霍 蘇，崔鶴蓉，顧昱昊，戴子琦，王亞欣，婁邵巖，戚 蕊，項(xiàng)嘉偉，王鵬龍，馬 濤，雷海民

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

血小板聚集是指血小板具有相互黏附的特性，血小板膜上的糖蛋白黏附在纖維蛋白原，纖維蛋白原再黏附在另一側(cè)的血小板上，通過纖維蛋白原血小板就互相聚集在一起[1]。血小板聚集性增高，是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，引起了血小板活化、黏附、聚集，血小板聚集率高會(huì)引起血液黏稠，導(dǎo)致血管堵塞，形成血栓，而血栓的形成是動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌梗死、腦血栓等心血管疾病主要的發(fā)病機(jī)制。對(duì)于原發(fā)性血小板聚集率升高性疾病，臨床上常用抗血小板聚集藥物如環(huán)氧合酶抑制劑阿司匹林、糖蛋白Ⅱb/Ⅲa (GPⅡb/Ⅲa)抑制劑ReoPro和P2Y12抑制劑氯吡格雷，治療心血管疾病[2]效果顯著。然而，考慮到耐藥的高頻率和對(duì)患者的胃腸道不良反應(yīng)，不建議長期使用這些藥物。此外，長期使用多種抗血小板藥物可能會(huì)增加毒性。在此基礎(chǔ)上，需要開發(fā)新的抗血小板藥物，以提高療效和減少不良反應(yīng)。目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，天然來源的新的活性物質(zhì)以及植物中的某些化學(xué)物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗血小板聚集作用。

丹參是我國傳統(tǒng)的活血化瘀中藥之一，療效顯著，不良反應(yīng)報(bào)道較少[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參具有增加冠狀動(dòng)脈流量、改善微循環(huán)、抗血小板聚集等多種藥理作用[5-11]。臨床研究表明，對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的治療和預(yù)防具有重要意義。丹參含有多種化學(xué)成分，主要分為兩大類:一是二萜醌類的脂溶性成分，以丹參酮類二萜為主，如丹參酮類和隱丹參酮類；二是酚酸的水溶性成分，如丹參素、丹參酚酸類化合物。本文主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究丹參抑制血小板聚集的作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[12-13]是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，結(jié)合藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)藥物作用的綜合網(wǎng)絡(luò)分析，特別適合對(duì)具有多組分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制特征的中藥進(jìn)行研究。據(jù)此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出丹參抗血小板聚集的潛在有效成分及其作用靶點(diǎn)，對(duì)其機(jī)制進(jìn)行分析，為丹參臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1丹參活性成分篩選及其靶點(diǎn)的獲取 通過TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)對(duì)中藥中化學(xué)成分的吸收、分布、代謝進(jìn)行預(yù)測。在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索“丹參”，共收集到202種化合物，再通過口服生物利用度(OB)和藥物相似性(DL)對(duì)化合物的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行篩選，其中，OB是指藥物經(jīng)口服給藥后被機(jī)體吸收進(jìn)入血液循環(huán)的相對(duì)量和速率；DL反映化合物中的特定功能基團(tuán)與已知藥物的相似性，二者對(duì)中藥化學(xué)成分活性的評(píng)估具有重要意義。本研究根據(jù)以往研究，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為篩選高活性關(guān)鍵化合物的閾值。

1.2丹參有效成分靶點(diǎn)規(guī)范 由于丹參有效成分靶點(diǎn)來源不統(tǒng)一造成丹參靶點(diǎn)名稱不規(guī)范，因此需要對(duì)篩選得到的靶蛋白和基因信息進(jìn)行校正。將所有的靶點(diǎn)在Uniport(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，將物種設(shè)置為人，獲得靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的Uniport名稱。

1.3疾病靶點(diǎn)的獲取與交集靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫輸入關(guān)鍵詞“Platelet aggregation”獲得血小板聚集的蛋白靶點(diǎn)基因并與1.1篩選出的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析，獲取交集靶點(diǎn)。

