孫文靜, 施振強(qiáng), 卿光焱

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2.江南大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 無錫 214122)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)是在腫瘤發(fā)展過程中,從腫瘤部位脫落并侵入外周血液中的腫瘤細(xì)胞,被認(rèn)為攜帶有關(guān)腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要信息,與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。它是腫瘤新轉(zhuǎn)移灶形成的前提,被認(rèn)為是腫瘤組織轉(zhuǎn)移的“種子”,可看作原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞之間的中間過渡態(tài)。CTCs從實(shí)體腫瘤病灶脫落后,借助血液循環(huán)系統(tǒng)逃逸并錨定,發(fā)展成為新的轉(zhuǎn)移灶,極大地增加了腫瘤患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道,90%的腫瘤患者因腫瘤轉(zhuǎn)移而死亡[2]。從患者血液中分離并分析CTCs,有助于監(jiān)測(cè)腫瘤變化程度,診斷治療效果和預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[3]。以CTCs為重要生物標(biāo)志物,設(shè)計(jì)和開發(fā)精準(zhǔn)性、特異性CTCs捕獲材料[4],以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),對(duì)腫瘤的早期診斷、術(shù)后評(píng)估等具有非常深遠(yuǎn)的臨床意義。目前,精準(zhǔn)CTCs捕獲材料的開發(fā)已然成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文對(duì)CTCs捕獲所面臨的挑戰(zhàn),以及CTCs捕獲材料在近1～2個(gè)月內(nèi)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)要評(píng)述。

1 CTCs捕獲材料的種類

現(xiàn)有的CTCs捕獲材料,根據(jù)其捕獲單元的種類不同,主要可分為基于天然抗體或人工抗體的捕獲材料兩大類。CTCs表面具有上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin, CK)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)和前列腺抗原(prostate specific antigen, PSA)等特異性抗原?；谔烊豢贵w的CTCs捕獲材料,是將上述特征標(biāo)志物的抗體修飾到材料表面,基于抗原-抗體的生物親和原理,實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的特異性捕獲。而基于人工抗體的CTCs捕獲材料,則是通過模擬抗原-抗體相互作用機(jī)理,將能與CTCs表面特征標(biāo)志物(如唾液酸等)高選擇性結(jié)合的各種多肽、適配體[5]、糖類或其他小分子修飾到材料表面,實(shí)現(xiàn)CTCs的選擇性捕獲。兩種材料均存在各自的優(yōu)勢(shì)和缺陷,基于天然抗體的捕獲材料在特異性方面優(yōu)勢(shì)顯著。但是,基于人工抗體的捕獲材料能夠針對(duì)目前CTCs捕獲面臨的諸多問題,更加靈活地進(jìn)行個(gè)性化、多元化功能設(shè)計(jì),并且在材料穩(wěn)定性、制備成本等方面也具有一定優(yōu)勢(shì)。

2 CTCs捕獲材料面臨的挑戰(zhàn)

CTCs因在血液中的低豐度、異質(zhì)性,以及捕獲過程造成的細(xì)胞損傷等原因,導(dǎo)致對(duì)CTCs的精準(zhǔn)捕獲極具挑戰(zhàn)[6]。如何通過材料設(shè)計(jì)有針對(duì)性地應(yīng)對(duì)上述挑戰(zhàn),是目前CTCs捕獲材料的研究重點(diǎn)。

2.1 低豐度

血液中含有大量的血細(xì)胞,如白細(xì)胞(109個(gè)/L)、紅細(xì)胞(1012個(gè)/L)、血小板(1012個(gè)/L)等。與這些正常血細(xì)胞相比,CTCs在血液中的含量非常低[7]。研究表明:每105～106個(gè)外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中僅有1個(gè)CTCs[8]。這對(duì)捕獲材料的靈敏度和特異性提出了非常高的要求。另一方面,血漿蛋白質(zhì)在材料表面的非選擇性吸附也會(huì)影響材料對(duì)CTCs的捕獲性能,這就要求CTCs捕獲材料必須具備足夠的抗污性能。此外,將來若要實(shí)現(xiàn)在血液循環(huán)系統(tǒng)中對(duì)CTCs的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),捕獲材料的生物相容性,尤其是血液相容性和細(xì)胞相容性,也是不可或缺的性能要素。

