趙中霞,劉 宏,陳海霞,高向群,蔡亞琳
(1.石家莊市第八醫(yī)院精神五科,石家莊 050081;2.石家莊市第三醫(yī)院藥劑科,石家莊 050000;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,石家莊 050000)
慢性乙型肝炎是我國常見的慢性傳染病之一,嚴(yán)重危害人民健康,中藥制劑治療慢性乙型肝炎在我國應(yīng)用廣泛[1]。乙肝寧顆粒是由黃芪、金錢草、茵陳、蒲公英、制何首烏、牡丹皮和川楝子等13味藥材經(jīng)煎煮、過濾、濃縮、制粒等工藝加工制成的中藥顆粒劑,具有補(bǔ)氣健脾、活血化瘀、淸熱解毒的功效,臨床主治慢性肝炎,屬脾氣虛弱、血瘀阻絡(luò)、濕熱毒蘊(yùn)證,癥見脅痛、腹脹、乏力、尿黃,對急性肝炎屬上述證候者有一定療效;方中茵陳有清利濕熱、利膽退黃等功效[2-5],金錢草有利濕退黃、利尿通淋、解毒消腫等功效[6-9],蒲公英有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋等功效[10-13];由于我國慢性乙型肝炎患者眾多,乙肝寧顆粒臨床應(yīng)用極為廣泛,因此加強(qiáng)對乙肝寧顆粒中藥制劑的質(zhì)量控制,具有積極意義[14-21];乙肝寧顆粒收載于《中國藥典》2020年版中,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用蒸發(fā)光散射檢測器測定[22]黃芪甲苷,含量測定項(xiàng)目單一,不能更好地控制乙肝寧顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量;故本研究采用RP-HPLC法測定乙肝寧顆粒中綠原酸、槲皮素和咖啡酸的含量。
1.1儀器 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀,包括G1322A型在線脫氣機(jī)、G1329A型自動進(jìn)樣器、G1314B型PDA檢測器、OPEN-LAB 色譜工作站(美國安捷倫公司);Phenomenex SuperLu C18液相色譜柱(美國菲羅門公司);FA2104型電子分析天平(上海潤昕公司);KQ-600BY型超聲波清洗機(jī)(濟(jì)寧科強(qiáng)超聲檢測儀器有限公司);Milli-Q A10 型超純水處理器(美國密理博公司)。
1.2試藥 乙肝寧顆粒(規(guī)格:17 g·袋-1,批號分別為20181106、20190305、20190415),九芝堂股份有限公司。對照品:綠原酸(批號110753-201817,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.8%),槲皮素(批號100081-201610,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%),咖啡酸(批號110885-201703,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%),均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純,購自美國Merck公司;其他試劑均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠;實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。
2.1色譜條件 采用Phenomenex SuperLu C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相:乙腈(A)-3 mL·L-1磷酸(B),梯度洗脫(0~5 min,7%A;5~26 min,7%A~65%A;26~28 min,65%A~7%A;28~35 min,7%A);檢測波長:341 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。
2.2溶液的制備
2.2.1混合對照品儲備液 取3種成分對照品,加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為3 872、2 991、399.2 μg·mL-1的單一對照品溶液,精密移取3種單一對照品溶液各1.0 mL,置于10 mL量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.2.2混合對照品溶液 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對照品儲備液1.0 mL,置于10 mL量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇定容至刻度,搖勻,即得。
2.2.3供試品溶液 取乙肝寧顆粒,研成細(xì)粉,混勻,精密稱取1.0 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇20 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理20 min(超聲功率200 W,頻率60 Hz),放冷至室溫,再稱定質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.2.4陰性對照溶液 根據(jù)乙肝寧顆粒制備方法和藥材配比比例,按照2.2.3項(xiàng)下方法制備缺茵陳、金錢草和蒲公英的單一陽性對照溶液以及分別缺少3種藥材的陰性對照溶液。
2.2.5空白溶液 按照2.2.3項(xiàng)下方法制備不含供試品的空白溶液。
2.3方法學(xué)考察
2.3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液、供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。理論塔板數(shù)按照綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000,分離度均大于1.5,基線分離良好。見圖1。
2.3.2專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),陰性對照溶液在與綠原酸、槲皮素和咖啡酸相同保留時(shí)間處無干擾峰,表明該方法專屬性良好。見圖1。
圖1 HPLC圖
2.3.3線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對照品儲備液,分別加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇定容至刻度,搖勻,制成系列混合對照品溶液;按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖;以待測成分峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。
表1 3種成分線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)
2.3.4回收率實(shí)驗(yàn) 取乙肝寧顆粒(批號20181106),研成細(xì)粉,混勻,精密稱取1.0 g,共6份,置于具塞錐形瓶中;分別加入2.2.1項(xiàng)下制備的3種單一對照品溶液,后續(xù)按照2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理,得加標(biāo)供試品溶液6份,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖,根據(jù)峰面積計(jì)算3種成分的平均回收率,結(jié)果見表2。
表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)
2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取乙肝寧顆粒(批號20181106),按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,室溫下放置0、2、4、6、12、24 h,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖,計(jì)算得3種成分峰面積RSD值分別為1.5%、1.2%、1.8%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次乙肝寧顆粒(批號20181106),按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖,計(jì)算3種待測成分的含量,根據(jù)6次檢測結(jié)果計(jì)算RSD值。結(jié)果3種成分含量的RSD值分別為1.9%、1.6%、2.1%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.7精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖;根據(jù)6次峰面積測定值計(jì)算RSD值,結(jié)果3種成分峰面積RSD值分別為1.7%、1.3%、2.0%,表明儀器精密度良好。
2.4樣品含量檢測 取乙肝寧顆粒,按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖,根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中3種成分的含量,結(jié)果見表3。
表3 含量檢測結(jié)果
3.1檢測波長的選擇 分別取3種成分對照品,按照2.2.1項(xiàng)下方法配制成質(zhì)量濃度均為5.0 μg·mL-1的單一對照品溶液,在200~400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描,結(jié)果3種成分分別在328、324、359 nm波長處有最大吸收。分別取2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件,設(shè)定采集波長范圍為320~360 nm,分別采集色譜圖;實(shí)驗(yàn)證明,檢測波長為341 nm時(shí),3種待測成分響應(yīng)良好,定量結(jié)果準(zhǔn)確,陰性對照無干擾。光譜圖見圖2。
圖2 紫外光譜圖
3.2流動相的選擇 保持其他色譜條件不變,分別選擇甲醇-水、乙腈-水、甲醇-3 mL·L-1磷酸和乙腈-3 mL·L-1磷酸作為流動相體系進(jìn)行比較,結(jié)果采用等度條件時(shí),待測成分與未知雜質(zhì)峰重疊,且分析時(shí)間較長,故實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫法。選擇乙腈-3 mL·L-1磷酸作為流動相時(shí),3種成分色譜峰峰形尖銳,分離度均大于1.5,陰性對照溶液無干擾。因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-3 mL·L-1磷酸作為流動相。
3.3提取方法的選擇 實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇以及體積分?jǐn)?shù)分別為95%、75%、50%的甲醇作為提取溶劑,超聲10、15、20、25、30 min進(jìn)行提取效果比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇超聲20 min時(shí),對乙肝寧顆粒中3種成分的提取效果最佳,提取率大于90%,且基質(zhì)干擾較小,定量結(jié)果準(zhǔn)確。
綜上所述,本研究建立了能同時(shí)測定乙肝寧顆粒中3種成分含量的RP-HPLC法,該方法操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高,可用于乙肝寧顆粒的質(zhì)量控制,為國家標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。