李可維 張宏超 劉海晶 孫莉 張雪

摘要：根據(jù)發(fā)酵原料藥生產(chǎn)要求，對維生素C生產(chǎn)所用的發(fā)酵罐進行滅菌工藝驗證，通過熱分布測試確認發(fā)酵罐的溫度分布，通過微生物挑戰(zhàn)實驗確認發(fā)酵罐的無菌狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵罐 熱分布測試 微生物挑戰(zhàn)實驗

1 引言：

在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)前需要保持確?？瞻l(fā)酵罐的無菌狀態(tài)，依據(jù)制藥行業(yè)規(guī)范和GMP對發(fā)酵罐空消滅菌過程實施熱分布測試和微生物挑戰(zhàn)實驗。從而實現(xiàn)發(fā)酵過程的無菌純培養(yǎng)，降低發(fā)酵液染菌的風(fēng)險，保證產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效益。

2 GMP發(fā)酵罐的主要技術(shù)參數(shù)

（1）發(fā)酵罐工作體積為200m3。

（2）發(fā)酵罐由罐體，管路和控制系統(tǒng)組成。

（3）能夠準(zhǔn)確控制攪拌速度、空氣流量和培養(yǎng)溫度，能夠精確測量溫度、pH值和空氣流量。

（4）發(fā)酵罐為上攪拌發(fā)酵罐，采用雙端面機械密封，具有良好的密封性能。

（5）無菌空氣采用雙級過濾器進行除菌過濾，過濾效率高，能夠耐受蒸汽滅菌。

（6）罐體和管路均采用304不銹鋼制作，接觸液體表面經(jīng)過拋光處理，罐體具有零死角接種閥、取樣閥和底閥。

3 實驗儀器、耗材

3.1 WL-T1無線溫度驗證系統(tǒng)

型號 WL-T1通用型

感溫元件 PT1000

測量范圍 -60℃至150℃

精度 ±0.1℃

分辨率 0.01℃

記錄儀材質(zhì) 316L不銹鋼

3.2生物指示劑

生產(chǎn)商：美國3M公司 型號：Attest 1262-S生物指示劑（蒸汽）

D值（121℃）：1.5～3.0分鐘 菌種：ATCC7953嗜熱脂肪地芽孢桿菌

培養(yǎng)溫度：56℃±2℃ 孢子量：1.0×106～9.9×106

Z值：≥6℃ 儲存條件：15～30℃，35%～65%RH

3.3可擴展試驗箱

設(shè)備型號：BXS-250 設(shè)備容積：250L

電源電壓：220V/50Hz 控溫范圍：0～70℃

出廠日期：2019年08月20日 出廠編號：190020

生產(chǎn)商：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠

3.4 高精度數(shù)字溫度計

設(shè)備型號：IPRT-1 出廠編號：19071829

量程：-200℃～500℃ 校驗周期：1年

校驗日期：2020年08月26日 下次校驗：2021年08月25日

生產(chǎn)商：深圳市研工科技有限公司

3.5 恒溫油槽

設(shè)備型號：CJTH-300A 設(shè)備出廠編號：8687

工作溫度范圍：90℃～300℃ 溫度波動度：±0.01℃

溫度均勻度：±0.01℃ 生產(chǎn)廠家：湖北唯立儀表廠

4驗證方案設(shè)計

4.1無線溫度驗證系統(tǒng)前校準(zhǔn)

開機前檢查油槽內(nèi)硅油液位是否在加熱管之上，檢查無誤連接電源。判斷標(biāo)準(zhǔn)處判定時間設(shè)置3分鐘，偏差要求值設(shè)置0.5℃。校準(zhǔn)低點設(shè)置為110℃，高點設(shè)置為140℃，校驗點設(shè)置為125℃。設(shè)置后將無線記錄器和標(biāo)準(zhǔn)溫度計放置在恒溫油槽內(nèi)。停止倒計時后，取出無線記錄器充分冷卻后擦干無線記錄器表面的水分，上傳無線記錄器的數(shù)據(jù)。完成校準(zhǔn)過程。