近日,柏林自由大學(xué)Rainer Haag課題組[9]設(shè)計(jì)了一種基于聚甘油和上皮細(xì)胞黏附分子抗體(anti-EpCAM)的納米結(jié)構(gòu)化涂層(見圖1)。該涂層表面修飾的anti-EpCAM抗體可與CTCs表面的EpCAM通過生物親和作用特異性結(jié)合,實(shí)現(xiàn)CTCs精準(zhǔn)捕獲;同時(shí),該涂層的納米結(jié)構(gòu)模擬細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)能增加CTCs在材料表面的黏附性,提升捕獲效率;更重要的是,涂層上的超支化聚甘油組分增強(qiáng)了材料的抗污染性能,可有效抑制白細(xì)胞在材料表面的非選擇性黏附,進(jìn)而提升CTCs的捕獲純度。

圖1 基于聚甘油和anti-EpCAM的納米結(jié)構(gòu)化多價(jià)生物涂層用于CTCs捕獲[9]

2.2 異質(zhì)性

腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性是指同類腫瘤的瘤間,以及同一腫瘤組織的瘤內(nèi),存在形態(tài)、功能差異的癌細(xì)胞亞群[10]。對(duì)CTCs而言[11],其異質(zhì)性主要體現(xiàn)在細(xì)胞表面特征標(biāo)志物種類及數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化,這將對(duì)材料的CTCs捕獲效率產(chǎn)生較大影響。

現(xiàn)有基于天然抗體的CTCs捕獲材料,主要以CTCs表面的EpCAM為靶標(biāo),用相應(yīng)的抗原實(shí)現(xiàn)CTCs捕獲。但是,腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT),會(huì)使CTCs丟失上皮抗原性,EpCAM表達(dá)顯著下調(diào)[12,13],從而導(dǎo)致以EpCAM為靶標(biāo)的CTCs捕獲效率大大降低,甚至造成假陰性的檢測(cè)結(jié)果。針對(duì)這一問題,中國(guó)科學(xué)院大學(xué)胡志遠(yuǎn)課題組[14]以CTCs表面的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白為靶標(biāo),從一珠一化合物(one-bead one-compound, OBOC)肽庫中篩選出一種能與N-鈣黏蛋白特異性結(jié)合的新型肽,并將其修飾到磁性納米粒子表面,用于間質(zhì)CTCs捕獲。此類材料是對(duì)anti-EpCAM抗體類捕獲材料的一個(gè)很好補(bǔ)充,有助于克服CTCs因EMT造成的異質(zhì)性。

另外,西南大學(xué)宋爾群課題組[15]創(chuàng)新性地利用梯度磁響應(yīng)性策略,實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同CTCs亞群的特異性捕獲與分離(見圖2)。他們構(gòu)筑了一系列不同抗體修飾的磁性納米粒子探針,通過“雞尾酒”式多抗體聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)表面攜帶不同抗原的多種CTCs亞群的同時(shí)捕獲。更有意思的是,通過梯度磁響應(yīng)分離,該納米探針可將捕獲的CTCs,從血液樣本中按時(shí)間順序依次分離。CTCs表面抗原的數(shù)量,將直接影響與磁性材料結(jié)合后CTCs的磁響應(yīng)性能,利用這一特點(diǎn),該材料能夠很好克服CTCs的異質(zhì)性,對(duì)表面具有不同表達(dá)水平的各種標(biāo)志物的CTCs亞群進(jìn)行特異性捕獲和梯度分離。

圖2 不同抗體修飾的仿生熒光磁性納米探針(BFMNPs-Ab)聯(lián)用實(shí)現(xiàn)對(duì)異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞亞群的捕獲與磁響應(yīng)性梯度分離[15]

人工抗體材料方面,中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)裴仁軍課題組[16]開發(fā)了一種單寧酸功能化的磁性納米材料,利用單寧酸的多酚單元與癌細(xì)胞表面糖萼的相互作用,該材料能夠?qū)eLa、PC-3、T24等7種癌細(xì)胞進(jìn)行廣譜性捕獲。當(dāng)與密度梯度離心聯(lián)用時(shí),該材料能從乳腺癌、腎癌、前列腺癌、肺癌等多種癌癥的臨床血液樣本中捕獲CTCs。

2.3 細(xì)胞損傷

普遍認(rèn)為,CTCs攜帶腫瘤部位病變細(xì)胞的重要信息。捕獲過程引起的細(xì)胞損傷會(huì)導(dǎo)致CTCs所攜帶的核酸、蛋白質(zhì)、多糖等關(guān)鍵信息流失,極大地阻礙了對(duì)CTCs的深度分析。此外,現(xiàn)有的CTCs釋放策略[17-19],如胰酶降解、競(jìng)爭(zhēng)解離等,往往會(huì)引起CTCs應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞信息丟失、活性降低,從而影響下游細(xì)胞培養(yǎng)和分子分析[20]。因此,如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的無損捕獲與釋放也是CTCs捕獲材料的一大難題。

