吳 凡 謝鈺珍 封 怡 焦天賜

(蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

造血干細(xì)胞(HSC)是具有永生能力和自我更新能力的一種血細(xì)胞，主要包括髓樣、紅系和淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞。其生物學(xué)功能廣泛，具體表現(xiàn)在臨床方面，對于HSC 的研究涉及細(xì)胞治療、基因治療、腫瘤治療、血液病和遺傳病等多個方面。如今HSC 的主要來源，是動員的外周血、骨髓、胎盤和臍帶血。由于這些供體中可使用的HSC 數(shù)量有限，較為珍貴，因此迫切需要使用體外擴增技術(shù)以獲得大量可移植的HSC 來滿足臨床上的需求。

體外擴增研究大多數(shù)都集中在內(nèi)因或者是環(huán)境誘導(dǎo)介導(dǎo)的HSC 的更新和存活過程，通過與永生化基質(zhì)細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞或過度表達(dá)自我更新基因共同實現(xiàn)了合理化干細(xì)胞擴增。但是，這些方法面臨對基質(zhì)環(huán)境的操作或者對造血干細(xì)胞基因組的擾動等因素的干擾，且增加了一些如患癌等意外風(fēng)險，同時離體培養(yǎng)HSC 成本較高，這些因素阻礙了HSC 的工業(yè)化培養(yǎng)和臨床使用。本文研究目的在于建立一種簡單有效、能夠降低受體患病風(fēng)險、且能夠降低成本的細(xì)胞體外擴增方法，來滿足臨床對于造血干細(xì)胞的需求。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

由蘇州大學(xué)附屬醫(yī)院提供的外周血，血樣樣本要求：健康供體、無其他疾病。抽取后血液在4℃保存并運輸?shù)綄嶒炇?。之后操作均在生物安全柜中進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血細(xì)胞分選

1.2.1.1 在50mL 的離心管1 中加入2mL 富集后的新鮮外周血，再加入含有2.5%胎牛血清的PBS(以下簡稱F-PBS)補足30mL；另取一支50mL 的離心管2，加入15mL 的Ficoll 液體，將在離心管1 中稀釋的外周血全部緩慢加入到離心管2 中，加入過程中離心管傾斜放置。將離心管2 垂直放入離心機，升速調(diào)至6、降速調(diào)至5，常溫下1900 rpm 離心12 min，離心結(jié)束后管內(nèi)溶液分為上中下三層。用移液槍緩慢吸取中間的白膜層，轉(zhuǎn)移到新的50mL 離心管，加入F-PBS 補齊至30mL，再次離心，4℃、1900 rpm 離心5min，結(jié)束后棄去上清；再次加入F-PBS 至30mL，4℃、1900 rpm 離心5min 后棄去上清。在管中加入500 μL 的F-PBS 重懸細(xì)胞，進行細(xì)胞計數(shù)。

1.2.1.2 在上述得到的細(xì)胞懸液中加入2g CD34+磁珠及FCR Blocking，用槍頭輕輕吹打細(xì)胞，充分混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡。將混合液置于4℃冰箱避光孵育30min，孵育結(jié)束后加入30mL 的F-PBS，在4℃條件下1900rpm 離心5 分鐘，去除未與細(xì)胞結(jié)合的磁珠。管中加入500μL 的分選buffer 進行重懸后，將溶液置于已消毒、潤洗的分選磁柱中進行分離，結(jié)束后再加入3 mL 分選buffer 進行沖洗，重復(fù)三次。將分選磁柱內(nèi)芯從磁架上取下，放入15mL 離心管中，重新加入6mL 分選buffer，用推子快速推動，使細(xì)胞全部落入離心管中。得到的細(xì)胞懸液在4℃、1900rpm 離心5 分鐘，棄去上清，使用1mL 培養(yǎng)液重懸，臺盼藍(lán)染色計數(shù)。

1.2.2 造血干細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加細(xì)胞因子

1.2.2.1 MS5 細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇傳代后，加入D2.5(DMEM+2.5%FBS)洗滌，4℃下1900rpm 離心5 分鐘，去除上清后用1mL 的D10(10%FBS+DMEM)重懸細(xì)胞，計數(shù)后，取3×106的細(xì)胞加入新的15mL 離心管，加入培養(yǎng)基將容積補滿1mL，再加入1mL 濃度為10ng/mL 的絲裂霉素C，37℃孵育3 小時，結(jié)束后用15mLPBS 溶液清洗并離心兩次。重懸細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞密度至0.25M。