1.4“藥物-疾病-靶點(diǎn)”交互網(wǎng)路建立 為了闡述丹參治療血小板聚集的有效機(jī)制，將丹參與肝纖維化的共同靶點(diǎn)與關(guān)鍵化合物的關(guān)系使用Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行繪制，在網(wǎng)絡(luò)圖中，關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)以節(jié)點(diǎn)表示，節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系以邊來表示。

1.5蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)建立 考慮到靶點(diǎn)之間的相互作用對(duì)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)進(jìn)行相互作用分析，將丹參-肝纖維化共有的89個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨tring(https://string-db.org/cgi/input.pl) 數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，研究物種選擇人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并篩選評(píng)分≥0.9 的蛋白關(guān)系，隱藏離散點(diǎn)，藍(lán)色連線表示基因共進(jìn)化證據(jù)，紅色連線表示基因融合證據(jù)，黃色連線表示文本挖掘證據(jù)等，下載 PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選排名前30的PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.6基因本體(GO)富集分析 將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)富集，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選。使用R 3.6.3軟件，安裝并引用clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.7京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正值P≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選。使用R 3.6.3，安裝并引用ClusterProfiler包后，繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.8分子對(duì)接 丹參中的潛在藥效成分和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)分別從Pubchem數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載。使用AutoDockTools1.5.6對(duì)潛在藥效成分和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫，轉(zhuǎn)換成Pdbqt格式。由Autodock Vina 1.1.2軟件完成分子對(duì)接分析。最后利用PyMol 1.8對(duì)蛋白與分子結(jié)合的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1藥物化學(xué)成分及藥物靶點(diǎn)篩選 利用TCMSP對(duì)丹參中的202種已知成分進(jìn)行篩選，通過OB≥30%和DL≥0.18篩選出丹參中65種高活性關(guān)鍵化合物，包括丹參酮、紫杉醇、丹參醛、丹酚等。見表1。其中65種有效成分對(duì)應(yīng)935個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，有680個(gè)有效相關(guān)靶蛋白和109個(gè)靶基因。

表1 丹參的活性成分信息

2.2疾病靶點(diǎn) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢上述65種關(guān)鍵化合物的靶點(diǎn)信息，通過Uniprot進(jìn)行基因ID的注釋得到丹參中基因ID。在GeneCard中獲取血小板聚集相關(guān)靶點(diǎn)5 394個(gè)，將藥物與疾病的靶點(diǎn)基因?qū)?Excel，映射得到丹參-血小板聚集的共同靶點(diǎn)，見表2。并通過 R 語言繪制韋恩圖，藥物與疾病共有靶點(diǎn)84個(gè)，注釋基因82個(gè)。

表1(續(xù)) 丹參的活性成分信息

表2 丹參-血小板聚集共有靶點(diǎn)

2.3“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系 將上述篩選獲得的藥物活性成分、潛在治療靶點(diǎn)基因、藥物、疾病名稱導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，設(shè)置節(jié)點(diǎn)與邊線將其相互關(guān)系繪制成可視化“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。由圖1可知，網(wǎng)絡(luò)共涉及節(jié)點(diǎn)135個(gè)，其中網(wǎng)絡(luò)圖中黃色部分為中藥成分靶點(diǎn)，藍(lán)色菱形為中藥成分，紫色矩形為中藥即丹參，紅色為作用機(jī)制即血小板聚集。邊線表示化合物、靶點(diǎn)、藥物、疾病之間存在相關(guān)性。通過插件cytoNCA按照度和緊密度2種屬性分別取排序靠前的成分或靶點(diǎn)。成分有：二氫丹參內(nèi)酯；異隱丹參酮；丹參醌新酮Ⅰ；1，2，5，6-四氫丹參酮和丹參螺縮酮內(nèi)酯等。靶點(diǎn)有β2腎上腺素能受體(ADRB2)、人類重組蛋白(OPRM1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1 (PTGS1)、碳酸酐酶Ⅱ(CA2)、乙酰膽堿受體亞型3(CHRM3)和絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)等。

