陳小琴，雷彩霞，奚燕萍，肖 敏

（復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院上海集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011）

卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是垂體前葉腺體細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，是人類生殖功能的核心激素之一，其生理功能的發(fā)揮必須通過與其特異性受體（FSH receptor，F(xiàn)SHR）的結(jié)合來完成。FSHR（MIM：136435；GenBank：NM_000145.4）可在顆粒細(xì)胞中嚴(yán)密地調(diào)控著卵泡成熟的各個(gè)階段，以應(yīng)對FSH周期性的變化。FSHR蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）超家族的成員之一，并具有該蛋白家族典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域［1］。

FSHR基因致病性變異可能與高促性腺激素閉經(jīng)（hypergonadotropic amenorrhea）相關(guān)［2-6］，呈常染色體隱性遺傳。該病患者主要表現(xiàn)為女性40歲前出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng)、血促性腺激素升高、雌激素降低，可分為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）［7］和卵巢抵抗綜合征（resistant ovarian syndrome，ROS）［8-9］。POF患者的卵巢內(nèi)竇狀卵泡少，無卵泡或偶見少數(shù)始基卵泡；而ROS患者的卵巢內(nèi)有正常數(shù)目的始基卵泡及竇狀卵泡，且抗繆勒管激素（antimullerian hormone，AMH）值與年齡相符［10］。高促性腺激素閉經(jīng)，一方面由于雌激素低下，患者表現(xiàn)出神經(jīng)、代謝、心腦血管和骨質(zhì)疏松等一系列機(jī)體的嚴(yán)重失調(diào)；另一方面，患者無排卵，表現(xiàn)為不孕癥。FSHR基因?qū)δ行缘挠绊懴鄬ε远暂^小。存在FSHR純合變異的男性可能會(huì)存在不同程度的生精障礙，但并不會(huì)表現(xiàn)為無精或絕對的不育［6,11］。迄今為止，中國人群的FSHR基因相關(guān)變異報(bào)道較少。本研究對臨床表現(xiàn)為高促性腺激素閉經(jīng)及不孕的患者及其家系進(jìn)行全外顯子組測序及Sanger測序檢測，探討其遺傳性致病因素，期望對其家庭生育進(jìn)行指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 對象

患者，女，1992年出生，結(jié)婚2年，性生活規(guī)律，未避孕，未孕。17歲初潮后閉經(jīng)，斷續(xù)人工周期治療，正常女性核型46，XX。2020年8月20日末次月經(jīng)（last menstrual period，LMP），后未規(guī)范用藥，9月4日至5日有少量不規(guī)則出血2 d。2020年7月16日，激素檢測FSH為15.63 mIU/mL，黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）為8.75 mIU/mL，雌二醇（estradiol，E2）為11 pg/mL。2020年7月28日，經(jīng)陰道B超提示：子宮為35 mm×34 mm×29 mm，內(nèi)膜為7 mm；左卵巢為20 mm×15 mm×11 mm，卵泡直徑為4 mm；右卵巢為22 mm×15 mm×10 mm，卵泡直徑為5 mm。2020年9月23日，B超提示子宮位置后位，形態(tài)規(guī)則，肌層回聲尚均勻，大小為39 mm×36 mm×32 mm，內(nèi)膜厚度為1 mm；左卵巢為17 mm×15 mm×9 mm，有2～3個(gè)直徑小于10 mm的卵泡；右卵巢為20 mm×17 mm×12 mm，有7～8個(gè)直徑小于10 mm的卵泡；右卵巢旁見一無回聲區(qū)，直徑約6 mm，邊界清，提示右卵巢旁囊腫，雙側(cè)卵巢未見明顯異常，不支持卵巢早衰（圖1）。2020年5月8日，AMH為2.43 ng/mL，屬于正常范圍。患者有一姐姐無月經(jīng)來潮，未避孕，未孕多年；患者弟弟已婚，妻子孕6月，未見明顯異常；患者父母非近親，無家族性遺傳性疾病史。患者及家人臨床癥狀詳情見圖2及表1。本研究通過上海集愛遺傳與不育診療中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，與患者及家屬簽署了相關(guān)知情同意書。

圖1 患者雙側(cè)卵巢切面圖Fig. 1 Cross-sectional view of bilateral ovary of the patientROV：右側(cè)卵巢；LOV：左側(cè)卵巢。ROV: Right ovary; LOV: Left ovary.

