彭禹銘 劉巳齊 李婧婧 紀(jì)可欣 李岑 劉艷霞

摘 要：從復(fù)合水果酵素中分離酵母菌，通過形態(tài)學(xué)特征，生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，并對其生長特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：分離出的A1、A2、A3為水果酵素中的優(yōu)勢酵母，其具有耐高糖，耐低pH、耐高滲、耐一定酒精濃度特性，其可在初始糖量400g/L以下，pH為2以上，酒精濃度12%以下的環(huán)境中生長。

關(guān)鍵詞：酵素;酵母;分離;生理生化特性;

1 前言

酵素食品是指新鮮果蔬、谷物、菌菇或其它食用植物等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵形成的，富含維生素、酶、多酚類化合物等多種生物活性物質(zhì)的產(chǎn)品[1]。其在維持機(jī)體代謝，促消化、修復(fù)組織，抗氧化、減肥，凈化血等方面具有不可代替的功效[2-4]。

酵素生產(chǎn)主要是自然發(fā)酵過程，在其發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多種酶類、短鏈脂肪酸、醇、酯等代謝產(chǎn)物。

自然發(fā)酵過程中微生物主要來源于原料本身和加工環(huán)境，其中部分微生物會快速生長并成為優(yōu)勢菌，例如乳桿菌、等細(xì)菌和畢赤酵母、少見的伊薩酵母和釀酒酵母等。

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 材料

復(fù)合水果酵素原液：發(fā)酵3個月，還原糖含量620g/L，pH3.25，硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、氯化鈉、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖;PDA培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基、碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無維生素培養(yǎng)基。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 工藝流程

果肉→破碎→調(diào)配混合→發(fā)酵→成品→酵母培養(yǎng)→酵母分離純化。

2.2.2 酵母菌的分離純化

用梯度稀釋法，將樣品涂布于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，純化后轉(zhuǎn)接于斜面保存待用。

2.2.3 形態(tài)特征鑒定

菌落形態(tài)觀察：將純化好的單菌落接種于PDA固體培養(yǎng)基和PDA液體培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)72h，記錄菌落大小、形狀、顏色、質(zhì)地是否有凹凸。

顯微觀察：挑取少許單菌落于載玻片上，用滅菌生理鹽水稀釋，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞形態(tài)、菌體大小、形狀、 繁殖方式。

2.2.4 生理生化特征鑒定

依據(jù)《酵母菌的特征及鑒定手冊》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》進(jìn)行：糖發(fā)酵鑒定、碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)、無維生素培養(yǎng)基上生長實(shí)驗(yàn)、耐高滲透壓的測試、產(chǎn)生類淀粉化合物測定等試驗(yàn)。

2.2.5 耐受性實(shí)驗(yàn)

2.2.5.1 生物量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將純化好的單菌落接種于YEPD液體培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)1d，制成107CFU/mL的菌懸液。

取1mL活化好的菌液，接種于起始葡萄糖濃度為100g/L的YEPD液體培養(yǎng)基，于28℃下恒溫培養(yǎng)2d。

分別取5、10、15、20、25、30、35mL，于50mL的離心管中，5000r/min離心10min，傾去上清液，將得到的2組菌體沉淀中的一組烘干、稱重，另一組用去離子水定容到50mL容量瓶中，測定D600，繪制生物質(zhì)干重-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5.2 高糖耐受性實(shí)驗(yàn)

按3%的接種量，分別接種于起始葡萄糖濃度為100、200、300、400、500g/L的YEPD液體培養(yǎng)基，pH5.0，于28℃下恒溫培養(yǎng)5d，OD600條件下每12h測定一次，重復(fù)3次。

2.2.5.3 低pH耐受性實(shí)驗(yàn)

配置pH為1、2、3、4、5、6的YEPD液體培養(yǎng)基，按3%的接種量接種，于28℃下恒溫培養(yǎng)8d，每24h取一次樣，測定OD600。

2.2.5.4 酒精耐受性實(shí)驗(yàn)

配置乙醇濃度為0、6%、9%、12%、15%、18%的YEPD液體培養(yǎng)基，按3%的接種量接種，于28℃下恒溫培養(yǎng)8d，每24h取一次樣，測定OD600。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離純化、形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

篩選具有典型酵母菌落特征的菌落3株供試菌在固體、液體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見表3-1。

3.2 菌株鑒定結(jié)果

菌株生理生化特征見表3-2，初步判斷三株菌株屬于接合酵母屬。

3.3 耐受性考察（選取A1菌株進(jìn)行耐受性實(shí)驗(yàn)）

3.3.1 生物量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

菌懸液稀釋成0.1g/L，0.15g/L，0.2g/L，0.25g/L，0.3g/L，0.35g/L的濃度，在波長600nm處測吸光度，繪制出生物量—吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

3.3.2 高糖耐受性考察

每隔12h，吸取一次菌懸液，在600nm處測其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出其每個時間段菌懸液的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-2。

由圖3-2可知，在初始葡萄糖含量100～500g/L時，隨著初始葡萄糖含量的增加，菌株生長延緩期增長，當(dāng)初始糖濃度為600g/L時，菌株延緩期84h，且生長極其緩慢。

3.3.3 低pH耐受性考察

每隔12h，吸一次菌懸液，600nm處測吸光度，結(jié)果見圖3-3。

由圖3-3可知，當(dāng)初始pH為1和2時，菌株不生長，當(dāng)初始pH為3-6時，菌株的延緩期逐漸縮短。

3.3.4 酒精耐受性考察

每隔12h取一次菌懸液，在600nm處測其吸光度，結(jié)果見圖3-4。

由圖3-4可知，初始乙醇濃度為15%和18%時，菌株不生長，而在0%～12%區(qū)間時，菌株的延緩期逐漸延長。

4 結(jié)論

從發(fā)酵3個月的復(fù)合水果酵素原液中分離出A1、A2、A3等三株菌株，均被鑒定為接合酵母，該菌種在初始葡萄糖含量100～400g/L時，均可生長，隨著初始葡萄糖含量增加，菌種的延緩期增長。在初始pH為3～6時，隨著初始pH的增加，菌株生長的延緩期變短。在初始乙醇濃度為0%～12%時，隨著初始乙醇濃度的增加，菌株生長的延緩期增長。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會.T/CBFIA 08001-2016，酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[2] 毛建衛(wèi)，吳元鋒，方晟.微生物酵素研究進(jìn)展[J].發(fā)酵科技通訊，2010，39（3）：42-44.

[3] 蔣增良.天然微生物酵素發(fā)酵機(jī)理、代謝過程及生物活性研究[D].寧波：浙江理工大學(xué)，2012：1-6.

[4] 蔣增良，毛建衛(wèi)，黃俊，等.藍(lán)莓酵素在天然發(fā)酵過程中抗氧化性能的變化[J].食品工業(yè)科技，2013，34（2）：194-197.

[5] [英]巴尼特（Barnett，J.A.）著，胡瑞卿 譯.《酵母菌的特征及鑒定手冊》[M].青島海洋大學(xué)出版社.2015.

[6] 劉雅婷，王建斌.《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.