余 清

(湖北六七二中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430070)

黃芩苷是從唇形科植物黃芩(Scutellariaba-icalensisGeorgi)的干燥根莖中提取分離出的黃酮類化合物，具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎、抗病毒等藥理作用[1]。已有文獻表明，黃芩苷對乙肝的3種抗原具有明顯抑制作用，對慢性乙肝并發(fā)癥也具有良好的治療效果[2-3]，主治急慢性肝炎，療效確切[4]。黃芩苷水溶性差，生物利用度低，限制了其臨床應(yīng)用[5]。為了提高黃芩苷的溶解性，增加其口服生物利用度，研究人員已將其制備成固體脂質(zhì)納米粒[6]、納米晶[7]、固體分散體[8]及磷脂復(fù)合物[9]等新型給藥系統(tǒng)。β-環(huán)糊精(β-CD)包合物[10]已在提高難溶性藥物的水溶性、改善藥物生物利用度及增加藥物穩(wěn)定性等方面得到了廣泛關(guān)注，其脂質(zhì)體具有控制藥物釋放、延長藥物半衰期、提高藥物生物利用度等優(yōu)勢[11]。因此，本研究擬將黃芩苷首先制備成β-CD包合物，再包載到脂質(zhì)體中，制備成β-CD包合物脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)，并通過大鼠口服考察其生物利用度情況，為黃芩苷的口服新劑型研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 U3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；BXXW-LGJ-10型真空冷凍干燥機(北京市博翔興旺科技發(fā)展有限公司)；Nicolet 380型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，美國Nicolet公司)；Nano ZS90納米粒度及Zeta電位儀(英國馬爾文儀器有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；JEM-2100F型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.2試藥 黃芩苷(四川省玉鑫藥業(yè)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.60%，批號190806)；黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%，批號110715-201312)；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%，批號100080-201406)；大豆卵磷脂(SPC，沈陽天峰生物制藥有限公司)；膽固醇(安徽酷爾生物工程有限公司)；乙酸乙酯和β-CD(分析純)，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；磷鎢酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；pH 6.8磷酸鹽緩沖液(PBS，自制)；甲醇和乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；氯仿(北京化工廠)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1黃芩苷β-CD包合物的制備及包合率測定 采用飽和水溶液法制備黃芩苷β-CD包合物[12-13]，稱取處方量β-CD加入到一定溫度水中攪拌溶解，制成β-CD飽和溶液；稱取處方量黃芩苷乙醇溶液緩慢滴加到β-CD飽和溶液中，恒溫水浴并持續(xù)攪拌1 h，冷卻到室溫，置于冰箱中冷藏一晝夜，沙漏抽濾，無水乙醇洗滌3次，冷凍干燥去除水分，即得黃芩苷β-CD包合物。

精密稱取黃芩苷β-CD包合物1.0 g，加入到乙醇中超聲15 min，加乙醇定容至20 mL，離心，移取全部上清液，減壓干燥，殘留物用甲醇10 mL溶解，過0.22 μm微孔濾膜，進樣檢測藥物含量，計算包合率。

2.2正交實驗法優(yōu)化黃芩苷β-CD包合物制備工藝 選取對黃芩苷β-CD包合物制備工藝影響較大的3個因素，即攪拌速度、水浴溫度以及藥物與載體質(zhì)量比，每個因素設(shè)置3個水平，以包合率作為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交實驗篩選出最佳制備工藝[14]，正交實驗的各因素與水平見表1，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

由表2和表3可知，對黃芩苷β-CD包合物的包合率影響順序大小依次為C(藥物與載體質(zhì)量比)>A(攪拌速度)>B(水浴溫度)。方差分析結(jié)果顯示，藥物與載體質(zhì)量比與攪拌速度對包合率具有顯著影響(P<0.05)，水浴溫度影響不顯著(P>0.05)。根據(jù)直觀分析結(jié)果，確定黃芩苷β-CD包合物在制備過程中攪拌速度為120 r·min-1，水浴溫度為55 ℃，藥物與載體質(zhì)量比為1∶3。

2.3黃芩苷β-CD包合物的驗證 按照質(zhì)量比為1∶3稱取黃芩苷和β-CD，混合研磨后過80目篩，制備黃芩苷β-CD物理混合物。分別取黃芩苷、β-CD、黃芩苷與β-CD物理混合物以及黃芩苷β-CD包合物，采用FTIR進行光譜分析。測定條件：掃描范圍為2 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為1次，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 黃芩苷β-CD包合物的紅外光譜

β-CD和黃芩苷紅外光譜圖中可找到物理混合物的所有特征峰，說明物理混合物中β-CD與黃芩苷并未發(fā)生相互作用。相比于黃芩苷紅外光譜圖，黃芩苷β-CD包合物紅外光譜圖中1 500～1 700 cm-1范圍的苯環(huán)特征峰、1 220～1 300 cm-1范圍的苯環(huán)C=C伸縮振動的特征峰、1 000～1 100 cm-1范圍的苯環(huán)呼吸振動峰和 C-O-C 伸縮振動的特征峰發(fā)生位移且峰強度明顯減弱，表明黃芩苷與β-CD不是簡單的物理混合，而是發(fā)生了明顯的相互作用，證明包合物已經(jīng)形成。

