時(shí)菲菲, 曹金花, 于生蘭, 楊海峰

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

黨參[Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.]，桔?？?Campanulaceae)黨參屬(Codonopsis)，一種被廣泛使用的藥食兩用植物，在動(dòng)物臨床中常用于體倦無力、少食氣虛等癥狀的治療。黨參含有多糖、生物堿、甾醇、皂苷等多種有效成分，多糖是黨參中含量最高的天然生物活性物質(zhì)[1-2]，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[3]、調(diào)節(jié)血液循環(huán)系統(tǒng)[4]、抗衰老[5]等作用。近年來，黨參多糖作為免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用研究成為熱點(diǎn)，對免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子[6]都有較好的調(diào)節(jié)作用，給藥方式以直接口服或制備成普通口服液為主，存在給藥后易被胃酸及胃腸道內(nèi)的酶降解，降低給藥后生物利用度的問題，限制了藥效的發(fā)揮。

納米乳是粒徑在1～200 nm范圍內(nèi)的乳劑型藥物載體，具有穩(wěn)定性好、緩釋、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)，主要有O/W型、W/O型、W/O/W型和O/W/O型[7-8]，在藥物制劑應(yīng)用中可根據(jù)生物活性物質(zhì)本身的物理化學(xué)特性和給藥特點(diǎn)選擇適合的類型。目前，對納米乳制劑的研究主要集中在W/O型和O/W型，而對W/O/W型和O/W/O型研究較少。W/O/W型和O/W/O型納米乳又稱復(fù)合型納米乳，在結(jié)構(gòu)上具有獨(dú)特的“兩膜三相”多室結(jié)構(gòu)[9]，不同的相可以溶解不同性質(zhì)的物質(zhì)，同時(shí)起到隔離保護(hù)、緩控釋、掩味的作用，因此，復(fù)合型納米乳是優(yōu)良的藥物載體。目前，復(fù)合型納米乳在獸藥方面已應(yīng)用到維生素[10]、抗菌藥物[11]、非水溶性驅(qū)蟲藥[12]等多種藥物，而作為免疫增強(qiáng)劑載藥系統(tǒng)的應(yīng)用鮮見報(bào)道，未見W/O/W型黨參多糖納米乳免疫增強(qiáng)劑的相關(guān)報(bào)道。本研究利用黨參多糖構(gòu)建W/O/W型黨參多糖納米乳免疫增強(qiáng)劑載藥體系，以期有效增強(qiáng)黨參多糖的免疫調(diào)節(jié)作用，為黨參的合理利用和黨參多糖免疫增強(qiáng)劑新劑型開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黨參藥材購于珠海藥材公司；肉豆蔻酸異丙酯(IPM)購自上海麥克林生化科技有限公司；吐溫-80、HEL-40、Span-80、丙三醇、PEG-400均購自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

試驗(yàn)儀器包括：渦旋機(jī)(VORTEX-5 ，海門市其林貝爾儀器有限公司)、探頭超聲儀(03040518系列，江蘇偉禾生物科技有限公司)、激光粒度分析儀(Zetasizer Nano ZS，英國Malvern instrument公司)、透射電子顯微鏡(HT7700，日本Hitachi公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1黨參多糖的提取、純化和含量測定 黨參根切片，于40 ℃烘箱中烘干。稱取干燥的黨參片150 g，于300 mL蒸餾水中浸泡12 h，在90 ℃條件下浸提黨參多糖2.5 h，浸提結(jié)束后過濾，濾液于3 000 r·min-1離心10 min。取上清液并加入3倍體積的95%乙醇，混勻并靜置12 h后3 000 r·min-1離心15 min，收集沉淀并用蒸餾水復(fù)溶，用sevage試劑沉淀蛋白質(zhì)，上清液離心后濃縮并冷凍干燥得到黨參多糖。參照葉英等[13]的方法測定黨參多糖含量。