1.2.2.2 在96 孔板中，每個孔里加入100μL 的細(xì)胞懸浮液，過夜培養(yǎng)，去除上清后按表1 設(shè)置三個培養(yǎng)組，每組3 個復(fù)孔，各組添加不同細(xì)胞因子，細(xì)胞培養(yǎng)到第七天進行細(xì)胞計數(shù)觀察。

表1 各組添加的細(xì)胞因子組合表

1.2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)第七天，加入PE 對CD34+細(xì)胞進行染色，對CD38+細(xì)胞使用APC 染色，4℃避光孵育半小時，放入流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 優(yōu)化細(xì)胞因子濃度

根據(jù)1.2.2 結(jié)果，選擇組合結(jié)果佳的一組，調(diào)整細(xì)胞因子濃度(表2)，培養(yǎng)七天后，加入PE 對CD34+細(xì)胞進行染色，對CD38+細(xì)胞使用APC 染色，4℃避光孵育半小時，放入流式細(xì)胞儀檢測。同時使用臺盼藍(lán)對造血干細(xì)胞增殖總數(shù)及CD34+細(xì)胞進行計數(shù)，并計算擴增倍數(shù)。

表2 細(xì)胞因子濃度組合

根據(jù)細(xì)胞增殖記錄、擴增倍數(shù)以及CD34+造血干細(xì)胞的純度，篩選最佳的細(xì)胞因子濃度組合。

1.2.4 觀察Feeder cell 對培養(yǎng)體系的影響

在1.2.3 基礎(chǔ)上，設(shè)置添加Feeder cell 的實驗組(F)和不添加對照組(G)，培養(yǎng)造血干細(xì)胞，七天后檢測細(xì)胞增殖記錄、擴增倍數(shù)以及CD34+造血干細(xì)胞的純度，研究Feeder cell 對培養(yǎng)結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 分組添加細(xì)胞因子后結(jié)果

各組如表1 添加細(xì)胞因子組合后，細(xì)胞培養(yǎng)7 天，計數(shù)結(jié)果及細(xì)胞擴增倍數(shù)來看，C 組細(xì)胞擴增七天后達(dá)到2.29M，共擴增76.5 倍，細(xì)胞總數(shù)和擴增倍數(shù)明顯高于其他兩組。

據(jù)圖1、圖2 分析可得，C 組造血干細(xì)胞中CD34+比例最高，可達(dá)到62.1%，且CD38+比例最低，僅為4.66%，CD34+細(xì)胞量最多，且CD34+細(xì)胞擴增倍數(shù)最大；B 組造血干細(xì)胞中CD34+比例略低，為53.4%，而CD38+比例較高，為5.5%，且CD34+細(xì)胞量及擴增倍數(shù)均低于C；A 組造血干細(xì)胞中CD34+比例最低，僅為37.3%，CD38+比例最高，為8.81%，CD34+細(xì)胞量及擴增倍數(shù)為三組最低，由于本實驗為CD34+造血干細(xì)胞培養(yǎng)體系，而CD38+為定向祖細(xì)胞，并非目標(biāo)細(xì)胞群體，因此根據(jù)細(xì)胞擴增及流式染色結(jié)果可以看出，C 組為培養(yǎng)造血干細(xì)胞最適細(xì)胞因子組合，即FLT3L 50ng/ML，SCF 30 ng/ML，IL-3 10 ng/ML，IL-6 15ng/ML。

圖1 三組細(xì)胞培養(yǎng)后CD34+細(xì)胞流式染色圖(四象限：Q1 為CD38+陽性與CD34+陰性，Q2 為CD38+陽性與CD34+陽性，Q3 為CD38+陰性和CD34+陽性，Q4 為CD38+陰性和CD34+陰性)

圖2 培養(yǎng)后第七天各組CD34+細(xì)胞計數(shù)(A)與擴增倍數(shù)(B)統(tǒng)計

2.2 細(xì)胞因子濃度優(yōu)化后結(jié)果

三組細(xì)胞在不同細(xì)胞因子濃度條件下(表2)，培養(yǎng)七天后，F(xiàn) 組細(xì)胞量達(dá)到2.45M，7 天共擴增81.7 倍，是三組中細(xì)胞量及擴增倍數(shù)最高的一組。

