邱愛麗，王 敏，謝 鵬，祁靜波

(1.唐山市協(xié)和醫(yī)院藥劑科，唐山 063000；2.唐山職業(yè)技術學院，唐山 063000)

依折麥布通過選擇性抑制腸道內(nèi)膽固醇轉運蛋白活性以達到降低膽固醇吸收的目的，是目前唯一的膽固醇吸收抑制劑[1-2]。依折麥布屬于生物藥劑學分類系統(tǒng)(BCS)Ⅱ類藥物，在水中極難溶解(約為2.3 μg·mL-1)，不利于藥物口服吸收[3-4]，另外依折麥布是P-糖蛋白(P-gp)的底物，口服吸收后在P-gp作用下外排，降低了口服生物利用度，增加了藥物生物變異性[5]，嚴重影響其治療效果。本研究將依折麥布制備成固體脂質(zhì)納米粒，同時加入D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)對依折麥布固體脂質(zhì)納米粒(EZE-SLNs)表面進行修飾，通過大鼠體內(nèi)藥動學評估藥物生物利用度，為依折麥布的口服新劑型研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 安捷倫1220型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；DF-101SZ型數(shù)顯轉速集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司)；Scientz-1200E型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；JEM-1400Flash型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；Malvern Zetasizer Nano-ZS型納米粒徑/電位分析儀(英國馬爾文公司)。

1.2試藥 依折麥布原料藥(無錫福祈制藥有限公司，批號20191214，質(zhì)量分數(shù)為99.5%)；伊曲康唑(中國食品藥品檢定研究院，批號100631-201402)；山崳酸甘油酯(Compritol-888 ATO，德國巴斯夫公司)；大豆磷脂(南京威爾藥業(yè)股份有限公司)；D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS，江西聯(lián)陸生物科技有限公司)；鹽酸和無水乙醇，均購自南京化學試劑股份有限公司；磷鎢酸鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)和十二烷基硫酸鈉，均購自巴斯夫新材料有限公司；pH6.8磷酸鹽緩沖液(PBS，自制)。

1.3動物 Wister種大白鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為(200±20) g，天津醫(yī)科大學提供，合格證號：SYXK(津)2019-004。

2 方法與結果

2.1EZE-SLNs與基于TPGS表面修飾的EZE-SLNs(TPGS-EZE-SLNs)的制備 通過前期的制備工藝篩選，采用乳化超聲-低溫固化法[6-7]制備EZE-SLNs。按照處方量稱取山崳酸甘油酯2 500 mg加入到乙醇10 mL中攪拌溶解，再稱取依折麥布原料藥250 mg加入到上述乙醇中攪拌溶解，呈透明狀液體，得到油相溶液；另稱取大豆磷脂1 000 mg加入到純化水50 mL中，加熱至75 ℃，攪拌分散形成乳白色液體，得到水相溶液；在3 000 r·min-1磁力攪拌下，將上述油相溶液通過注射器滴加到水相溶液中，形成乳白色液體，減壓蒸發(fā)除去乙醇，加水定容至50 mL；將超聲探頭置于該溶液中進行超聲處理，超聲功率為200 W，超聲10 s，間歇5 s，持續(xù)超聲5 min，超聲結束后立即將溶液置于冰水浴中冷卻，即得到EZE-SLNs。除在水相中加入TPGS 200 mg外，TPGS-EZE-SLNs的制備工藝和處方中各成分的用量與EZE-SLNs均相同。將制備得到的EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs置于4 ℃冰箱中冷藏，備用。

2.2制劑性質(zhì)表征

2.2.1粒徑分布/Zeta電位測定 使用Malvern Zetasizer Nano-ZS型納米粒徑/電位分析儀測量EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs的粒徑分布、多聚分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位。樣品的制備方法：取EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs各200 μL，分別置于直徑為1 cm的石英比色杯中，加入去離子水3 mL稀釋，輕輕振搖，置于激光粒度測定儀中檢測，檢測波長為635 nm，入射角為90°，環(huán)境溫度為25 ℃，每個樣品平行測定3次，取平均值，結果見表1。

表1 制劑性質(zhì)檢測結果

EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs的粒徑大小相近，均在100 nm左右，文獻報道[8-9]，納米粒子在100 nm左右更容易透過腸道細胞進入體內(nèi)；Zeta電位是評價膠體分散體穩(wěn)定性的重要指標，其絕對值越大表明該體系越穩(wěn)定，固體脂質(zhì)納米粒能夠維持穩(wěn)定性需要Zeta電位絕對值大于30 mV，只有達到該電位絕對值，擴散層才具有足夠的厚度避免微粒之間聚集[10]。本研究制備的2種固體脂質(zhì)納米粒Zeta電位絕對值均大于30 mV，且TPGS-EZE-SLNs的Zeta電位絕對值更大，測定的電位值能夠間接表明EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs物理穩(wěn)定性良好，不易發(fā)生聚集和沉淀。