圖1 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將潛在治療靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，研究物種選擇人類，篩選評(píng)分>0.9的蛋白關(guān)系，并完成PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。由圖2可知，該網(wǎng)絡(luò)包含270條邊，71個(gè)節(jié)點(diǎn)。其中評(píng)分≥0.99的相互作用蛋白為：絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶-核內(nèi)癌基因(AKT1-GSK3B)、重組蛋白-核蛋白轉(zhuǎn)錄因子(JUN-FOS)、內(nèi)皮素 1(EDN1)、重組蛋白-內(nèi)皮素受體A型基因(EDN1-EDNRA)、依賴蛋白激酶抑制劑1-細(xì)胞周期素D1(CDKN1A-CCND1)、依賴蛋白激酶抑制劑1-腫瘤抑制基因(CDKN1A-TP53)、依賴蛋白激酶抑制劑1-增殖細(xì)胞抗原(CDKN1A-PCNA)、腫瘤抑制基因-鼠雙微染色體2(TP53-MDM2)、依賴蛋白激酶抑制劑-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2(CDKN1A-CCNA2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(AKT1-NOS3)、蛋白酪氨酸磷酸酶1-胰島素受體(PTPN1-INSR)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2-細(xì)胞周期蛋白B1(CCNA2-CCNB1)、表皮生長因子受體-信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(EGFR-STAT3)、白細(xì)胞介素6-信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(IL-6-STAT3)、白細(xì)胞介素10-腫瘤壞死因子(IL-10-TNF)、白細(xì)胞介素10-白細(xì)胞介素6(IL-10-IL-6)、核蛋白類調(diào)控基因-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1C(MYC-CDKN1A)、白細(xì)胞介素6-白細(xì)胞介素4(IL-6-IL-4)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A(AKT1-CDKN1A)、重組蛋白-絲裂原活化蛋白激酶14(JUN-MAPK14)、白細(xì)胞介素10-信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(IL-10-STAT3)、酪氨酸激酶受體-信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(VEGFA-STAT3)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(AKT1-STAT3)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-胱天蛋白酶9(AKT1-CASP9)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-腫瘤抑制基因(AKT1-TP53)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A-細(xì)胞周期蛋白B1(CDKN1A-CCNB1)、酪氨酸激酶受體-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(VEGFA-NOS3)、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3-CCND1)、腫瘤壞死因子-核因子κB抑制蛋白α抗體(TNF-NFKBIA)、核蛋白類調(diào)控基因-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(MYC-AKT1)、核蛋白類調(diào)控基因-重組蛋白(MYC-JUN)、腫瘤壞死因子-白細(xì)胞介素4(TNF-IL-4)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-鼠雙微染色體(AKT1-MDM2)、腫瘤抑制基因(JUN-TP53)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-雌激素受體1(AKT1-ESR1)、細(xì)胞周期蛋白A2-腫瘤抑制基因(CCNA2-TP53)、絲氨酸/蘇氨酸激酶-細(xì)胞周期蛋白D1(GSK3B-CCND1)、核內(nèi)癌基因-信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(MYC-STAT3)、雌激素受體1-細(xì)胞周期蛋白D1 (ESR1-CCND1)、腫瘤抑制基因-絲裂原活化蛋白激酶14(TP53-MAPK14)。這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中非常重要。通過計(jì)算每個(gè)基因的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)量，找出前25個(gè)PPI核心，即：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(STAT3)、腫瘤抑制基因(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、腫瘤壞死因子(TNF)、人內(nèi)皮素1(EDN1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、細(xì)胞周期蛋白D1 (CCND1)、表皮生長因子受體(EGFR)、雌激素受體(ESR1)、酪氨酸激酶受體(VEGFA)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A(CDKN1A)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、糖皮質(zhì)激素受體(NR3C1)、毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2(CHRM2)、內(nèi)皮素受體A型基因(EDNRA)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、雄激素受體(AR)、半胱天冬蛋白酶(CASP3)、5羥色胺受體2A(HTR2A)、阿片樣物質(zhì)受體(OPRD1)、阿片受體(OPRM1)、α1A腎上腺素能受體(ADRA1A)和α1D腎上腺素能受體(ADRA1D)、腎上腺素能受體基因(ADRA2A)。

