樣體積一般為幾微升至幾百微升,通過切換閥上的外置定量環(huán)即可完成進樣過程,且不會對色譜分離造成明顯影響。但對于納升液相色譜系統(tǒng)來說,常規(guī)外置定量環(huán)的體積過大,若使用細內(nèi)徑的管路制作納升體積的定量環(huán),則定量環(huán)的反壓過大,難以使樣品順利進入。因此外置定量環(huán)的進樣模式不適合納升液相色譜。

在20世紀末,由于機械加工水平的限制,出現(xiàn)了一些納升體積的進樣方式,如中心切割[44]、分流進樣[45]、柱上聚焦[46]等。隨著機械加工精度的提升,目前已經(jīng)可以加工出內(nèi)置納升體積定量環(huán)的進樣閥。如VICI公司的C4N-4004系列商品化進樣閥可實現(xiàn)4、10、20 nL 3種納升體積進樣,測試表明使用4 nL進樣閥的樣品峰面積相對標準偏差優(yōu)于1%[47]。Sharma等[48]研制了一種便攜式納升液相色譜系統(tǒng),通過對切換閥內(nèi)的轉(zhuǎn)子進行設計和精密加工,使切換閥不僅具有60 nL體積的進樣功能,同時還具有納升注射泵流動相輸出與吸入的切換功能,極大地縮小了系統(tǒng)尺寸,如圖4所示。內(nèi)置定量環(huán)式進樣閥的主要問題是定量環(huán)體積固定,若需進樣其他體積,一般需要更換轉(zhuǎn)子,甚至更換整個進樣閥,使用不方便。Gerhardt等[49]發(fā)明了一種具有可變體積內(nèi)置定量環(huán)的進樣閥,該進樣閥轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動角度連續(xù)可變,通過在轉(zhuǎn)子上加工較長的樣品和流動相通道,使轉(zhuǎn)子上的內(nèi)置定量環(huán)區(qū)域大小可調(diào),從而控制內(nèi)置定量環(huán)的進樣量,如圖5所示。

圖4 集成式進樣閥裝置示意圖

圖5 可變體積進樣閥示意圖

定時進樣模式也可以用于實現(xiàn)納升體積進樣,當進樣閥上的定量環(huán)中引入樣品后,通過控制進樣閥處于“injection”位置的時間來控制進樣體積,進樣體積為該時間與流速的乘積。這種進樣模式的樣品擴散較低,可降低色譜峰拖尾。Prü?等[50]對比了該進樣模式與部分定量環(huán)進樣模式下樣品分離時的色譜峰展寬,在譜帶展寬方面,定時進樣模式的結果更好。

2.2 捕集進樣

雖然通過理論計算,適合納升液相色譜的進樣體積應該在納升級,但直接納升體積進樣方式不僅可能受到進樣裝置的限制,對樣品的濃度也有一定的要求。在生化分析領域,樣品的濃度往往很低,納升體積進樣并不適用。捕集進樣方式能夠以微升級體積進樣,并在捕集柱上對樣品進行濃縮,也可以在捕集柱上實現(xiàn)除鹽、調(diào)整pH等操作,是納升液相色譜應用最多的一種進樣方式[51]。其原理是利用低洗脫能力的流動相將較大體積的樣品在捕集柱的柱頭上進行樣品的富集,之后通過閥切換,以較高洗脫能力的流動相將樣品洗脫至分析柱上進行后續(xù)分離。由于捕集柱的富集濃縮作用,樣品譜帶展寬較小。Leonhardt等[52]研究發(fā)現(xiàn),使用較短的捕集柱、較高的捕集流速更有利于大體積樣品的在線濃縮。

捕集進樣主要有兩種流路連接方式,如圖6所示。一種是樣品通過進樣閥進樣后,由納升分離泵驅(qū)動樣品捕集,捕集柱后連接排空切換閥。捕集時,排空閥打開,捕集后的流動相從排空閥排出;分析時,排空閥關閉,捕集柱與分析柱相連,進行樣品的洗脫[53]。另一種是樣品通過進樣閥進樣后,由上樣泵驅(qū)動樣品捕集,捕集后進行閥切換,使捕集柱與納升分離泵、分析柱相連,進行樣品的洗脫[54]。兩種流路結構相比,前者可節(jié)省一個上樣泵和一個六通切換閥,但捕集過程與分離過程的系統(tǒng)壓力變化較大,對系統(tǒng)的快速升壓提出更高的要求;后者的系統(tǒng)壓力穩(wěn)定性更好,但裝置成本較高。在使用捕集進樣方式時,也需要注意低保留組分在捕集柱上的損失問題,以及引入捕集柱所引起的梯度延遲問題。