2.2.2微觀形態(tài)觀察 通過透射電子顯微鏡觀察EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs的表面形態(tài)。分別取EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs各1滴，滴加到碳涂層的銅網(wǎng)上，再滴加蒸餾水稀釋，揮干水分，滴加質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的磷鎢酸溶液負染色，再次揮干水分，在透射電鏡下觀察2個樣品的微觀形態(tài)。見圖1。

圖1 EZE-SLNs(A)和TPGS-EZE-SLNs(B)的透射電鏡照片

由圖1可知，EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs均呈球形分布，邊界清晰，無藥物結晶析出，粒徑大部分在50～100 nm之間。

2.3溶出度比較 載藥固體脂質(zhì)納米?？诜M入胃腸道后通過內(nèi)吞作用進入體循環(huán)，因此，需要模擬體內(nèi)環(huán)境考察固體脂質(zhì)納米粒在pH值為1.2和pH值為6.8條件下的體外藥物釋放情況，以確定納米粒在被吸收進入體循環(huán)之前藥物從納米載體中釋放到釋放介質(zhì)中的程度。采用動態(tài)透析法比較EZE-SLNs、TPGS-EZE-SLNs和EZE混懸液的藥物釋放度。選擇截留相對分子質(zhì)量為10 kDa的透析膜，將2種固體脂質(zhì)納米粒樣品溶液及EZE混懸液(藥物分散到PVP K30溶液中)置于透析袋中，兩端系緊，藥物含量均為10 mg，釋放介質(zhì)在前2 h選擇pH值為1.2的鹽酸溶液(含十二烷基硫酸鈉質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1)，2 h后選擇pH值為6.8的PBS(含十二烷基硫酸鈉質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1)，介質(zhì)體積均為500 mL，水浴溫度為37 ℃，攪拌速度為100 r·min-1，在預定的時間間隔(0、0.5、1、2、4、6、8、12 h)取樣，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液適當稀釋后使用HPLC法進行分析。每個時間點取樣后立即將相同體積的空白釋放介質(zhì)[溫度保持在(37±0.5) ℃]補加到溶出杯中。釋放曲線見圖2。

圖2 EZE-SLNs、TPGS-EZE-SLNs和EZE混懸液的體外藥物釋放曲線

由圖2可知，EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs前2 h在pH值為1.2的鹽酸中的釋放量基本一致，約有25%的藥物從載藥固體脂質(zhì)納米粒中釋放出來，隨后置于pH值為6.8 PBS中，在12 h約有80%的藥物釋放；EZE混懸液藥物釋放較為緩慢，前2 h在pH值為1.2的鹽酸中僅有約5%的藥物釋放，在pH值為6.8的PBS中12 h藥物釋放量也僅僅達到約18%。實驗結果表明，與EZE混懸液相比，EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs均能提高藥物的釋放度，有望改善藥物的生物利用度。

2.4模擬人體生理環(huán)境穩(wěn)定性考察 固體脂質(zhì)納米粒在胃腸道內(nèi)滯留一段時間才能被吸收進入體內(nèi)，因此，胃腸道中的液體環(huán)境會對納米粒的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響，進而阻礙藥物吸收[11]。因此本研究考察EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在模擬人工胃液(SGF)或模擬人工腸液(SIF)中的粒徑及Zeta電位變化，結果見圖3和圖4。

圖3 EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在SGF中的粒徑及Zeta電位變化

圖4 EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在SIF中的粒徑及Zeta電位變化

由圖3和圖4可知，EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在SGF中前30 min粒徑呈增加趨勢，平均直徑均達到200～300 nm，隨后粒徑不再增加，測得固體脂質(zhì)納米粒的Zeta電位為-8～-10 mV，Zeta電位絕對值降低，導致納米粒之間發(fā)生聚集，粒徑增大。相反，EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在SIF中的粒徑基本保持不變，測得Zeta電位顯示與初始值相近，為-35～-38 mV。

2.5藥動學研究

2.5.1色譜條件 色譜柱為安捷倫Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為水-乙腈(30∶70)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL；檢測波長為232 nm[12]。

2.5.2血漿處理 大鼠眼眶取血，用內(nèi)壁涂有肝素鈉的圓底離心管收集血液，以4 000 r·min-1離心10 min，收集血漿，取大鼠血漿150 μL，置于尖底離心管中，加入質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的伊曲康唑甲醇溶液10 μL作為內(nèi)標，渦旋混合5 min，加入乙腈200 μL，再渦旋混合，沉淀血漿蛋白，以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL，按照2.5.1項下色譜條件檢測藥物含量，計算藥物質(zhì)量濃度。