1.2.2W/O型初乳處方篩選 以IPM為油相，吐溫-80和HEL-40分別為乳化劑和助乳化劑，分別以體積比9∶1、8∶2、7∶3和6∶4混合乳化劑和助乳化劑形成混合物(Smix)，Smix再分別與油相以體積比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6;4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9和0∶10混合均勻后，在25 ℃水浴中，探頭超聲作用下緩慢滴加蒸餾水，至形成透明、均一的W/O初乳，并利用各組分用量以水相、油相和Smix為頂點(diǎn)構(gòu)建偽三元相圖，分析確定合適的油相、乳化劑、助乳化劑和水相用量，從而確定處方組成。

1.2.3W/O/W型納米乳處方篩選 以W/O型黨參多糖納米乳作為油相，蒸餾水作為水相，分別選取HEL-40、Span-80為乳化劑，丙三醇、PEG-400為助乳化劑，按照表1將乳化劑和助乳化劑以不同比例混合(Kv)，再加入處方比例的水相和油相，渦旋2 min，制備W/O/W型黨參多糖納米乳。

表1 W/O/W型黨參多糖納米乳處方篩選Table 1 Formulation screening of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemulsion

1.3 性質(zhì)考察

1.3.1外觀 觀察制備的W/O型初乳和W/O/W型黨參多糖納米乳，外觀應(yīng)呈現(xiàn)澄清均一、透明或半透明狀態(tài)并伴有淡藍(lán)色乳光，平行光通過溶液時(shí)應(yīng)出現(xiàn)丁達(dá)爾現(xiàn)象。

1.3.2類型鑒別 利用染色法分別鑒別W/O型初乳和W/O/W型黨參多糖納米乳類型。紅色油溶性染料蘇丹紅Ⅲ和藍(lán)色水溶性染料亞甲基藍(lán)加入到兩種乳劑中。連續(xù)相為油相時(shí)紅色擴(kuò)散速度

快，可判定為W/O或O/W/O型；連續(xù)相為水相時(shí)藍(lán)色擴(kuò)散速度快，可判定為O/W或W/O/W型。

1.3.3粒徑分布 利用Zetasizer Nano SZ?測定W/O/W型黨參多糖納米乳粒度分布和多分散指數(shù)(polydisperse index，PDI)。將納米乳用蒸餾水以1∶100比例稀釋，設(shè)定散射角為173°，在25 ℃條件下檢測。

1.3.4Zeta電位 利用Zetasizer Nano SZ?測定W/O/W型黨參多糖納米乳樣品電泳遷移率獲得Zeta電位值。將納米乳用1 mmol·L-1NaCl溶液以1∶250比例稀釋，在25 ℃條件下檢測。

1.3.5pH 在25 ℃條件下，利用pH計(jì)測定W/O/W型黨參多糖納米乳樣品pH。

1.3.6微觀形態(tài) 用蒸餾水將W/O/W型黨參多糖納米乳溶液1∶100稀釋，取適量滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，室溫下靜置20 min，用濾紙吸干。再滴加適量2%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染5 min，室溫下自然揮干，利用透射電鏡觀察納米乳微觀形態(tài)。

1.3.7穩(wěn)定性考察 取適量黨參多糖納米乳樣品裝于透明玻璃螺口瓶內(nèi)，分別靜置于：①50 ℃條件下;②相對濕度75%、溫度25 ℃條件下;③4 000 lx光照條件下;在上述3種條件下分別進(jìn)行高溫、高濕和光照試驗(yàn)。各樣品分別在0、5、10 d取樣，檢查穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參多糖含量測定結(jié)果