圖6 捕集進樣方式的示意圖

除了上述利用低洗脫能力的流動相對樣品進行捕集進樣的方法以外,也可以利用溫度的控制實現(xiàn)大體積樣品的捕集進樣。由于納升色譜柱的直徑很小,可以實現(xiàn)快速的溫度變化[55],從而實現(xiàn)溫度輔助柱上樣品聚焦(temperature-assisted on-column solute focusing, TASF)[56]。樣品進樣后,對色譜柱前端的7 mm長度進行制冷,使其溫度在30～45 s內(nèi)降低至5 ℃,實現(xiàn)樣品的捕集。之后再對這段色譜柱進行快速升溫至60 ℃,釋放捕集的樣品進行后續(xù)分離分析。通過這種方式,能夠顯著降低色譜峰的展寬。將TASF進樣方式與基于低洗脫能力流動相的捕集進樣方式結合,可以進一步提高捕集效果,增大進樣體積[57]。

表3對比了上述幾種納升LC的進樣方式。

表3 納升液相色譜進樣方式對比

3 管路及連接

管路與連接方式是產(chǎn)生柱外效應的重要部分[64-66],不適合的管路與不正確的連接方式會顯著影響納升液相色譜的分離結果,這也是很多納升液相色譜系統(tǒng)得不到理想實驗結果的主要原因。

系統(tǒng)內(nèi)接觸流體的管路材質(zhì)常用不銹鋼、PEEK(聚醚醚酮,poly-ether-ether-ketone)、石英毛細管、鈦合金、MP35N(一種鎳鉻鈷合金)等。不銹鋼管路機械強度高,多用于納升輸液泵內(nèi)部各組件間的連接,內(nèi)徑尺寸多為0.127 mm(0.005英寸)或0.178 mm(0.007英寸),但由于其對生物樣品的兼容性不好,進樣后的各連接管路幾乎不使用不銹鋼材質(zhì)。此外,由于不銹鋼還可能釋放金屬離子進入流動相中,影響色譜柱或樣品,在一些輸液泵的設計中也使用其他材質(zhì)替代不銹鋼管路。在連接納升液相色譜系統(tǒng)間各個模塊時,PEEK與石英毛細管是最常用的兩種管路材料,其生物兼容性較好,且較不銹鋼管路更易彎曲,方便使用。PEEK管路外徑一般為0.794 mm(1/32英寸),內(nèi)徑一般不超過0.127 mm(0.005英寸),但PEEK材質(zhì)不耐受四氫呋喃、二氯甲烷、二甲亞砜等有機試劑。石英毛細管外徑一般為360 μm,內(nèi)徑一般在20～100 μm之間,但石英毛細管易碎,增加了系統(tǒng)的不穩(wěn)定性。一種解決方案(PEEKsil)是將PEEK材質(zhì)包裹在石英毛細管外,使其兼具了二者的優(yōu)點。因為常規(guī)的切割PEEK或石英毛細管的方式會使其受損,一般只使用預切長度。盡管連接管路的內(nèi)徑越小,柱外效應越小,且一些廠家有更細內(nèi)徑的石英毛細管產(chǎn)品,如10 μm或小于1 μm[67],但連接管路的阻力會隨著內(nèi)徑的降低而顯著升高,甚至超過整個系統(tǒng)的耐壓[42],因此對于每分鐘幾百納升的流速條件,20 μm通常是納升液相色譜連接管路內(nèi)徑的下限。

納升液相色譜的連接接頭主要有兩種形式,一種是刃環(huán)密封的連接方式,一種是端面密封的連接方式。刃環(huán)密封的連接方式是從常規(guī)HPLC系統(tǒng)延續(xù)而來的,通過刃環(huán)外表面與錐孔內(nèi)表面、刃環(huán)內(nèi)表面與管外壁的兩級密封方式,實現(xiàn)流路的連接。由于目前納升液相色譜系統(tǒng)的連接孔多為適配外徑1.588 mm(1/16英寸)的管路、10-32螺紋的螺絲,若使用外徑0.794 mm(1/32英寸)PEEK管或外徑360 μm的石英毛細管,則需要使用套管結構來輔助連接,如圖7a所示。刃環(huán)密封的連接方式最主要的問題是容易產(chǎn)生死體積[68]。理想的連接方式是刃環(huán)與管路前端的距離剛好適合連接孔且管路前端與連接孔底端緊密相連。但實際連接時,管路前端與連接孔底端的緊密程度靠螺絲旋進的深度調(diào)整,深度過小,端面密封不好,深度過大,容易使刃環(huán)對管路造成擠壓或損壞,不易控制,對操作者的經(jīng)驗要求較高。端面密封的連接方式是通過特殊設計的管路前端及接頭結構,使得螺絲在旋入連接孔時,直接將管路前端擠壓在連接孔的底端,實現(xiàn)端面密封。密封的程度可以通過旋轉(zhuǎn)螺絲的扭矩進行控制,不會對管路造成損傷,如圖7b所示。目前Thermo Fisher Scientific公司的Viper系列[69,70]和IDEX公司的MarvelX系列[71]均采用這種設計。Stankovich等[65]測試發(fā)現(xiàn),這種連接方式可以顯著降低色譜峰展寬。由于這種連接結構需要具有特殊設計的管路前端,因此均為預切長度或定制長度的管路,無法根據(jù)實際需求隨時調(diào)整。

