熊云帆，李 琴

(1.云南省第二人民醫(yī)院眼科，昆明 650021；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，昆明 650000)

青光眼是臨床常見的眼科疾病，表現(xiàn)為眼壓升高、視力損害、視神經(jīng)受壓，其發(fā)病機制復(fù)雜，臨床治療難度大。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1(SIRT1)治療青光眼的作用受到日益關(guān)注，該分子具有去乙?；钚裕ㄟ^調(diào)節(jié)下游p53和NF-κB等分子的去乙?；瘡亩l(fā)揮抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用。在青光眼患者的小梁網(wǎng)組織中，SIRT1的表達明顯降低，且與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞凋亡等的激活均密切相關(guān)[1-2]。因此，激活SIRT1也被認為是治療青光眼的理想靶點。白藜蘆醇(RES)是從虎杖和葡萄等植物中提取得到的天然多酚類化合物，也是目前已知最強的SIRT1激動劑，激活SIRT1通路后能在肝臟缺血再灌注損傷和視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用[3-4]。本研究以青光眼大鼠為對象并基于SIRT1通路分析RES對視網(wǎng)膜組織的保護作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 Topo-pen AVIA型眼壓計，美國Reichert公司；T1600型凝膠成像儀，上海天能公司；ELX808型酶標儀，美國Bio-tek公司。

1.2試藥 白藜蘆醇(RES)，Sigma公司；水合氯醛，上海撫生實業(yè)有限公司；奧布卡因滴眼液，山東博士倫福瑞達制藥有限公司；RIPA裂解液，上海碧云天公司；B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、裂解型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved caspase-3)、沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1(SIRT-1)、乙?；痯53和乙?；疦F-κB的單克隆一抗及HRP二抗，均購自Abcam公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)試劑盒，均購自上海西唐公司。

1.3動物 30只雄性SD大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量為180～200 g，購自上海靈暢生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0003。

2 方法

2.1分組、造模及給藥 將大鼠隨機分為對照組、模型組和RES組，每組10只。模型組和RES組建立青光眼模型：腹腔注射0.1 g·mL-1水合氯醛0.3 mL·kg-1麻醉，在顳上、顳下和鼻上象限沿著角膜緣剪開球結(jié)膜，分離鞏膜上靜脈并用532 nm激光燒灼鞏膜緣周圍鞏膜淺層靜脈環(huán)及分支，每眼燒灼約100個點，造模7 d后測眼壓，眼壓>22 mmHg為造模成功；對照組進行假手術(shù)操作。造模成功后，RES組腹腔注射RES 20 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)21天時，對照組和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)21 d。

2.2眼壓檢測 在給藥后第7、14、21天時，腹腔注射0.1 g·mL-1水合氯醛0.3 mL·kg-1麻醉后，用4 g·L-1奧布卡因滴眼液滴雙眼，用Topo-pen AVIA眼壓計測定眼壓，每眼檢測4次，計算平均值。

2.3基因表達檢測 給藥后21 d時，完成眼壓檢測后處死大鼠，解剖左側(cè)眼球，分離視網(wǎng)膜組織，按照RIPA裂解液的說明書進行操作，分離組織中的蛋白，按照BCA試劑盒的說明書進行操作，測定蛋白含量。取含有20 μg蛋白的樣本，在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳后電移至NC膜，在NC膜中放入0.05 g·L-1脫脂牛奶，室溫孵育2 h，洗膜后將NC膜放入1∶1 000稀釋的Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、SIRT-1、乙?；痯53和乙?；疦F-κB的一抗中，4 ℃孵育過夜；次日，洗膜后將NC膜放入1∶2 000稀釋的HRP二抗中，室溫孵育1 h，最后加入ECL并在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)蛋白條帶的灰度值計算表達量。

2.4細胞因子含量檢測 處死大鼠后解剖右側(cè)眼球、分離視網(wǎng)膜組織后采用RIPA裂解液提取組織中的蛋白，采用Elisa試劑盒測定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，采用BCA試劑盒測定蛋白含量，計算每毫克總蛋白中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

3 結(jié)果

3.13組大鼠眼壓水平的比較 給藥后7、14、21 d時，模型組大鼠的眼壓水平與對照組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RES組大鼠的眼壓水平與模型組比較均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠給藥后眼壓水平的比較

3.23組大鼠視網(wǎng)膜中凋亡基因表達的比較 給藥后21 d時，與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax和Cleaved caspase-3的表達量均明顯升高，Bcl-2的表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，RES組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax和Cleaved caspase-3的表達量明顯降低，Bcl-2的表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 3組大鼠視網(wǎng)膜中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3表達的比較

圖1 3組大鼠視網(wǎng)膜中凋亡基因的蛋白條帶

3.33組大鼠視網(wǎng)膜中炎癥因子含量的比較 給藥后21 d時，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量與對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RES組大鼠視網(wǎng)膜組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量與模型組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的比較