圖2 丹參潛在治療靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5GO富集分析結(jié)果 將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO 的BP、MF、CC富集，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，共富集到1 789條BP，113項(xiàng)分子功能相關(guān)，61項(xiàng)細(xì)胞組成相關(guān)。根據(jù)P值由小到大篩選排名前10的結(jié)果。富集得到的BP包括對(duì)氧水平的反應(yīng)，肌肉細(xì)胞增殖與血管管徑調(diào)節(jié)等，見表3。富集共有靶點(diǎn)最多的MF為G蛋白偶聯(lián)胺受體活性，見表4。CC富集分析發(fā)現(xiàn)，靶蛋白主要分布在細(xì)胞膜和突觸等，其中以細(xì)胞膜膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域上的靶蛋白數(shù)量最多，見表5。

表3 藥物疾病共有靶點(diǎn)的BP分析

2.6KEGG通路富集 將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，共富集到129條信號(hào)通路，根據(jù)P值由小到大篩選排名前20的通路繪制見表6。由表6可知，經(jīng)分析得到血管收縮、循環(huán)系統(tǒng)血管功能、血管大小調(diào)節(jié)、血管直徑調(diào)節(jié)和平滑肌細(xì)胞增殖這5條信號(hào)通路是血小板聚集作用機(jī)制的主要通路。

表6 藥物疾病共有靶點(diǎn)的生物信號(hào)通路

2.7分子對(duì)接分析 在分子對(duì)接中，配體與受體結(jié)合能的構(gòu)象越穩(wěn)定能量越低，自發(fā)結(jié)合作用的可能性越大。對(duì)丹參抗血小板聚集的潛在藥效成分丹參酮ⅡA和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)進(jìn)行分子對(duì)接分析。首先從Pubchem數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫獲取丹參酮ⅡA和丹參素的3D結(jié)構(gòu)和GPCRs的晶體結(jié)構(gòu)。GPCRs的晶體結(jié)構(gòu)PDB號(hào)為2Y01，配體為Y01；PDB號(hào)為2Y03，配體為5fw。將潛在藥效成分丹參酮ⅡA和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)GPCRs的3D結(jié)構(gòu)加氫去水去配體，再由Autodock Vina 1.1.2軟件對(duì)其進(jìn)行批量分子對(duì)接分析，分子對(duì)接結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA和丹參素對(duì)GPCRs有較好的親和力，其中丹參素與GPCRs有較明顯的氫鍵作用，結(jié)果見圖3。

圖3 分子對(duì)接圖

3 討論

血小板聚集性增加是血栓性疾病的主要病理機(jī)制，因此抑制血小板激活、抗血小板聚集，在血栓性疾病的防治過程中具有重要意義[1，7-9]。近年來研究表明，丹參具有改善微循環(huán)、抗血小板聚集、抗凝血、抗血小板活性等藥理活性，現(xiàn)已從丹參中分離出100余種成分，主要包括脂溶性成分、水溶性成分和黃酮類成分，如丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、異隱丹參酮、丹酚酸、木犀草素等。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，先通過OB和DL篩選得到丹參活性成分；再通過活性成分靶點(diǎn)與血小板聚集關(guān)聯(lián)度預(yù)測丹參的血小板聚集作用機(jī)制的有效成分；最后分析有效成分與疾病的共有靶點(diǎn)所影響的BP和涉及的信號(hào)通路。從信號(hào)通路角度探討丹參的血小板聚集作用的可能機(jī)制。