流式染色顯示，調(diào)整造血干細(xì)胞培養(yǎng)體系中的細(xì)胞因子濃度，F(xiàn) 組造血干細(xì)胞中CD34+比例最高，可達(dá)到83.1%，且CD38+比例最低，僅為4.98 %，CD34+細(xì)胞量最多，且CD34+細(xì)胞擴增倍數(shù)最大；E 組造血干細(xì)胞中CD34+比例略低，為78.3%，CD38+比例較高，為5.09%，且CD34+細(xì)胞量及擴增倍數(shù)均低于F；D 組造血干細(xì)胞中CD34+比例最低，僅為63.1%，CD38+比例最高，為5.19%，且CD34+細(xì)胞量及擴增倍數(shù)為三組最低(圖3、圖4)。由于本實驗為CD34 造血干細(xì)胞培養(yǎng)體系，而CD38+為定向祖細(xì)胞，并非目標(biāo)細(xì)胞群體，因此根據(jù)細(xì)胞擴增及流式染色結(jié)果可以看出，在含有MS5 feeder cell的情況下，F(xiàn) 組中的細(xì)胞因組合是培養(yǎng)造血干細(xì)胞最適細(xì)胞因子 組 合， 分 別 為 FLT3L 100ng/ML，SCF 30 ng/ML，IL-3 10ng/ML，15ng/ML。

圖3 改變細(xì)胞因子濃度后各組細(xì)胞計數(shù)(A)及擴增倍數(shù)(B)統(tǒng)計圖

圖4 改變細(xì)胞因子濃度后三組細(xì)胞CD34+流式染色結(jié)果

2.3 feeder cell 對造血干細(xì)胞培養(yǎng)體系的影響

F 組添加feeder cell 培養(yǎng)七天后，總細(xì)胞量達(dá)到2.56M，擴增倍數(shù)85 倍，較未添加feeder cell的G 組細(xì)胞量和擴增倍數(shù)明顯增高。兩組細(xì)胞進行流式染色后，圖6 結(jié)果顯示，F(xiàn) 組造血干細(xì)胞中CD34+比例最高，可達(dá)到85.7%，且CD38+比例最低，僅為3.76 %，CD34+細(xì)胞量最多，且CD34+細(xì)胞擴增倍數(shù)最大；G 組造血干細(xì)胞中CD34+比例低，為46%，CD38+比例較高，為6.29%，且CD34+細(xì)胞量及擴增倍數(shù)均低于F 組；因此根據(jù)細(xì)胞擴增及流式染色結(jié)果可以看出，在培養(yǎng)造血干細(xì)胞過程中，添加feeder cell 有利于細(xì)胞生長。

圖5 改變feeder cell 添加條件后兩組細(xì)胞CD34+流式染色結(jié)果

圖6 改變feeder cell 添加條件后兩組CD34+細(xì)胞計數(shù)(A)與擴增倍數(shù)(B)統(tǒng)計

3 結(jié)論與討論

本實驗研究的人CD34+細(xì)胞在科研研究過程中需求量大，一直處于供應(yīng)相對緊張的狀態(tài)，而細(xì)胞獲取途徑有限，因此建立合適的體外擴增培養(yǎng)體系是非常必要的。本次實驗通過調(diào)整培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子組合、濃度以及有無基質(zhì)細(xì)胞三方面來優(yōu)化CD34+造血干/前體細(xì)胞的體外擴增條件。經(jīng)實驗確定，在使用細(xì)胞因子及濃度分別為FLT3L 100ng/mL、SCF 30ng/mL、IL-3 20ng/mL、IL-6 15ng/mL 的條件下，添加基質(zhì)細(xì)胞feeder cell 可作為人CD34+HSPC 的最佳體外擴增方案。

CD34+在臨床實驗研究和應(yīng)用方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，在多種疾病的治療研究方案中都有采用。但CD34+HSPC 多數(shù)存在于臍帶血、動員的外周血和胎盤、骨髓中，來源或多或少存在一些缺陷，無法保證來源穩(wěn)定可靠，且移植較為困難，對成人患者、造血干細(xì)胞需求量大的患者較難滿足治療需要。本實驗研究結(jié)果對CD34+HSPC 在體外高效擴增提供了一個可行性較高的方案，待成熟完善后，可以實現(xiàn)體外大量且無毒副作用的細(xì)胞擴增，能夠解決部分血液病或者遺傳病的治療問題，造福人類。