2.5.3標準曲線 精密稱取依折麥布對照品10.0 mg，置于100 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋定容，搖勻，得依折麥布對照品儲備液(含依折麥布為100 mg·L-1)。將上述對照品儲備液稀釋成依折麥布質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 mg·L-1,得系列質(zhì)量濃度的依折麥布甲醇對照品溶液。取空白大鼠血漿150 μL，置于尖底離心管中，精密加入上述系列質(zhì)量濃度的依折麥布甲醇對照品溶液10 μL，配制成含有依折麥布質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg·L-1的血漿樣品，渦旋混合5 min，再按照2.5.2項下血漿處理方法操作，按照2.5.1項下色譜條件檢測藥物含量，以峰面積(A)為縱坐標、藥物質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，采用加權最小二乘法進行回歸，得方程：A=63.564C-1.316(r=0.999 2)，線性關系良好。

2.5.4精密度及提取回收率 按照2.5.3項下標準曲線方法，取150 μL空白大鼠血漿，置于尖底離心管中，精密加入10 μL系列質(zhì)量濃度的依折麥布甲醇對照品溶液，配制成含有依折麥布質(zhì)量濃度分別為0.05、0.5、5.0 mg·L-1的溶液，渦旋混合5 min，再按照2.5.2項下血漿處理方法操作，按照2.5.1項下色譜條件檢測藥物含量，考察方法精密度和提取回收率。結果顯示，上述低、中和高3種藥物質(zhì)量濃度的提取回收率分別為92.1%、95.2%、97.2%，精密度RSD值為3.9%，說明本方法提取回收率較高，精密度較好，符合方法要求。

2.5.5藥動學實驗 取18只體質(zhì)量為180～220 g的Wistar大鼠，雌雄各半，隨機分為A、B和C 3組，每組6只，實驗前將大鼠禁食12 h，自由飲水。A組大鼠灌胃給予EZE混懸液(藥物分散到PVP K30溶液中)，B組大鼠灌胃給予EZE-SLNs，C組大鼠灌胃給予TPGS-EZE-SLNs，給藥劑量均為5 mg·kg-1，在給藥后0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h時間點采用毛細管眼眶取血，每次收集約0.5 mL血樣，置于內(nèi)壁涂有肝素鈉的尖底離心管中，以4 000 r·min- 1離心10 min，取上層血漿于-20 ℃冷凍保存。血漿樣品按照2.5.2項下血漿處理方法操作，按照2.5.1項下色譜條件檢測藥物含量，使用DAS 2.0藥動學分析軟件計算以下藥動學參數(shù)：達峰時間(tmax)、達峰質(zhì)量濃度(Cmax)、藥時曲線下面積(AUC0～∞)、半衰期(t1/2)和消除速率(CL)，并采用t檢驗分析不同給藥組之間的差異性，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

表2 大鼠藥動學參數(shù)

圖5 平均血藥質(zhì)量濃度-時間曲線

3 討論

為了增加藥物溶解度以及提高生物利用度，研究人員嘗試將依折麥布制備成固體分散體[13]、介孔二氧化硅載藥[14]和自乳化釋藥系統(tǒng)[15-16]等新型給藥系統(tǒng)。固體脂質(zhì)納米粒是20世紀90年代開始研究的較為成熟的一種納米藥物給藥系統(tǒng)，是由生物相容性良好的天然或合成脂質(zhì)和表面活性劑構成，藥物包裹在納米粒的脂質(zhì)內(nèi)部或吸附在納米粒表面，SLNs屬于納米膠態(tài)分散體系，粒徑在50～1 000 nm之間，能夠顯著提高藥物的溶解度和溶出速率，是極具開發(fā)潛力的納米粒給藥系統(tǒng)[17-18]。TPGS屬于非離子表面活性劑，文獻報道[19-20]，TPGS能夠抑制P-gp對底物的外排作用，改變生物膜的流動性，提高藥物的生物利用度，作為一種安全的藥用輔料已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于藥品中。

由大鼠體內(nèi)藥動學研究結果可知，與EZE混懸劑組相比，EZE-SLNs組和TPGS-EZE-SLNs組的AUC0～∞顯著增加，分別是EZE混懸劑組的1.76倍和2.08倍，說明大鼠口服EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs可以顯著提高藥物的生物利用度；EZE-SLNs組和TPGS-EZE-SLNs組的Cmax分別是EZE混懸劑組的1.44倍和1.81倍，2種固體脂質(zhì)納米粒均提高了藥物的Cmax，這可歸因于依折麥布制備成固體脂質(zhì)納米粒后，粒徑急劇減小，比表面積急劇增大，改善了藥物的溶解性，在進入體內(nèi)后能夠快速、充分地被十二指腸及小腸上皮細胞吸收。此外，TPGS-EZE-SLNs組的AUC0～∞與Cmax分別是EZE-SLNs組的1.19倍和1.26倍，說明TPGS-EZE-SLNs提高藥物生物利用度更顯著，這歸因于TPGS-EZE-SLNs處方中的TPGS抑制了腸上皮細胞膜中的P-gp的活性，降低了對依折麥布的外排作用，提高了藥物的生物利用度。