校準(zhǔn)結(jié)束后查看原始校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，查看溫度波動、補償值、偏差值是否有異常情況，在溫度校準(zhǔn)報告的最后一頁查看校準(zhǔn)是否通過。

4.2空消熱分布測試

（1）熱分布測試策略：

發(fā)酵罐是維生素C發(fā)酵設(shè)備，為確保持續(xù)穩(wěn)定的微生物發(fā)酵需要，采用空消滅菌工藝，需進行熱分布測試。發(fā)酵罐在日常滅菌過程中，使用空消滅菌程序，在進行發(fā)酵罐驗證時將開展對應(yīng)的滅菌程序測試和生物挑戰(zhàn)。基于生產(chǎn)工藝流程，發(fā)酵罐的空消滅菌工藝條件為（125℃/70min）。本次為該滅菌程序在該設(shè)備上的首次驗證，因此驗證方案設(shè)計為連續(xù)測試3次。

（2）熱分布測試風(fēng)險分析

空消滅菌工藝本身的風(fēng)險;溫度不能達到滅菌條件要求;溫度不均一（可能由于進汽程序、排汽/氣程序、設(shè)備結(jié)構(gòu)造成的局部冷點）;滅菌時間不夠;空氣熱傳導(dǎo)和金屬熱傳導(dǎo)速度的差異造成滅菌時間的差異;

（3）熱分布布點風(fēng)險控制策略：

根據(jù)滅菌對象的空間幾何形狀進行布點，以識別空間幾何形狀對溫度分布的影響;根據(jù)罐體內(nèi)滅菌對象進行布點，以識別滅菌對象性質(zhì)差異造成對溫度分布的影響;根據(jù)進汽點位置進行布點，以評估進汽點溫度（可能的高溫點）可能對滅菌效果影響;根據(jù)排汽點（疏水）進行布點，以評估排汽點溫度（可能的低溫點）可能對滅菌效果的影響;

布置15根溫度探頭，其中1#至12#探頭分別固定在發(fā)酵罐的上中下3層，按照罐體高度平均分為上中下三層，每層4個點，周邊每120度一個，1#、5#、9#為各層的中心點;

13#置于上封頭頂部空間中心位置;

14#置于罐底排放管道位置;

15#至放置在發(fā)酵罐溫度控制探頭處，

根據(jù)內(nèi)壁部件選擇發(fā)酵罐的適當(dāng)位置進行固定（盤管、擋板、攪拌器轉(zhuǎn)軸），如無適當(dāng)依托則制作相應(yīng)的內(nèi)部托架;

（4）熱分布測試接受標(biāo)準(zhǔn)

在滅菌階段各點的累積F0值要求≥15為合格;

在滅菌階段，所有傳感器的溫度值均達到125℃;保壓時間達到70min。

（5）熱分布測試接受導(dǎo)出測試結(jié)果后，參照前校準(zhǔn)對無線溫度驗證系統(tǒng)實施后校準(zhǔn)。

4.3生物挑戰(zhàn)測試

（1）生物指示劑確認：選用嗜熱脂肪地芽孢桿菌ATCC7953;孢子量符合1.0×106～9.9×106cfu/條的標(biāo)準(zhǔn)

（2）生物指示劑放置要求：生物指示劑和無線溫度探頭同時進行布點。

（3）生物指示劑使用方法：

按照布點圖分別將生物指示劑放在發(fā)酵罐內(nèi)不同位置，啟動滅菌程序進行滅菌。滅菌完畢，取出該生物指示劑。擠破內(nèi)含的安瓿，與一支陽性對照管一起放于56℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時后觀察培養(yǎng)結(jié)果。

（4）生物挑戰(zhàn)測試可接受標(biāo)準(zhǔn)

陽性對照：培養(yǎng)后陽性對照指示管應(yīng)有微生物生長，即培養(yǎng)基顏色呈黃色，則該次試驗有效。培養(yǎng)后陽性對照指示管標(biāo)簽仍呈現(xiàn)粉紅色。