2.4黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的制備 本研究采用薄膜-超聲分散法[15]制備黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體。按處方量稱取大豆卵磷脂、膽固醇和油酸，加入適量的氯仿溶解，移至茄形瓶中，固定到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在65 ℃水浴溫度中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿溶劑，在瓶內(nèi)壁最終形成均勻的半透明狀薄膜。向茄形瓶中加入一定量的黃芩苷β-CD包合物水溶液，充分振搖，在50 ℃水浴條件下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)水化薄膜，直至全部洗脫，得到黃芩苷β-CD包合物初懸液，水浴超聲0.5 h，依次經(jīng)0.22、0.10 μm微孔濾膜擠出，即得黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體。

2.5黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的性質(zhì)研究

2.5.1粒徑分布及Zeta電位測定 采用Nano ZS90納米粒度及Zeta電位儀測定黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的平均粒徑和Zeta電位。取適量黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體樣品溶液，加入超純水稀釋后放入樣品池測定粒徑，另取黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體樣品用超純水稀釋200倍后放入樣品池測定Zeta電位，每份樣品重復(fù)測定3次，取平均值。見圖2和圖3。

由圖2和圖3可知，黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體呈單峰分布，平均粒徑為(90.82±4.59) nm(n=3)，多分散性指數(shù)(PDI)為(0.212±0.007)(n=3)，說明黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的粒徑分布均勻；Zeta電位為(-41.8±1.9) mV(n=3)，說明黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體表面帶負(fù)電荷，電荷絕對值大于30 mV，說明粒子間存在較強的靜電排斥力，有利于黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

圖2 黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的粒徑分布

圖3 黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的Zeta電位分布

2.5.2透射電鏡觀察 取上述最佳工藝制備的黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體適量，滴到300目銅網(wǎng)格上，靜置2 min，用濾紙除去表面水分，晾干，滴加20 mg·mL-1磷鎢酸負(fù)染色10 min，晾干后用透射電子顯微鏡觀察黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的形態(tài)和大小，結(jié)果見圖4。

圖4 黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的透射電鏡圖

由圖4可知，黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體粒徑相對均一，外觀圓整，無黏連，粒徑大部分在100 nm左右，說明本研究制備的黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體質(zhì)量較好。

2.6體外藥物釋放研究 采用透析袋擴散法考察黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體在不同pH值介質(zhì)中的體外藥物釋放特性，將黃芩苷1.5 mg溶于無水乙醇中作為對照組，取黃芩苷β-CD包合物溶液以及黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體溶液作為實驗組(黃芩苷含量與對照組相同)。將對照組和實驗組樣品分別置于透析袋中，扎緊兩端，置于釋放介質(zhì)50 mL中，0～2 h釋放介質(zhì)為pH1.2鹽酸溶液(SDS質(zhì)量濃度為3.5 mg·mL-1)，2～12 h釋放介質(zhì)為pH6.8 PBS(SDS質(zhì)量濃度為3.5 mg·mL-1)，于37 ℃恒溫?fù)u床上以100 r·min-1勻速振搖，于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取釋放介質(zhì)1 mL，并補充等量釋放介質(zhì)，釋放介質(zhì)經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，續(xù)濾液采用HPLC法測定藥物含量，并計算累積釋放度，繪制釋放度-時間曲線，見圖5。

圖5 釋放度-時間曲線 (n=6)

由圖5可知，黃芩苷與黃芩苷β-CD包合物在2 h內(nèi)基本釋放完全，而黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體在12 h釋放度為82.3%，表明黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體具有良好的緩釋性能。

2.7體內(nèi)藥動學(xué)研究

2.7.1色譜條件 迪馬C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(含甲酸質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1)，梯度洗脫程序見表4，檢測波長為280 nm，流速為1 mL·min-1，柱溫為33 ℃，進樣量為10 μL。

表4 洗脫條件

2.7.2血漿中藥物的提取與處理 取待測大鼠血漿100 μL，置于1.5 mL EP管中，加入質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的黃芩苷溶液10 μL以及內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋60 s，加入適量乙酸乙酯進行萃取，渦旋5 min，以3 500 r·min-1離心15 min，吸取900 μL上清液，置于1.5 mL EP管中，37 ℃條件下氮氣吹干，殘余物用100 μL甲醇復(fù)溶，渦旋5 min，以15 000 r·min-1離心15 min，取上清液20 μL進樣分析。黃芩苷含量按照2.7.1項下色譜條件進樣測定，記錄黃芩苷峰面積(As)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)，計算As與Ai的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血藥質(zhì)量濃度。