圖2 FSHR基因突變家系圖Fig. 2 Family Tree of FSHR gene mutationM1表示攜帶c.392G＞A突變；M2表示攜帶c.310A＞G突變；N表示不攜帶FSHR基因變異。M1 means the person carries the c.392G＞A variant; M2 means the person carries the c.310A＞G variant; N means the person does not carry the FSHR gene variant.

表1 患者及其家人的基本信息及臨床癥狀Tab. 1 Basic information and clinical symptoms of the patient and her families

1.2 方法

1.2.1 全外顯子組測序

在獲得書面知情同意后，提取患者的外周血，使用安捷倫ClearSeq遺傳性疾病試劑盒和因美納捕獲試劑盒（TruSeq v3 Cluster and SBS Kit）進(jìn)行外顯子組捕獲。在Illumina HiSeq平臺(tái)上進(jìn)行全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WES）。臨床外顯子及其上游和下游20 bp序列的平均測序深度≥94×，富集區(qū)平均≥20×的覆蓋率為97.0%。平均覆蓋深度為55.8×，99.0%的目標(biāo)DNA覆蓋10×以上［12］。主要使用Sentieon軟件套件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行二級分析，通過Sentieon BWA與UCSC hg19參考基因組對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。每個(gè)堿基的測序覆蓋率均來自所有基因組測序數(shù)據(jù)。

1.2.2 全外顯子組測序數(shù)據(jù)分析

使用明碼生物公司（https://csa.wuxinextcode.cn）的臨床測序分析系統(tǒng)（the clinical sequence analyzer，CSA）對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用系統(tǒng)的默認(rèn)設(shè)置對用戶界面、原始測序數(shù)據(jù)讀取以及基因組瀏覽器進(jìn)行分析。使用系統(tǒng)分析可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變異的純合子或者雜合子（無義、錯(cuò)義、剪接位點(diǎn)或非編碼調(diào)控區(qū)），并用明碼生物公司的變異效應(yīng)預(yù)測器（variant effect predictor，VEP）（評分≥0.9）評估其預(yù)測的有害影響［13］。VEP主要是利用蛋白功能損傷預(yù)測軟件（sorting intolerant from tolerant，SIFT）［14］和polyphen2（polymorphism phenotype）［15-16］的信息來預(yù)測變異對基因、轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)序列的影響。如果該變異在之前的同行評審出版物或公共數(shù)據(jù)庫［如人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD專業(yè)版）、ClinVar或人類孟德爾遺傳在線（online Mendelian inheritance of man，OMIM，https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫、本地?cái)?shù)據(jù)庫］中報(bào)告為致病性，則該變異將被標(biāo)記為致病性或可能致病性。為了過濾出高頻率的變異，我們從人群頻率數(shù)據(jù)庫（gnomAD，http://gnomad.broadinstitute.org/）的公共數(shù)據(jù)集中對等位基因頻率進(jìn)行了注釋。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American college of medical genetics and genomics，ACMG）的標(biāo)準(zhǔn)和指南［17］對與患者表型相關(guān)的變異進(jìn)行分類。變異命名遵循人類基因組變異學(xué)會(huì)（human genome variation society，HGVS）的標(biāo)準(zhǔn)建議［18］。通過Alamut Visual軟件［版本號(hào)為v.2.15.0（19 Feb. 2020，Interactive Biosoftware，Rouen，F(xiàn)rance）］對已鑒定的變異進(jìn)行可能的有害影響預(yù)測，使用Sentieon算法和NextGENe軟件（2.4.2.3版本）檢測拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）。

1.2.3 Sanger驗(yàn)證和共分離分析

提取并使用患者及其家屬的外周血樣本DNA，使用自動(dòng)測序儀（3500XL Genetic Analyzer, Applied Biosystems，USA）從正向和反向兩個(gè)方向?qū)彝コ蓡T的變異進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。外顯子編號(hào)按照參考序列NM_000145.4（10個(gè)外顯子）進(jìn)行。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增引物。采用FinchTV軟件（Version 1.4.0）分析Sanger測序序列。Sanger測序所用引物有：FSHR-chr2-49217759-F1（TGGCCTCCCTATCTTTGCTAAC）、FSHR-chr2-49217759-R1（GCATCCTAATCCCCTTGTGACT）、FSHR-chr2-49244692-F1（ACCAAGTATCTCTCCACCTCCA）、FSHR-chr2-49244692-R1（CAGCAGGGAGACAGGGTTAATA）。