圖7 連接方式

4 檢測裝置

納升液相色譜系統(tǒng)可使用的檢測器類型主要有光學吸收型檢測器[72]、熒光檢測器[73]、質(zhì)譜檢測器[74]等。其中,質(zhì)譜檢測器應用最廣泛,但與光學吸收型檢測器相比,有關質(zhì)譜檢測器對柱外效應貢獻的研究相對較少[75,76],色譜柱出口與質(zhì)譜檢測器入口之間的連接管路是其柱外效應的重要組成部分[77]。對于使用電噴霧離子源的質(zhì)譜檢測器(electrospray ionization-mass spectrometer, ESI-MS),將毛細管柱末端制成尖銳的錐形,直接用于電噴霧離子源中,避免使用額外的連接管路,可以有效避免柱后展寬[78,79]。

光學吸收型檢測器是基于樣品流過流通池時吸收光強的多少進行定量,流通池的光程和池體積分別影響檢測的靈敏度和樣品在池內(nèi)的擴散[80]。由于同樣使用毛細管色譜柱,毛細管電泳系統(tǒng)、毛細管電色譜系統(tǒng)所使用的流通池設計思路也可用于納升液相色譜系統(tǒng)中[81]。與毛細管電泳系統(tǒng)、毛細管電色譜系統(tǒng)相似,對于納升液相色譜系統(tǒng)來說,柱外效應及樣品的擴散對于分析檢測結果的影響更大,因此通常采取減小光程,犧牲靈敏度的流通池設計策略。柱上檢測是這一類系統(tǒng)中最常用的流通池設計,通過去掉毛細管色譜柱末端的聚合物保護層,使光線直接穿過毛細管壁[82]或毛細管柱[83]進行檢測。這種檢測方式的靈敏度很低,流通池光程僅與毛細管內(nèi)徑相當。為了提高檢測靈敏度,可通過在毛細管中鼓泡[84,85]、毛細管徑向多重反射[86]、毛細管軸向Z型池[87,88]等方式,在不顯著增加流通池體積的前提下(<100 nL),增大光程。更小的池體積結構也往往意味著更低的通光量,會增加噪聲對檢測靈敏度的影響。對于基于軸向照射設計的流通池,為了提高光通量,可以使用Teflon AF作為池內(nèi)壁材料,利用其折射率低于液相色譜常用流動相的特性,實現(xiàn)液芯波導(liquid-core waveguide, LCW)全反射技術,可減小流通池內(nèi)的光能損失,降低噪聲水平,提高信噪比[89-92]。

5 商品化納升液相色譜系統(tǒng)

商品化納升液相色譜系統(tǒng)目前幾乎全部為國外公司的產(chǎn)品,各產(chǎn)品的主要差異在于輸液裝置的設計及指標參數(shù)上。

最早的商品化納升液相色譜是由荷蘭LC Packings公司(后被Dionex收購,目前屬于Thermo Fisher Scientific公司)在1998年推出的UltiMate NanoLC系統(tǒng)。該系統(tǒng)的輸液裝置基于分流的原理,利用預設分流比的流速選擇模塊進行流速范圍的配置(與圖1b原理相近)。根據(jù)所使用的流速選擇模塊的不同,流速范圍有50 nL/min～1 μL/min、500 nL/min～10 μL/min、10～160 μL/min 3種可選。該系列的最新產(chǎn)品UltiMate 3 000 RSLCnano使用雙柱塞串聯(lián)連續(xù)輸液模式(與圖2a原理相近),可實現(xiàn)無分流的納升輸液,流速范圍20 nL/min～50 μL/min,耐壓可達80 MPa。該輸液裝置內(nèi)同時集成了一個三元低壓梯度微升泵,可用于樣品的捕集過程以及二維色譜,擴展了應用范圍。EASY nLC系列納升液相色譜系統(tǒng)目前也是Thermo Fisher Scientific公司的產(chǎn)品(原屬于丹麥Proxeon公司),該系統(tǒng)將輸液泵和自動進樣器集成在一臺儀器內(nèi),極大地減小了儀器所占的空間。輸液裝置使用無分流的雙注射泵配置(與圖2b原理相近),單泵的泵腔容積為140 μL,其最新型號EASY nLC 1200的流速范圍是20～2 000 nL/min,耐壓可達120 MPa。該產(chǎn)品也多作為OEM(original equipment manufacturer)出現(xiàn)在其他公司的納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中,如Bruker和Varian。