蒸汽滅菌后的生物指示劑：培養(yǎng)后經(jīng)滅菌的所有生物指示劑保持紫色為無菌生長，判定為滅菌合格。培養(yǎng)后經(jīng)滅菌的所有生物指示劑標(biāo)簽從粉紅色變成棕色。

5 驗證結(jié)果分析

（1）無線溫度驗證系統(tǒng)校準(zhǔn)結(jié)果分析

前校準(zhǔn)及后校準(zhǔn)均一次性通過，在校準(zhǔn)溫度點無線探頭和標(biāo)準(zhǔn)溫度計的最大偏差為0.02℃，遠小于0.5℃的偏差要求，說明無線溫度驗證系統(tǒng)和恒溫油槽的穩(wěn)定性較高，其穩(wěn)定性和國外同類產(chǎn)品一致。

（2）熱分布結(jié)果分析

對三次熱分布測試的滅菌保持階段的最低溫度、滅菌保持階段的時間和累積的F0值進行統(tǒng)計。

2：熱分布測試關(guān)鍵數(shù)據(jù)匯總表

三次熱分布測試的滅菌段最低溫度均大于設(shè)定的滅菌可接受標(biāo)準(zhǔn)中的125℃，且三次熱分布測試滅菌段最低溫度極差為1.41℃。三次熱分布測試滅菌段最高溫度極差為0.63℃。三次熱分布測試的滅菌階段時間均為70min。最小累積F0值遠大于可接受標(biāo)準(zhǔn)15，且三次熱分布測試最小累積F0值極差為20.22。說明滅菌程序熱分布測試達到了預(yù)定目標(biāo)，滅菌程序的重復(fù)性較好。

（3）微生物挑戰(zhàn)結(jié)果分析

所使用的生物指示劑信息：

生產(chǎn)商：3M 型號：1262-S 生產(chǎn)批號：333K3W

菌種：ATCC7953 孢子量：4.6×106CFU D值（121℃）：2.1min

存活時間：9.79min 殺滅時間：22.39min Z值：15℃

生產(chǎn)日期：2020年10月29日 有效期：2022年10月28日

每次滅菌測試結(jié)束后，罐體完成降溫后將生物指示劑與無線記錄儀一起取出，將指示劑中的培養(yǎng)基玻璃小瓶捏碎后，將生物指示劑放在生化培養(yǎng)箱中，在56℃的條件下培養(yǎng)48小時候觀察培養(yǎng)結(jié)果，三次滅菌的生物指示劑全部符合滅菌要求（呈深藍色），陽性呈現(xiàn)黃色，達到了滅菌驗證方案中的預(yù)定要求。

參照美國注射劑協(xié)會編寫的第61號技術(shù)報告《在線滅菌》中關(guān)于生物挑戰(zhàn)的分析，計算生物F0值如下：

FBIO=DT×SLR（孢子下降對數(shù)）

FBIO=DT×（logN0-logNF）

=2.1×（log4.6×106-log100）

=13.99

說明生物挑戰(zhàn)實驗已達到了過度殺滅（FBIO為12）的滅菌水平，滅菌條件能夠保證發(fā)酵罐的無菌條件下純培養(yǎng)要求。

6 結(jié)果討論

驗證實施前進行了多次的滅菌參數(shù)調(diào)試，以確保滅菌參數(shù)能夠符合滅菌工藝要求，在此強調(diào)良好的調(diào)試是滅菌驗證的成功的保證，沒有一個萬能的參數(shù)能夠滿足不同要求，一定要結(jié)合自身的實際情況去摸索符合自身實際情況的控制參數(shù)，也是基于此點本文并未列出非常具體的滅菌參數(shù)。本文的最大價值為制藥行業(yè)同仁提供一個可供參考的案例進行分享。

參考文獻

[1]《中國藥典2020年版》9207滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則

[2]GBT 19972-2018醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 生物指示劑選擇、使用和結(jié)果判斷指南

[3]USP42-NF37 <1229.1> Steam Sterilization by Direct Contact

[4]Parenteral Drug Association Technical Report No.61 Steam In Place

作者簡介：李可維 1986.05.13 男 吉林省榆樹市 漢族 大學(xué)本科 助力工程師 從事藥品質(zhì)量管理