對提取的黨參多糖純化，經(jīng)測定黨參多糖含量為15.66%±0.04%。

2.2 W/O黨參多糖初乳處方的組成

從圖1可以看出，當(dāng)乳化劑和助乳化劑體積比為9∶1、8∶2、7∶3和6∶4時(shí)，偽三元相圖中形成W/O型初乳區(qū)域面積先增大后變小。當(dāng)體積比為7∶3時(shí)面積最大，體積比為6∶4時(shí)面積最小，可見乳化劑與助乳化劑最佳體積比為7∶3。當(dāng)乳化劑與助乳化劑體積比為7∶3時(shí)，Smix與油相體積比為8∶2～3∶7時(shí)，均可形成納米乳，考慮納米乳穩(wěn)定性及乳化劑和助乳化劑用量盡量低的原則，確定Smix與油相體積比為5∶4。

圖1 W/O型初乳處方篩選偽三元相圖Fig.1 Screening pseudo-ternary phase diagram of W/O colostrum prescription

2.3 W/O/W型黨參多糖納米乳處方的組成

不同處方條件下制備W/O/W型黨參多糖納米乳，粒徑和外觀考察結(jié)果如表2所示。由表2中數(shù)據(jù)可知，當(dāng)表面活性劑與助表面活性劑分別為HEL-40和丙三醇，比例為1∶1和2∶1時(shí)，結(jié)果較好，肉眼觀察外觀均一，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，略顯乳白色，粒徑分別為(122.32±2.27) nm(PDI: 0.099±0.032)和(153.76±1.32)nm(PDI: 0.117±0.060)，靜置24 h內(nèi)穩(wěn)定。HEL-40和丙三醇比例為1∶2時(shí)，制備結(jié)束初始狀態(tài)外觀呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，略顯乳白色，靜置24 h后，外觀呈現(xiàn)乳白色，未出現(xiàn)破乳分層現(xiàn)象，這可能與穩(wěn)定性相關(guān)，靜置后乳滴微粒聚集，導(dǎo)致粒徑變大，出現(xiàn)了外觀從略顯乳白色到乳白色的變化。當(dāng)乳化劑為Span-80時(shí)，粒徑在(1 020.22±4.39)～(1 392.08±2.76)nm范圍內(nèi)，靜置30 min后均出現(xiàn)分層；當(dāng)乳化劑為HEL-40，助乳化劑為PEG-400時(shí)，粒徑大小為625.33～692.82 nm范圍內(nèi)，靜置6 h后均出現(xiàn)分層現(xiàn)象?？梢?，處方A′和A″為最佳W/O/W型黨參多糖納米乳處方的組成。

表2 不同處方下W/O/W型黨參多糖納米乳的粒徑和外觀Table 2 Particle size and appearance of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under different prescription conditions

2.4 W/O/W型黨參多糖納米乳的性質(zhì)

2.4.1外觀和類型 制備的初乳外觀透明，黨參多糖納米乳外觀半透明，均呈現(xiàn)澄清均一狀態(tài)，伴有淡藍(lán)色乳光，平行光通過溶液時(shí)出現(xiàn)丁達(dá)爾現(xiàn)象。經(jīng)染色法鑒別，初乳的紅色擴(kuò)散速度快于藍(lán)色，為W/O型；黨參多糖納米乳的紅色擴(kuò)散速度慢于藍(lán)色，為W/O/W型。

2.4.2Zeta電位和pH 表3顯示了處方A′和A″的Zeta電位和pH測定結(jié)果，2個(gè)處方的Zeta電位均接近于電中性，pH分別為6.3和5.5。

表3 處方A′和 A″下W/O/W型黨參多糖納米乳的Zeta電位和pHTable 3 Zeta potential and pH of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under formulation A′and A″

2.4.3微觀形態(tài) 透射電鏡觀察處方A′和A″的微觀形態(tài)如圖2所示。從圖2可以看出，2個(gè)處方制備的W/O/W型黨參多糖納米乳微粒大小均勻，無黏連，粒徑在100～200 nm范圍內(nèi)。

圖2 處方A′和 A″下W/O/W型黨參多糖納米乳透射電鏡Fig.2 Transmission electron microscopy micrographs of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under formulation A′and A″