3.43組大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1通路基因表達的比較 給藥后21 d時，與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中SIRT1的表達量明顯降低，乙?；痯53和乙酰化NF-κB的表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，RES組大鼠視網(wǎng)膜組織中SIRT1的表達量明顯升高，乙酰化p53和乙?；疦F-κB的表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4和圖2。

表4 3組大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1通路基因表達的比較

圖2 3組大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1通路基因的蛋白條帶

3 討論

青光眼是常見的致命性眼病，眼壓升高后壓迫視網(wǎng)膜、引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損害是致盲的主要原因，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損害相關(guān)的機制十分復(fù)雜，可能的機制包括炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的過度激活、細胞凋亡的加劇等[5-7]。RES是具有抗炎、抗氧化和抗凋亡活性的多酚類化合物，本研究將RES用于青光眼的治療，旨在通過RES的藥理學(xué)作用來減輕青光眼病程中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損害。在靜脈燒灼操作后，模型組大鼠的眼壓水平明顯升高，說明造模成功，大鼠出現(xiàn)了青光眼典型的眼壓升高癥狀；在造模后給予RES腹腔注射干預(yù)，給藥后7、14、21 d時的眼壓水平均明顯降低，說明RES用于青光眼的治療具有一定的降眼壓作用，可能原因是RES的抗炎和抗凋亡作用改善了小梁網(wǎng)局部因炎癥及凋亡而引起的變性和硬化，進而有利于房水流出并降低眼壓。

視網(wǎng)膜組織中炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的激活與神經(jīng)節(jié)細胞的損害直接相關(guān)，在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型中，RES已被證實能夠減輕視網(wǎng)膜組織的損傷[4]。本研究在使用RES治療青光眼大鼠后，也觀察了視網(wǎng)膜組織損傷的情況。細胞凋亡及炎癥反應(yīng)與青光眼病程中視網(wǎng)膜組織損傷的關(guān)系已經(jīng)受到廣泛認可[8-10]，因此，本研究分別通過視網(wǎng)膜中凋亡基因表達量及炎癥細胞因子含量的檢測來評價視網(wǎng)膜的損傷程度。Bax和Bcl-2是凋亡調(diào)控基因，前者增加了細胞色素C釋放和促進了有活性的Cleaved caspase-3生成，進而促進凋亡的發(fā)生；后者拮抗Bax的功能并減少Cleaved caspase-3生成，進而抑制凋亡的發(fā)生[11-12]。TNF-α、IL-1β和IL-6是具有促炎活性的細胞因子，能夠加重視網(wǎng)膜組織的炎癥反應(yīng)并引起組織損傷[13-15]。在本研究的青光眼大鼠視網(wǎng)膜中，具有促凋亡作用的Bax和Cleaved caspase-3表達量增多，具有促炎作用的TNF-α、IL-1β和IL-6含量也增多，而抗凋亡作用的Bcl-2表達量減少，與既往關(guān)于青光眼大鼠視網(wǎng)膜中凋亡及炎癥激活的報道一致。在使用RES治療后，視網(wǎng)膜中Bax、Cleaved caspase-3表達量及TNF-α、IL-1β和IL-6含量均減少，而Bcl-2的表達量增多，說明RES對青光眼大鼠視網(wǎng)膜中的細胞凋亡及炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

近些年越來越多關(guān)于RES作用機制的研究證實，RES是SIRT1激動劑，其抗炎、抗氧化和抗凋亡等活性均與激活SIRT1通路有關(guān)[16-18]。SIRT1是具有去乙?；饔玫拇呋福軌虼呋掠畏肿影l(fā)生去乙?；?，引起轉(zhuǎn)錄活性降低。促凋亡基因p53及炎癥反應(yīng)調(diào)控基因NF-κB是重要的SIRT1下游分子，SIRT1使p53及NF-κB發(fā)生去乙酰化后，相應(yīng)分子的促凋亡及促炎效應(yīng)減弱，進而表現(xiàn)出抗炎及抗凋亡作用[19-20]。在青光眼大鼠的視網(wǎng)膜組織中，SIRT1的表達量減少，下游乙?；痯53和乙?；疦F-κB的表達增多，提示SIRT1催化p53及NF-κB去乙酰化的作用減弱，相應(yīng)的抗凋亡及抗炎作用也減弱，與青光眼大鼠視網(wǎng)膜組織中細胞凋亡及炎癥過度激活的變化趨勢吻合。RES具有激活SIRT1的作用，在使用RES治療青光眼大鼠后，視網(wǎng)膜組織中SIRT1的表達量增多，下游乙酰化p53和乙酰化NF-κB的表達量減少，說明RES對青光眼大鼠視網(wǎng)膜在SIRT1通路具有激活作用，這也可能是RES在青光眼中發(fā)揮抗凋亡及抗炎作用的分子機制。

綜上所述，RES對青光眼大鼠視網(wǎng)膜組織具有保護作用，能夠降低眼壓并抑制細胞凋亡和炎癥反應(yīng)；RES的上述保護作用與激活SIRT1通路有關(guān)，今后可通過聯(lián)合使用SIRT1抑制劑或敲低SIRT1的方式來進一步驗證RES發(fā)揮治療作用的分子機制。