何啟欣 劉長(zhǎng)建*

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600)

海參自古以來(lái)被譽(yù)為“海產(chǎn)八珍”之一，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身的作用，可與人參媲美[1]。乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、非病原性、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱[2]。乳酸菌對(duì)人體腸道功能和免疫調(diào)節(jié)帶來(lái)的良好作用[3]，近年來(lái)益生菌的應(yīng)用領(lǐng)域一直在不斷拓展，也正逐步得到研究者的關(guān)注[1-4]。本研究從海參腸道中的乳酸菌研究奠定基礎(chǔ)，為應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品加工,增加食品的貨架期，改善因化學(xué)防腐劑帶來(lái)不良口感。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

大連金石灘海域捕撈的海參，冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室，立即取腸道內(nèi)容物。試驗(yàn)采用MRS 培養(yǎng)基。

1.2 儀器設(shè)備

本研究用到的主要設(shè)備有梯度PCR (TC5000，英國(guó)TECHNE 公司)、組織DNA 快速制備儀(Fast Prep-1，美國(guó)MP公司)、超微量分光光度計(jì)(P-330-31，德國(guó)Implen 公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052，上海精宏)、高速冷凍離心機(jī)(S3026 2157，日本三洋)、顯微鏡(N300M 中國(guó)永新)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

取1.0g 腸道內(nèi)容物于MRS 培養(yǎng)液中37℃靜置富集24h。采用連續(xù)稀釋法，取稀釋倍數(shù)為10-5、10-6和10-7稀釋液分別涂布于MRS 固體分離培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48h，挑去生長(zhǎng)良好的菌落。部分菌苔放入過(guò)氧化氫溶液中，觀察是否有氣泡，篩選沒(méi)有氣泡的，即過(guò)氧化氫酶陰性的菌株進(jìn)一步純化[5]。

1.2.2 菌株的菌落形態(tài)、細(xì)胞特征和生理生化鑒定

將純化好的菌株，接種于MRS 固體培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)48h，觀察并記錄其菌落特征，包括菌落邊緣是否整齊、菌落顏色、大小、厚度、表面等形態(tài)學(xué)特征。然后根據(jù)《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與實(shí)驗(yàn)方法》[6]，進(jìn)行了淀粉水解實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)、硫化氫的產(chǎn)生、乙酰甲基甲醇(V-P)、碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸等生理生化試驗(yàn)。

1.2.3 16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定

將乳酸菌HE04 在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，用竹簽刮取少量菌體，放入滅菌小管里，微波法[7，8]提取菌體總DNA。用1%瓊脂糖凝膠120V 電泳30min，紫外觀測(cè)臺(tái)檢測(cè)。

以將提取的基因組DNA 作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用通用引物F27 和R1492，總體積50uL。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃先預(yù)熱變性4min，再進(jìn)入30 個(gè)循環(huán)，分別為95℃變性30s，55℃退火30s,72℃復(fù)性2min，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠120V 電壓下，電泳30min 電泳，把凝膠放在紫外觀測(cè)臺(tái)上進(jìn)行觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 菌落特征及菌體形態(tài)觀察

從海參腸道分離得到13 株過(guò)氧化氫酶陰性的疑似乳酸菌，經(jīng)過(guò)三次純化培養(yǎng)，最終篩選得到一株生長(zhǎng)良好的菌株，命名為乳酸菌HE04，革蘭氏染色后的顯微鏡下觀察，革蘭氏染色為陽(yáng)性，細(xì)胞為桿狀(見(jiàn)圖1)。在MRS 固體平板上培養(yǎng)48h 后，菌落呈乳白色、表面光滑、易挑取、邊緣園整、隆起、菌落直徑小于0.5mm。

圖1 菌株HE04 革蘭氏染色

2.2 乳酸菌的生理生化特征

參照文獻(xiàn)[6]中的方法，乳酸菌HE04 做進(jìn)一步生理學(xué)特征試驗(yàn)。結(jié)果顯示過(guò)氧化氫酶陰性、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、硫化氫的產(chǎn)生和V－P 實(shí)驗(yàn)均為陰性；能水解淀粉、半乳糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖、山梨醇、果糖和七葉苷，不能利用肌醇。(表1)

表1 菌株HE04 的生理生化結(jié)果

2.3 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定(16S rDNA)

提取的總DNA 在瓊脂糖凝膠后的紫外觀測(cè)臺(tái)檢測(cè)結(jié)果，可以看到條帶清晰，滿足下一步擴(kuò)增要求。以提取的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物在1500 bp 位置有清晰條帶，說(shuō)明PCR 條件合理(圖2)，能夠滿足測(cè)序要求。

圖2 菌株HE04 的16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物電泳圖

16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物委托寶生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序序列結(jié)果上傳到NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，與已知的相關(guān)序列進(jìn)行對(duì)比，從結(jié)果分析可知分離到的乳酸菌HE04 的16SrDNA 序列與菌株Lactobacillus plantarum 的16S rDNA 序列的同源性最高(見(jiàn)圖3)，同源性達(dá)到100%。結(jié)合該菌株的的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征、生理生化特征，乳酸菌HE04 可鑒定為植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum)。

圖3 菌株HE04 與相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從海參腸道分離得到一株乳酸菌HE04。對(duì)乳酸菌進(jìn)行菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)的觀察，精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)、糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、V－P 試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)，以及16S rDNA 序列分析,最終鑒定其為植物乳桿菌。該菌株可以作為食品加工的種子資源。