1.2.4 變異位點(diǎn)的保守性分析

使用MUSCLE（multiple sequence comparison by log-expectation）軟件［19］默認(rèn)參數(shù)分析 FSHR氨基酸位點(diǎn)的進(jìn)化保守性。

2 結(jié)果與分析

2.1 全外顯子組測序結(jié)果

基于患者的臨床表型，選用以下人類表型標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語（human phenotype ontology，HPO）和/或在線孟德爾遺傳（online mendelian inheritance in man，OMIM）術(shù)語篩選出合適的候選致病基因：HP:0000141-Amenorrhea、HP:0000789-Infertility、HP:0008232-Elevated circulating follicle stimulating hormone level、HP:0030345-Abnormal circulating luteinizing hormone level、HP:0000137-Abnormality of the ovary、HP:0008222-Female infertility。經(jīng)篩選，全外顯子組測序結(jié)果顯示，患者FSHR基因第5外顯子存在chr2: 49217759, NM_000145.4, c.392G＞A （p.Gly131Asp）錯(cuò)義變異（圖3a），第4外顯子存在chr2: 49244692, NM_000145.3, c.310A＞G （p.Lys104Glu）錯(cuò)義變異（圖3b）。

圖3 全外顯子組測序點(diǎn)突變可視化展示Fig. 3 Integrative genomics viewer for whole exome sequencing mutations（a）c.392G＞A（p.Gly131Asp）可視化展示；（b）c.310A＞G（p.Lys104Glu）可視化展示。第一行是染色體位置坐標(biāo)。(a) c.392G＞A (p.Gly131Asp) integrative genomics viewer; (b) c.310A＞G (p.Lys104Glu) integrative genomics viewer. The first line is the chromosome position coordinates.

2.2 Sanger測序結(jié)果

Sanger測序發(fā)現(xiàn)患者母親攜帶與患者FSHR基因第5外顯子相同的完整變異（chr2: 49217759; NM_000145.4: c.392G＞A）（圖4a），其父親攜帶與患者FSHR基因第4外顯子相同的完整變異（chr2: 49244692; NM_000145.3: c.310A＞G）（圖4b），患者姐姐（圖4c）和弟弟（圖4d）檢出與患者完全相同的FSHR基因復(fù)合雜合變異。

圖4 患者父母及姐姐、弟弟FSHR基因變異位點(diǎn)Sanger測序的驗(yàn)證結(jié)果Fig. 4 The results were verified by Sanger sequencing of the FSHR gene mutation locus of the patient’s parents, elder sister and younger brother藍(lán)色柱狀標(biāo)記為變異所在位置。 The blue bars mark the location of the mutations.

2.3 變異位點(diǎn)生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR基因第5外顯子錯(cuò)義變異c.392G＞A（p.Gly131Asp）所在位點(diǎn)氨基酸在不同物種中高度保守（圖5a）。根據(jù)ACMG指南［17］致病性分類可將其分為可能致?。╨ikely pathogenic，LP）變異，證據(jù)如下。PM2：隱性基因FSHR在gnomAD外顯子組數(shù)據(jù)庫中純合子等位基因頻率數(shù)為0（gnomAD外顯子組覆蓋率為77.6%），在gnomAD基因組數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)該變異（gnomAD基因組覆蓋率=31.5%），符合在正常對照人群數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)的變異（或隱性遺傳病中極低頻位點(diǎn)）證據(jù)。PP2_Supporting：FSHR基因中的37個(gè)非VUS錯(cuò)義變異中有31個(gè)致病性的變異，占比為83.8%，高于51.0%的閾值；臨床報(bào)告的93個(gè)FSHR基因變異中有33個(gè)致病性的變異，占比為35.5%，高于12.0%的閾值，所以符合對某個(gè)基因來說，如果這個(gè)基因的錯(cuò)義變異是造成某種疾病的原因，并且這個(gè)基因中良性錯(cuò)義變異所占的比例很小，那么在這樣的基因中所發(fā)現(xiàn)的新的錯(cuò)義變異，可以使用PP2_Supporting證據(jù)。PP3_Supporting：基于BayesDel_addAF、DANN、EIGEN、FATHMM-MKL、LIST-S2、M-CAP、MVP、MutationTaster和SIFT的9個(gè)致病預(yù)測與PrimateAI的1個(gè)良性預(yù)測，符合多種統(tǒng)計(jì)方法預(yù)測出該變異會(huì)對基因或基因產(chǎn)物造成有害的影響的結(jié)果。PP4：變異攜帶者的表型或家族史高度符合某種單基因遺傳疾病。PP1：突變與疾病在家系中共分離（在家系多個(gè)患者中檢測到此變異）。