通過PPI篩選發(fā)現(xiàn)STAT3、IL-6、EGFR、ESR1、VEGFA、FOS、CDKN1A、IL-4、NR3C1、CHRM2、EDNRA、IL-2、AR、CASP3、HTR2A、HTR2C、OPRD1、OPRM1、ADRA1A、ADRA1D和ADRA2A等是丹參血小板聚集作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)[14]是一組能被不同的細(xì)胞刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。臨床上發(fā)現(xiàn)抑制MAPK14激活可緩解缺血性心衰急性損傷，具有保護(hù)心肌的作用，從而抑制血小板聚集，抑制血栓的形成。因此推測丹參通過調(diào)節(jié)受損心肌細(xì)胞生長周期的作用，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA、隱丹參酮等可直接作用于該靶點(diǎn)發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。IL-6是一種由單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和輔助型T細(xì)胞2(Th2)產(chǎn)生的多功能的炎癥細(xì)胞因子，目前認(rèn)為其參與血小板聚集機(jī)制可能有3種[15]:(1)能夠激活血小板，增加其促凝活性促進(jìn)血小板聚集:(2)能夠誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生急性反應(yīng)蛋白，增加凝血因子的數(shù)量，最終在血小板聚集過程中起促進(jìn)作用；(3)可促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)，增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞的黏附作用，促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，加重細(xì)胞損傷。因此推測出，丹參通過阻斷IL-6受體，抑制IL-6活性影響血小板與膠原受體相互作用，從而抑制血小板聚集。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的木犀草素可直接作用于IL-6靶點(diǎn)，發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。IL-6刺激后STAT3激活，STAT3靶點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)一條極其重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它與血小板生成和聚集密切相關(guān)，其在血小板生成中不僅參與血小板的形成和成熟，也參與血小板的活化和聚集。因此抑制STAT3靶點(diǎn)活性有助于抑制血小板活化和聚集[12]。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)是人類中由VEGFA基因編碼的蛋白質(zhì)，該基因是血小板衍生生長因子(PDGF)/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族的成員，并且編碼通常作為二硫鍵連接的同型二聚體發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)是糖基化的有絲分裂原，其特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞并具有多種作用[14]，包括介導(dǎo)增加的血管通透性，誘導(dǎo)血管生成、血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞遷移和抑制細(xì)胞凋亡，VEGF-A顯示出與血管內(nèi)皮細(xì)胞的顯著活性。在體外，VEGF-A已被證明可刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞遷移。VEGF-A也是血管擴(kuò)張劑，增加微血管通透性，最初被稱為血管通透因子。丹參中的活性成分可直接作用于VEGFA靶點(diǎn)抑制其活性，從而抑制血小板活性和血小板聚集。

依據(jù)GO富集分析結(jié)果可知，丹參對(duì)血小板聚集作用機(jī)制BP主要涉及血管收縮、循環(huán)系統(tǒng)血管功能、血管大小調(diào)節(jié)、血管直徑調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞增殖等。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的丹參酮和丹參酚酸類成分可能主要通過保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血管大小和直徑等多靶點(diǎn)發(fā)揮對(duì)血小板聚集的作用，可調(diào)節(jié)血管張力、松弛血管平滑肌、舒張血管、改善血管痙攣、抑制血小板黏附聚集。丹參通過調(diào)節(jié)GPCRs的分子功能，在血栓形成過程中，GPCRs信號(hào)在血小板活化中起著重要作用。病理因素引起的血小板異?；罨ǔＥc血管疾病和血栓形成有關(guān)。血小板激活和聚集影響可溶性受體激動(dòng)劑，刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通過GPCRs，丹參通過在GPCRs信號(hào)通路中多靶點(diǎn)作用于抗血小板而顯著抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板活化。丹參抑制二磷酸腺苷(ADP)與血小板表面G蛋白偶聯(lián)受體與血小板ADP受體亞基(P2Y1和P2Y12)的結(jié)合，抑制血小板的激活和ADP的釋放。P2Y12與G蛋白偶聯(lián)提高其他血小板激動(dòng)劑的活化效率，本研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的脂溶性成分如丹參酮ⅡA是G蛋白偶聯(lián)P2Y12拮抗劑，可抑制血小板聚集。