2.7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 向不同質(zhì)量濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入0.2 mL大鼠空白血漿，制備成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的血漿樣品。血漿樣品按照2.7.2項下方法處理，藥物質(zhì)量濃度按照2.7.1項下色譜條件測定。記錄黃芩苷峰面積(As)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)，計算As與Ai的比值，以藥物質(zhì)量濃度(C)與該比值作線性回歸，得回歸方程為：As/Ai=275.31C-0.123(r=0.996 3)。

2.7.4精密度和提取回收率測定 取大鼠空白血漿200 μL，配制黃芩苷低、中、高3個質(zhì)量濃度的血漿樣品，血漿樣品按照2.7.2項下方法處理，考察方法精密度及提取回收率情況。結(jié)果顯示，血漿樣品測定方法精密度RSD≤5.9%，低、中、高3個質(zhì)量濃度血漿樣品中黃芩苷的絕對回收率在84.9%～94.1%之間，符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定，該方法可用于大鼠血漿中黃芩苷的含量測定。

2.7.5動物分組及給藥 取禁食12 h的Wistar大鼠，隨機分為A、B組，每組6只，其中A組作為實驗組，口服黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體樣品3 mL，B組作為對照組，口服黃芩苷混懸液1 mL。給藥后每組分別在 0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼眶取血，所得血樣置于肝素浸潤過的離心管中，以4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，-20 ℃保存，備用。血漿樣品按照2.7.2項下方法處理，血藥質(zhì)量濃度按照2.7.1項下色譜條件進行測定，計算樣品中黃芩苷的質(zhì)量濃度。

血藥質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)采用DAS 2.0 (Drug And Statistics for Windows)軟件進行擬合分析，根據(jù)赤池信息判據(jù)最小原則(AIC)確定最佳藥代動力學(xué)模型，并求得以下主要藥代動力學(xué)參數(shù)：血漿藥物消除半衰期(t1/2)、消除速率常數(shù)(Ke)、表觀分布容積(Vd)、血漿清除率(CL)、0～t時間點的藥-時曲線下面積(AUC(0～t))、0～∞時間點的藥-時曲線下面積(AUC(0～∞))、吸收速率常數(shù)(Ka)、血藥達峰質(zhì)量濃度(Cmax)、血藥達峰時間(tmax)，結(jié)果見表5。計算各時間點黃芩苷的血藥質(zhì)量濃度，繪制血藥質(zhì)量濃度-時間曲線，見圖6。

表5 給藥后黃芩苷主要藥代動力學(xué)參數(shù) (n=6)

圖6 黃芩苷的血藥質(zhì)量濃度-時間曲線 (n=6)

由表5可知，采用DAS 2.0軟件進行擬合分析，根據(jù)AIC值最小原則確定黃芩苷符合權(quán)重因子為1的一室模型。以黃芩苷成分為考察指標(biāo)，相比于黃芩苷混懸液，黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的t1/2明顯延長，其中t1/2、Cmax和AUC(0～∞)分別為黃芩苷混懸液的2.16、0.78、2.15倍。

根據(jù)表5AUC數(shù)據(jù)計算黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體對相同劑量的黃芩苷混懸液的相對生物利用度(Fr)，F(xiàn)r=AUC自制制劑÷AUC參比制劑×100%。

將黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體和黃芩苷混懸液的AUC(0～t)代入公式計算Fr：Fr=14.077÷7.635×100%=1.844%，表明將黃芩苷制備成β-CD包合物脂質(zhì)體后與混懸液相比，生物利用度有了較大的提高。

3 討論

黃芩是一種具有良好保肝護肝作用的中藥[16]，其主要活性成分黃芩苷也被證明對乙肝以及乙肝并發(fā)癥具有確切療效[17-18]。但黃芩苷水溶性差、生物利用度低，限制了其臨床應(yīng)用。因此采用制劑手段提高黃芩苷的生物利用度對黃芩苷的臨床應(yīng)用具有重要意義[19-20]。

本研究采用飽和水溶液法制備黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體，正交實驗結(jié)果表明，黃芩苷β-CD包合物的最佳工藝處方為：攪拌速度為120 r·min-1，水浴溫度為55 ℃，藥物與載體質(zhì)量比為1∶3。采用薄膜-超聲分散法制備黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體，平均粒徑為(90.82±4.59) nm，Zeta電位為(-41.8±1.9) mV。體外溶出實驗結(jié)果表明，黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體具有明顯的緩釋作用。大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究結(jié)果顯示，黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的AUC(0～∞)增加，Cmax降低，t1/2延長，分別為黃芩苷混懸液的2.15、0.78、2.16倍，說明將黃芩苷制備成β-CD包合物脂質(zhì)體后可提高黃芩苷的生物利用度，延長其半衰期。

綜上所述，本研究制備的黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體具有良好的緩釋效果，且明顯提高了黃芩苷的生物利用度，說明本研究所用劑型提高了黃芩苷的臨床應(yīng)用價值，也對黃芩苷新劑型的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。