Eksigent公司(現(xiàn)屬于AB Sciex公司)的納升液相色譜產(chǎn)品是NanoLC系列。該產(chǎn)品的輸液裝置同樣配置了無分流的雙注射泵,且使用一種微流體流速控制技術(microfluidic flow control, MFC)對輸出流速進行控制。最新的Ekspert nanoLC 400可通過更換流速模塊,實現(xiàn)3個流速范圍的選擇,整體流速范圍為100 nL/min～50 μL/min,耐壓69 MPa。

Waters公司的Acquity M-Class系統(tǒng)是由nanoAcquity系統(tǒng)升級而來的納升液相色譜系統(tǒng)。該系統(tǒng)的輸液裝置使用二元雙柱塞往復連續(xù)輸液泵,通過流量傳感器的閉環(huán)反饋控制,可實現(xiàn)200 nL/min～6 μL/min的輸出流速,開環(huán)控制模式最大可實現(xiàn)100 μL/min的流速。系統(tǒng)的最大耐壓超過100 MPa,可用于快速分析。Acquity M-Class系統(tǒng)中除了具有納升輸液裝置和定量環(huán)式的進樣裝置外,還具有可用于樣品捕集的輔助溶劑輸送裝置、捕集閥管理裝置,以及最大可容納7 296個樣品的樣品管理器。

Agilent公司的納升液相色譜系統(tǒng)始于1100系列,其輸液裝置由雙柱塞串聯(lián)泵系統(tǒng)構成,在流動相混合器之后依次連接電磁比例閥和流量傳感器(與圖1c原理相近),納升流速的控制由電子流速控制(electronic flow control, EFC)系統(tǒng)實現(xiàn)。由于該輸液裝置采用分流原理且分流發(fā)生在流動相混合之后,因此流動相的消耗量較大。該系列的升級產(chǎn)品,1200 Infinity系列的納升輸液裝置依然采用相似的工作原理,雖然流速下限從1100系列的1 μL/min降低至100 nL/min,但依然存在流動相消耗量較大的問題。該輸液裝置可以通過更換硬件,實現(xiàn)毫升工作模式的切換。

島津公司nano Prominence納升液相色譜系統(tǒng)的輸液裝置也是采用了分流的設計原理,但其分流過程發(fā)生在梯度混合之前,因而也可以節(jié)省流動相的消耗。通過回流流速控制(reflux flow control, RFC)系統(tǒng),利用納升流量傳感器監(jiān)控分流后每種流動相的輸出流速,反饋調(diào)控電機轉(zhuǎn)速,使兩種流動相以納升流速進行梯度混合。該輸液系統(tǒng)可以在40 MPa的范圍內(nèi)實現(xiàn)1 nL/min～5 μL/min的輸出流速。

表4對部分商品化納升液相色譜系統(tǒng)的指標進行了對比。

表4 部分商品化納升液相色譜系統(tǒng)的指標參數(shù)

6 結論

以更少的樣品消耗、更短的分析時間和更高的靈敏度,分析更加復雜的樣品,是環(huán)境、藥物、組學等研究領域分析工作者的不斷追求。納升液相色譜使用極細內(nèi)徑的色譜柱且易于與質(zhì)譜儀聯(lián)用,已得到越來越廣泛的應用。性能良好且穩(wěn)定重復的儀器系統(tǒng)是獲得可靠結果的基本要素之一。然而從納升液相色譜的出現(xiàn)發(fā)展至今,盡管有多種輸液方式、進樣方式、連接方式的出現(xiàn),納升液相色譜依然主要用于一些精密的研究應用中,無法與常規(guī)高效液相色譜的應用范圍相比。這主要是由于一些納升液相色譜儀器的設計以及使用方面的問題依然需要進一步提升或解決,如納升級別的液體微滲、流速穩(wěn)定性的保證及故障診斷、細內(nèi)徑管路或色譜柱的堵塞、系統(tǒng)柱外效應的控制、易用且可靠的管路連接方式等等。商品化的納升液相色譜儀器解決了部分上述問題并進行了一些結構優(yōu)化,但用戶需要面對其高昂的價格及維護成本。由于降低色譜柱內(nèi)徑是液相色譜發(fā)展的一個重要趨勢,因而更低流速的穩(wěn)定溶劑輸送技術、更低柱外效應的系統(tǒng)設計、更高穩(wěn)定性的儀器集成依然是納升液相色譜的主要研究方向。