依據(jù)KEGG富集分析結(jié)果可知，在治療過程中相關(guān)度較高的通路有白細(xì)胞介素17(IL-17)信號(hào)通路、血清低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號(hào)通路、癌癥蛋白聚糖、P2Y12-Gi信號(hào)通路等。炎癥是血小板活化和聚集的關(guān)鍵觸發(fā)因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷，從而導(dǎo)致生理抗凝劑的缺失及血管舒張功能減弱；炎癥還可增加促凝因子的釋放，抑制溶解纖維蛋白的活性，從而促進(jìn)血小板聚集，IL-17信號(hào)通路在急性和慢性炎癥反應(yīng)中都起著至關(guān)重要的作用，已有研究表明，丹參通過IL-17信號(hào)通路抑制血栓中中性粒細(xì)胞的浸潤及NETs的形成，還可下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中p38的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活化[15]，從而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是血小板活化過程中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的關(guān)鍵傳遞素。PI3K/Akt信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)的血小板活化主要通路，為生物體內(nèi)重要的生存信號(hào)通路。丹參介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷鈣離子通道，抑制血管平滑肌收縮偶聯(lián)，舒張血管，發(fā)揮抗血小板活化的功能[16]。丹酚酸A(SAA)和丹酚酸B (SAB)是丹參的水溶性成分，增加血小板cAMP通路，SAB增加cAMP通過調(diào)節(jié)磷酸二酯酶的活性水平(PDE)[17]。SAA抑制PI3K/Akt信號(hào)通路中PI3K下游磷酸化和抗血小板聚集。SAB是一種P2Y12受體拮抗劑，通過原子力顯微鏡(AFM)直接降低ADP和P2Y12受體之間的作用力，并通過與膠原受體相互作用抑制血小板黏附。HIF-1信號(hào)通路參與紅細(xì)胞和血管生成、糖和氨基酸代謝調(diào)節(jié)等基因調(diào)控而發(fā)揮作用，丹參介導(dǎo)HIF-1信號(hào)通路降低缺血、缺氧腦組織的細(xì)胞凋亡，降低腦組織的損傷，降低HIF-1α水平[18]，抑制血小板的聚集。丹參中的活性化合物通過干預(yù)ADP誘導(dǎo)的P2Y12-Gi信號(hào)通路相關(guān)的多個(gè)靶點(diǎn)，協(xié)同作用使血小板聚集。ADP可刺激血小板與P2Y12受體結(jié)合，激活P2Y12-Gi信號(hào)通路。ADP介導(dǎo)的P2Y12受體活化通過高濃度的環(huán)腺苷酸單磷酸(cAMP)和部分通過PI3K依賴性通路來減輕對(duì)其他激動(dòng)劑的抑制作用，從而促進(jìn)對(duì)其他激動(dòng)劑的反應(yīng)[19-20]。P2Y12偶聯(lián)的Gi與cAMP水平的抑制有關(guān)，這會(huì)導(dǎo)致GPⅡb/Ⅲa等整合素的暴露，這些整合素通過與纖維連接蛋白或纖維蛋白原等適配器分子結(jié)合促進(jìn)血小板聚集。磷酸二酯酶(PDE)是cAMP的抑制劑，控制cAMP[21]的降解。P2Y12偶聯(lián)的Gi也與PI3K活性有關(guān)，PI3K通過催化調(diào)控蛋白激酶B(Akt)和Ras相關(guān)蛋白1b(Rap1b)的活性與GPⅡb/Ⅲa的激活有關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道Rap1b活化對(duì)GPⅡb/Ⅲa的持續(xù)活化具有重要意義[22-23]。丹參調(diào)控的信號(hào)通路見圖4。

圖4 丹參調(diào)節(jié)血小板聚集的P2Y12-Gi蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)

綜上所述，丹參不同成分通過抑制STAT3、IL-6、EGFR、ESR1、VEGFA、FOS、CDKN1A、IL-4、NR3C1、CHRM2、EDNRA、IL-2、AR、CASP3、HTR2A、HTR2C、OPRD1、OPRM1、ADRA1A、ADRA1D、ADRA2A等關(guān)鍵蛋白介導(dǎo)血管收縮、循環(huán)系統(tǒng)血管功能、血管大小調(diào)節(jié)、血管直徑調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞增殖等來調(diào)控血小板聚集，影響血小板活化的不同信號(hào)通路，尤其是P2Y12-Gi受體通路。丹參的抗血小板活性可能取決于多化合物和多靶點(diǎn)的共同干預(yù)作用。本研究揭示了丹參調(diào)控血小板聚集是多成分、多靶點(diǎn)、多通路的BP，體現(xiàn)了中醫(yī)中藥治療疾病的整體觀念，為后期的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)靶點(diǎn)和通路的預(yù)測尚存在局限性，有待后期臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。