龍凱花，王春柳，李 曄*，張 紅，劉 洋，孫婷婷，宗時(shí)宇

(1.西安培華學(xué)院，西安 710125；2.陜西省中醫(yī)藥研究院， 西安 710003)

穿心蓮內(nèi)酯為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮(Andrographispaniculata)全草或葉中的主要藥效成分之一，具有清熱解毒和消炎止痛的作用[1-2]，臨床主治急性痢疾、胃腸炎、上呼吸道感染和感冒發(fā)燒等[3]，但由于穿心蓮內(nèi)酯味極苦，難溶于水，口服生物利用度低，臨床應(yīng)用受到限制[4]。前期通過(guò)穿心蓮內(nèi)酯油水分布系數(shù)(P)和溶解度實(shí)驗(yàn)[5]，測(cè)得其P值為(35.64±0.30)，lgP為1.55，當(dāng)-1.0

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Sartorius BP211D 型電子分析天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯天平有限公司)；HJ-6型多頭磁力加熱攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)；ZEN3600型激光粒度儀(英國(guó)Marloven公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；FOEA26810D型超純水系統(tǒng)(法國(guó)Millipore公司)；KQ-250DE型超聲波清洗器(200 W，40 KHz；昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 穿心蓮內(nèi)酯原料藥(西安天一生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%，批號(hào) TYM140216)；穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.7%，批號(hào)110797-201108)；油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M 1944 CS，批號(hào)201006)和二乙二醇單乙基醚(TranscutoL HP，批號(hào)145177)，均購(gòu)自法國(guó)嘉法獅公司；聚乙二醇硬脂酸酯(Kolliphor?HS 15，德國(guó)巴斯夫公司，批號(hào)29749816K0)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1穿心蓮內(nèi)酯自微乳的制備 精密稱定穿心蓮內(nèi)酯原料藥、乳化劑、助乳化劑、油相，分別混合乳化劑和助乳化劑、油相和穿心蓮內(nèi)酯，置于37 ℃水浴中，將含藥的油相緩慢加入混勻的混合乳化劑中，中速磁力攪拌10 min至澄清透明，即得穿心蓮內(nèi)酯自微乳(空白自微乳處方中除了不加穿心蓮內(nèi)酯外，其余步驟不變)。

2.2處方的初步篩選

2.2.1基質(zhì)種類的篩選 按照2.1項(xiàng)下空白自微乳的制備方法，將不同比例配伍的乳化劑及助乳化劑混合，滴入不同油相，根據(jù)外觀及滴入水中的現(xiàn)象，確定聚乙二醇硬脂酸酯為乳化劑，二乙二醇單乙基醚為助乳化劑，油酸聚乙二醇甘油酯為油相。其余滴入水中均出現(xiàn)乳白色溶液，無(wú)法形成穩(wěn)定的自微乳體系。

2.2.2基質(zhì)用量范圍的篩選 將乳化劑聚乙二醇硬脂酸酯與助乳化劑二乙二醇單乙基醚振蕩混勻，兩者質(zhì)量比(Km)為3∶2、2∶1、1∶1、1∶2、2∶3，混勻后分別與油相油酸聚乙二醇甘油酯按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例振蕩混勻，滴水觀察。以Km、水和油相分別為一角，繪制偽三元相圖。見(jiàn)圖1。通過(guò)觀察是否澄清透明及加入水后是否形成淡藍(lán)色乳光確定微乳區(qū)界限，形成自微乳區(qū)域。

由圖1可知，Km在1∶2、2∶3的范圍變化時(shí)，無(wú)法形成澄清透明淡藍(lán)色乳光的自微乳溶液，緩慢加水后均形成帶淡藍(lán)色乳光的半渾濁溶液；Km在1∶1、3∶2、2∶1范圍變化時(shí)，可以形成澄清透明淡藍(lán)色乳光的自微乳溶液，且Km在3∶2、2∶1時(shí)形成的自微乳大于Km在1∶1時(shí)形成的自微乳區(qū)域。

圖1 不同處方比例的偽三元相圖

2.3考察指標(biāo) 經(jīng)單因素考察，對(duì)粒徑、Zeta電位、多分散性指數(shù)(PDI)和飽和載藥量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同水平時(shí)，Zeta電位差異較小，粒徑、PDI、飽和載藥量各水平之間差異較顯著。故選擇粒徑、PDI、飽和載藥量為Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方的考察指標(biāo)。