如圖3a所示，廈門大學(xué)楊朝勇課題組[21]近日?qǐng)?bào)道了一種刺激響應(yīng)性配體修飾的微流控芯片(stiMulus-responsive ligand-decorated microfluidic chip, MRD-Chip),用于外周血中循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞的有效捕獲和無損釋放。他們通過二硫鍵將CD138抗體修飾到微流控芯片上,并通過芯片結(jié)構(gòu)優(yōu)化,增強(qiáng)了細(xì)胞與捕獲抗體之間的有效接觸,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTCs的高效捕獲。更重要的是,基于硫醇與二硫鍵交換反應(yīng),該材料可以實(shí)現(xiàn)對(duì)被捕獲CTCs的精準(zhǔn)、無損釋放。通過引入二硫蘇糖醇(DTT),與CD138抗體相連的二硫鍵會(huì)被還原而發(fā)生斷鍵,從而將CD138抗體以及與其特異性結(jié)合的CTCs從材料表面精準(zhǔn)釋放,并且被釋放的CTCs的細(xì)胞活性保持在90%以上。這一動(dòng)態(tài)二硫鍵的設(shè)計(jì),使材料能在有機(jī)小分子還原劑的刺激下,按需觸發(fā)CTCs的精準(zhǔn)、無損釋放,避免了胰酶等傳統(tǒng)解離試劑對(duì)細(xì)胞造成的損傷。

圖3 CTCs的刺激響應(yīng)性無損釋放

為了進(jìn)一步避免刺激響應(yīng)分子對(duì)樣品造成的二次污染,武漢大學(xué)謝敏課題組[22]設(shè)計(jì)了一種具有電響應(yīng)性CTCs釋放功能的捕獲材料(見圖3b)。他們利用金屬置換法在聚二甲基硅氧烷(PDMS)骨架上原位合成金納米棒(AuNTs),并通過Au-S鍵在AuNTs表面共價(jià)修飾anti-EpCAM抗體,基于抗體與CTCs表面抗原的生物親和作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的特異性捕獲。同時(shí),該材料能夠通過電化學(xué)刺激觸發(fā)Au-S鍵斷裂,將與anti-EpCAM抗體特異性結(jié)合的CTCs從材料表面釋放。這一巧妙設(shè)計(jì)不僅實(shí)現(xiàn)了CTCs的無損釋放,而且能在很大程度上提高收集到的CTCs純度。

基于人工抗體的捕獲材料在避免細(xì)胞損傷方面同樣做出了突出貢獻(xiàn)。湖南大學(xué)賀建軍課題組[23]基于脫氧核酶(DNAzyme)水凝膠的溶膠-凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化,實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTCs的選擇性捕獲、原位包封及溫和釋放(見圖3c)。他們利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)合成了兩條單鏈DNA(R1和R2), R1鏈包含DNAzyme序列和能特異性識(shí)別CTCs表面標(biāo)志物的適配體序列,R2鏈包含DNAzyme的互補(bǔ)序列。當(dāng)R1鏈與CTCs結(jié)合后,R2鏈的加入可以觸發(fā)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變,形成DNAzyme水凝膠,實(shí)現(xiàn)CTCs的原位捕獲與分離。此外,該DNAzyme水凝膠能在鋅離子(Zn2+)刺激下瓦解,將被捕獲的CTCs從凝膠中釋放。DNAzyme水凝膠的細(xì)胞相容性,以及溫和的釋放條件,使收集到的CTCs保持了較高的細(xì)胞活性。

3 總結(jié)與展望

作為腫瘤診療的有效途徑之一,CTCs捕獲材料的開發(fā)對(duì)腫瘤的早期診斷、術(shù)后評(píng)估等具有非常深遠(yuǎn)的臨床意義。針對(duì)目前CTCs捕獲所面臨的挑戰(zhàn),CTCs捕獲材料的重點(diǎn)發(fā)展方向主要有:1)提高材料對(duì)CTCs捕獲的選擇性、靈敏度和抗干擾性能;2)擴(kuò)大對(duì)不同CTCs亞群的覆蓋度;3)減小捕獲過程造成的細(xì)胞損傷。由此開發(fā)的CTCs精準(zhǔn)捕獲材料,將有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),使癌癥真正做到“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”。