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 處方A′和A″制備的W/O/W型黨參多糖納米乳穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果見表4。2個(gè)處方的樣品在高溫、高濕及光照條件下穩(wěn)定性良好，外觀均一，略帶乳白色，無絮凝、破乳等現(xiàn)象，粒徑在高溫條件下略有增加，在高濕和光照條件下無明顯變化，提示樣品保存應(yīng)注意避免高溫。

表4 穩(wěn)定性考察Table 4 Stability investigation

3 討論

由于納米乳載藥系統(tǒng)具有多種給藥途徑[14-15]，近年來該劑型得到越來越廣泛的研究，但多數(shù)研究集中于O/W型和W/O型，而對W/O/W型復(fù)乳的研究較少。W/O/W型納米乳也被稱為雙乳液，即乳液中的乳液，是由分散在油相中的水相形成一級W/O初乳，初乳進(jìn)一步分散在水相中形成W/O/W復(fù)乳。利用該給藥系統(tǒng)可以通過口服給藥方式吸收胃腸道環(huán)境不穩(wěn)定的親水性化合物[16]，另外由于其特殊的“兩膜三相”結(jié)構(gòu)，該系統(tǒng)可以同時(shí)承載親水性化合物和親油性化合物[17]，該劑型的研究對拓寬藥物應(yīng)用途徑具有重要意義。

由于多糖具有水溶性好的特點(diǎn)，近年來多糖納米乳制劑的研究多以W/O型為主。李樹鵬[18]制備了W/O型黃芪多糖納米乳免疫佐劑，可有效促進(jìn)雞脾臟淋巴細(xì)胞NO的產(chǎn)生，刺激T細(xì)胞不同亞群調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，效果優(yōu)于黃芪多糖；馬紅梅[19]制備了W/O型蒲公英多糖納米乳，能使小鼠免疫器官指數(shù)升高，促進(jìn)免疫器官生長發(fā)育，刺激機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異免疫，增強(qiáng)小鼠免疫力。作為液體獸用制劑，常以飲水方式給藥，W/O型納米乳外相為油相，無法與飲用水混溶，故在給藥時(shí)存在一定的局限性。本研究篩選出合適的油相、乳化劑和助乳化劑，成功制備了W/O/W型黨參多糖納米乳制劑，有效解決了上述問題，可與水以任意比例混溶，給藥方便，劑量精確。

W/O/W型納米乳的制備通常采用兩步法，第一步制備W/O型初乳，第二步制備W/O/W型復(fù)乳[20]，而在制備過程中通常需要輸入較高的能量，這極大地限制了該劑型在熱敏感藥物中的應(yīng)用[21]。針對這一問題，近年出現(xiàn)了一步自乳化法制備W/O/W型納米乳[22]，該方法在低能條件下制備完成，但需要使用大量的乳化劑，易產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)，且形成的乳劑粒徑較大，從而限制了給藥途徑。本研究通過繪制偽三元相圖篩選處方組成，利用超聲法制備W/O初乳，通過渦旋的方法完成W/O/W型復(fù)乳的制備，不易破壞藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)，同時(shí)優(yōu)選出的2個(gè)處方乳化劑用量較低，為11%和12.5%，同時(shí)平均粒徑較小，為(122.32±2.27)和(153.76±1.32)nm，具有較高的穩(wěn)定性和安全性。

本研究利用偽三元相圖進(jìn)行初乳處方篩選，采用兩步法制備了W/O/W型黨參多糖納米乳免疫增強(qiáng)劑。研究結(jié)果表明，微粒大小均勻，無黏連，粒徑在100～200 nm范圍內(nèi)，穩(wěn)定性好，為黨參多糖作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用提供了一種更優(yōu)的制劑選擇。本課題組將在此研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察黨參多糖免疫增強(qiáng)劑在動(dòng)物體內(nèi)的免疫增強(qiáng)效果，并與黨參多糖溶液劑進(jìn)行對比，同時(shí)對比研究其在動(dòng)物體內(nèi)的緩釋效果，以更好地為在現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，對推進(jìn)畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重要意義。