2.3.1粒徑(Y1)與PDI(Y2)的測(cè)定 取2.1項(xiàng)下制備的穿心蓮內(nèi)酯自微乳適量，用50倍量的純水稀釋，攪拌分散均勻，采用激光粒度儀分別測(cè)定粒徑與PDI。

2.3.2飽和載藥量(Y3) 取2.1項(xiàng)下制備的穿心蓮內(nèi)酯自微乳適量，加入過(guò)量穿心蓮內(nèi)酯原料藥，密封超聲30 min后在37 ℃水浴中振蕩24 h，以4 000 r·min-1離心15 min，取上清液并稀釋，用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯的含量，即飽和載藥量。

2.4Box-Behnken優(yōu)化自微乳處方

2.4.1Box-Behnken 以乳化劑聚乙二醇硬脂酸酯的含量(A)、助乳化劑二乙二醇單乙基醚的含量(B)和油相聚乙二醇甘油酯的含量(C)為自變量，各因素設(shè)置三水平，用-1、0、+1表示，因素及水平見(jiàn)表1；以粒徑(Y1)、PDI(Y2)、飽和載藥量(Y3)為考察指標(biāo)，采用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行三因素、三水平設(shè)計(jì)， 每個(gè)水平平行測(cè)定3次，求平均值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素與水平

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.2模型擬合 采用Design-Expert 8.06，以粒徑、PDI、飽和載藥量3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)乳化劑、助乳化劑和油相3個(gè)因素進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，方程擬合為：

Y1=20.92-0.48A-0.72B+1.79C+0.60AB-0.083AC+2.97BC-3.59A2+3.08B2+2.60C2(P=0.004 4，r1=0.919 3)

Y2=0.16+0.058A+0.033B-0.019C+0.10AB+0.021AC+9.97×10-3BC-0.015A2+0.035B2-0.029C2(P<0.000 1，r2=0.982 4)

Y3=15.19-1.82A-0.43B+0.084C-0.42AB+1.69AC-0.42BC-1.36A2+0.79B2-0.58C2(P=0.001 2，r3=0.945 2)

由上述結(jié)果可知，評(píng)價(jià)指標(biāo)Y1、Y2、Y3的r值均大于0.90，顯著水平P值均小于0.01，說(shuō)明擬合良好，差異具有高度顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[19]。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，所建模型經(jīng)檢驗(yàn)具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，說(shuō)明模型與實(shí)際情況吻合良好；模型失擬項(xiàng)檢驗(yàn)無(wú)顯著性(P=0.653 9)，說(shuō)明未知因素對(duì)模型擬合結(jié)果干擾小，模型誤差較小[20]。

表3 方差分析結(jié)果

2.4.3效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 采用Design-Expert 8.06軟件繪制三維效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖2。各處方乳化后粒徑均小于40 nm，且處方加水后均能形成澄清透明、淡藍(lán)色乳光的溶液，說(shuō)明各處方乳化劑、助乳化劑和油相的選擇種類合適，比例適當(dāng)。

由圖2可知，隨著Km值的增大，粒徑先增大后減小，PDI增大，飽和載藥量減小，由此可知，Km值是影響自微乳的重要因素。自微乳處方優(yōu)化的原則是粒徑小(穩(wěn)定性高且容易吸收)、PDI小(粒徑均一)、飽和載藥量大，結(jié)合圖1Km值在1∶1、3∶2、2∶1范圍變化時(shí)，可以形成澄清透明、淡藍(lán)色乳光的自微乳溶液，綜合考慮Km值確定為1∶1，通過(guò)Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行分析，最終得出的最優(yōu)處方為：乳化劑聚乙二醇硬脂酸酯與助乳化劑二乙二醇單乙基醚Km為1∶1，乳化劑和助乳化劑總量與油相聚乙二醇甘油酯的比例為9∶1。

圖2 3個(gè)因素對(duì)粒徑、PDI、飽和載藥量的三維效應(yīng)面影響

2.4.4處方預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最優(yōu)處方比例，按照2.1項(xiàng)下方法制備3批樣品，觀察外觀并將實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。測(cè)定制備的自微乳溶液Zeta電位，考察是否穩(wěn)定。見(jiàn)圖3。

圖3 自微乳的粒徑分布、PDI和電位

表4 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方再驗(yàn)證

觀察3批自微乳外觀，均呈澄清透明、淡藍(lán)色乳光的溶液。通過(guò)比較實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值，粒徑、PDI和飽和載藥量的偏差小于7.0%，說(shuō)明建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)效果良好，測(cè)得自微乳粒徑為39.04 nm，PDI為0.15，Zeta電位為-29.80 mV，說(shuō)明穩(wěn)定性好。