FSHR基因第4外顯子錯(cuò)義變異c.310A＞G（p.Lys104Glu）所在位點(diǎn)氨基酸在不同物種高度保守（圖5b）。根據(jù)ACMG指南致病性分類可將其分為LP，證據(jù)包括PM2、PP2_Supporting、PP3_Supporting、PP4、PP1。

圖5 FSHR基因突變所在位點(diǎn)氨基酸在不同物種中的保守性分析Fig. 5 Analysis of conserved amino acids at the sites of FSHR gene mutations in different species （a）c.392G＞A（p.Gly131Asp）所在位點(diǎn)氨基酸在不同物種中的保守性分析；（b）c.310A＞G（p.Lys104Glu）所在位點(diǎn)氨基酸在不同物種中的保守性分析可視化展示。紅線標(biāo)注列為變異所在位點(diǎn)氨基酸在不同物種保守性分析。(a) The conserved analysis of amino acids at the site of c.392G＞A (p.Gly131Asp) in different species; (b) The conserved analysis of amino acids at the site of c.310A＞G (p.Lys104Glu) in different species. The red line indicates the conserved analysis of amino acids at the mutation site.

基于以上分析，我們認(rèn)為c.392G＞A（p.Gly131Asp）與c.310A＞G（p.Lys104Glu）的復(fù)合雜合變異是患者及其姐姐不孕的原因。

3 討論

人類FSHR基因定位于2號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶（2p2.1），全長約54 kb，由10個(gè)外顯子與9個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，編碼FSHR蛋白。其中1～9號(hào)外顯子較短，編碼胞外區(qū)的氨基酸部分，10號(hào)外顯子負(fù)責(zé)編碼其他蛋白結(jié)構(gòu)。其與生殖相關(guān)疾病關(guān)系的研究一直備受關(guān)注。FSHR基因突變存在失活突變和激活突變兩種形式。其中失活突變主要出現(xiàn)在早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）患者中，這些突變導(dǎo)致了FSHR基因功能的部分或全部喪失，對FSH的反應(yīng)性減弱或缺乏。激活突變主要見于卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）的研究，這些突變導(dǎo)致FSHR功能異?；钴S，對FSH的反應(yīng)性增強(qiáng)。但FSHR基因突變具有顯著的種族差異，目前僅在芬蘭POI人群中報(bào)道較多，而在其他種族人群中比較罕見。

本研究檢測發(fā)現(xiàn)的2個(gè)FSHR基因突變均為未曾報(bào)道的新突變，豐富了FSHR基因突變譜及表型譜，同時(shí)為該家系的遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供了依據(jù)。遺傳性高促性腺激素閉經(jīng)的女性患者通常表現(xiàn)為不孕。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，各類促排卵方案的不斷涌現(xiàn)能夠幫助許多不孕家庭成功擁有自己的后代。當(dāng)突變FSHR殘留部分功能時(shí)，可以嘗試用高劑量的FSH來刺激卵泡發(fā)育，但是需要告知患者預(yù)期較差；當(dāng)突變FSHR完全喪失功能時(shí)，對各類促排卵方案均難以有應(yīng)答。如果未明確診斷則容易造成無謂的嘗試，給患者的心理以及經(jīng)濟(jì)均帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，可以嘗試卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)來獲得成熟卵子［20］，但目前未見通過該方法患者成功生育的例子，現(xiàn)階段更行之有效的方案是建議患者選擇捐卵。