2.5自微乳制備工藝考察

2.5.1混合方法選擇 分別對(duì)3種常用的混合方法：渦旋振蕩、超聲混合、磁力攪拌進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)超聲混合時(shí)間較長(zhǎng)且不宜混勻；渦旋振蕩時(shí)間較短但適合制備少量樣品；而磁力攪拌可以滿足大量樣品制備的要求，混合充分且時(shí)間短。

2.5.2攪拌速度考察 取優(yōu)化的穿心蓮內(nèi)酯自微乳溶液適量，37 ℃下以低速、中速和快速分別磁力攪拌10 min，測(cè)定乳化時(shí)間，低速、中速、快速攪拌自乳化時(shí)間分別為(78±8)、(59±5)、(47±4) s。雖然乳化時(shí)間越短越好，但是通過(guò)測(cè)定3種速度制備的自微乳粒徑，發(fā)現(xiàn)快速攪拌制備的自微乳粒徑不均一，因此選擇中速攪拌。

2.5.3攪拌時(shí)間考察 取優(yōu)化的穿心蓮內(nèi)酯自微乳溶液適量，37 ℃下中速磁力攪拌10、20、30 min，測(cè)定粒徑大小分別為(38.58±0.73)、(36.25±0.21)、(38.01±1.45) nm。時(shí)間大于10 min時(shí)，粒徑大小變化較小，10 min時(shí)粒徑大小均一且較小，故確定攪拌時(shí)間為10 min最佳。

綜上所述，最終確定的自微乳制備工藝為:按處方比例稱取穿心蓮內(nèi)酯、油相、乳化劑和助乳化劑，在(37±1) ℃下，將含藥的油相緩慢加入混勻的混合乳化劑中，中速磁力攪拌10 min至澄清透明，即得澄清透明的穿心蓮內(nèi)酯自微乳。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)偽三元相圖確定能形成自微乳的乳化劑和助乳化劑比例，在5個(gè)比例中，Km在1∶2、2∶3范圍變化時(shí)，緩慢加水后形成淡藍(lán)色乳光的半渾濁溶液；Km在1∶1、3∶2、2∶1范圍變化時(shí)，緩慢加水后可形成淡藍(lán)色乳光的澄清透明溶液，且Km越大，形成的自微乳區(qū)域越大，為Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化自微乳處方提供乳化劑與助乳化劑的比例范圍。

由圖2可知，當(dāng)乳化劑用量不變時(shí)，隨著油相用量的增大，粒徑增大，飽和載藥量增大；當(dāng)助乳化劑用量不變時(shí)，隨著油相用量的增大，粒徑增大，飽和載藥量先增大后減小(但變化趨勢(shì)不明顯)。由此可知，油相的用量對(duì)粒徑及飽和載藥量的影響較大，油相用量減小有助于減小粒徑，但可能會(huì)引起飽和載藥量的降低，所以通過(guò)Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化穿心蓮內(nèi)酯自微乳處方，根據(jù)該方法建立的數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面圖，充分考慮了乳化劑、助乳化劑、油相三因素之間的交互作用，從而方便、直觀、科學(xué)地確定最佳處方為：聚乙二醇硬脂酸酯為乳化劑，二乙二醇單乙基醚為助乳化劑，油酸聚乙二醇甘油酯為油相，Km為1∶1，乳化劑和助乳化劑總量與油相的比例為9∶1，穿心蓮內(nèi)酯15.87 mg。通過(guò)驗(yàn)證，預(yù)測(cè)性良好。

在Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方再驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，PDI的偏差比較大，為6.25%，是因?yàn)镻DI本身較小，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一般小于0.4，所以容易在實(shí)驗(yàn)或驗(yàn)證處方的過(guò)程中出現(xiàn)偏差，可以考慮在后續(xù)的自微乳處方篩選中舍棄該指標(biāo)，以實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)的目標(biāo)。

綜合偽三元相圖法、Box-Behnken效應(yīng)面法及制備工藝考察，最終確定了穿心蓮內(nèi)酯自微乳的制備方法，通過(guò)平行樣品的外觀、粒徑、Zeta電位和PDI等考察，表明制備方法穩(wěn)定、可靠、便捷，但其體內(nèi)釋藥行為有待進(jìn)一步研究。