王向英，武欣，張杰，孟會生，洪堅平*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，山西太谷 030801）

采煤引起地表沉陷給礦區(qū)生態(tài)環(huán)境造成重大影響[1]，土地復墾是改善礦區(qū)生態(tài)環(huán)境、保護耕地面積、緩解人地矛盾的重要措施[2]。但工程復墾后的重構(gòu)土壤，壓實嚴重、結(jié)構(gòu)不良、土壤養(yǎng)分和酶活性低、微生物種類少，嚴重制約礦區(qū)植被生長和生態(tài)恢復[3-4]。相比傳統(tǒng)復墾方式投資大、周期長、生態(tài)效果不穩(wěn)定等缺點，微生物復墾中許多微生物具有解磷、解鉀、固氮等功能，可改善植物營養(yǎng)環(huán)境，促進復墾土壤微生物體系恢復，加快復墾土壤向農(nóng)業(yè)土壤轉(zhuǎn)變，縮短復墾周期[5-6]，是目前礦區(qū)土地復墾新熱點。

山西是煤炭大省，大量采煤沉陷地亟待復墾。同時，由于山西石灰性土質(zhì)，磷在土壤中固定能力強，生物有效性低[7-8]，礦區(qū)土壤常因缺磷導致低固氮率，磷素養(yǎng)分成為提升復墾土壤質(zhì)量的限制因素。解磷微生物可參與土壤中難溶磷的釋放與利用[9]，提高土壤有效磷含量，促進植物生長發(fā)育，是維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展重要手段[10]。目前，關于解磷微生物研究主要集中在解磷菌分離、篩選、解磷能力和解磷機理方面[11-12]，以及解磷菌劑施用后對土壤磷素活化和促生作用的評價[13-14]，對解磷菌在土壤中生存和定殖狀況不夠了解，有關解磷菌在復墾土壤中定殖情況鮮有報道。因此，有必要對解磷菌在復墾土壤中生態(tài)學特征深入研究，掌握定殖狀況，為充分發(fā)揮解磷作用，提升復墾土壤肥力提供理論依據(jù)。

熒光假單胞菌是一種重要根際促生菌[15]，具有抑制病原菌、解磷、固氮能力，可產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）、鐵載體等促進植物生長[16-17]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)多有應用，但其在復墾土壤中定殖能力和促生作用尚不清楚。本文以綠色熒光蛋白（GFP）標記解磷假單胞菌w134和w137，通過盆栽試驗，研究w134GFP和w137GFP在玉米根際和非根際土壤中定殖以及對復墾土壤磷素活化和玉米生長的影響，以期為山西采煤塌陷區(qū)復墾土壤生物修復提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤為石灰性褐土，取自山西省襄垣縣采煤塌陷區(qū)的復墾土壤，pH 8.18，有機質(zhì)8.4 g·kg-1，全氮0.32 g·kg-1，全磷0.35 g·kg-1，全鉀15.6 g·kg-1，堿解氮12.5 mg·kg-1，有效磷3.28 mg·kg-1，速效鉀84.7 mg·kg-1，取回土壤風干后過2 mm篩，混勻備用。

供試肥料：無機肥為尿素（N，46.6%），過磷酸鈣（P2O5，16%），硫酸鉀（K2O，45%）；有機肥為腐熟雞糞，其中含有機質(zhì)27.8%，N 1.68%，P2O51.54%，K2O 0.82%。

供試作物為玉米，品種為大豐。

供試菌株為課題組從山西石灰性土壤中篩選的兩株解磷菌w134和w137，經(jīng)16S鑒定，兩株菌均為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。質(zhì)粒pRTGFP由南京農(nóng)業(yè)大學（南農(nóng)）鐘增濤教授惠贈，具有氨芐青霉素（Amp）和四環(huán)素（Tet）抗性[18]。采用電擊轉(zhuǎn)化法將pRTGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入w134和w137中，記作w134GFP和w137GFP。

標記菌定殖檢測：LB固體培養(yǎng)基滅菌后加入抗生素，制成50μg·mL-1氨芐青霉素和50μg·mL-1四環(huán)素的雙抗平板，平板計數(shù)法檢測標記菌在復墾土壤中定殖能力。

解磷細菌選擇性固體培養(yǎng)基（PVK培養(yǎng)基）[18]，用于計數(shù)復墾土壤中解磷菌群數(shù)量。

1.2 試驗設計

采用電擊轉(zhuǎn)化法進行w134和w137的GFP標記，隨后利用玉米盆栽試驗作定殖能力檢測。試驗在山西農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院實驗站大棚中完成，將取回的復墾土壤風干過篩后裝盆，每盆10 kg。試驗為雙因素設計，4個施肥處理：不施肥、化肥（CF）、有機肥（M）、化肥+有機肥（CFM）；3個接菌處理：不接菌、w134GFP、w137GFP，共12個處理，每處理3個重復。按等量氮磷鉀原則施肥，化肥組：每盆施加尿素6.52 g，過磷酸鈣12.5 g，硫酸鉀6.66 g。有機肥組：每盆施加雞糞148 g。化肥+有機肥組：每盆施加肥料為化肥和有機肥各半。種植前將肥料作為底肥一次性施入。每盆接菌液50 mL，菌體濃度109cfu·mL-1，接菌后土壤中初始菌量0.5×107cfu·g-1土。澆水至土壤最大持水量，待水分平衡1 d后播種。玉米出苗7 d間苗，每盆留長勢一致的3株。出苗35d采集土樣和玉米植株測定各項指標。

1.3 測定項目與方法

復墾土壤中標記菌和解磷菌數(shù)量檢測：①根際土：采用抖根法收集根際土，取1 g根際土與9 mL無菌水混勻，逐級稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋度土壤懸濁液100μL涂LB雙抗平板；另取100μL涂PVK平板。30℃培養(yǎng)48 h，觀察根際土壤中標記菌和解磷菌群數(shù)量。②非根際土壤：取10 g非根際土與90 mL無菌水混勻，逐級稀釋，涂布方法同根際土，觀察非根際土壤中標記菌和解磷菌數(shù)量。

土壤速效磷采用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法[19]，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法[20]。

玉米植株一次性采集，測定玉米株高、株粗和干鮮重。植株全氮采用硫酸—過氧化氫消煮，凱氏定氮法測定；植株全磷采用硫酸—過氧化氫消煮，釩鉬黃比色法測定[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)Excel 2016整理；利用SAS 9.4軟件作雙因素方差分析；并在雙因素方差分析基礎上采用Duncan多重比較法比較所有試驗處理間差異[21]，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復墾土壤中標記菌定殖能力和解磷菌群數(shù)量

試驗采用電擊轉(zhuǎn)化法將GFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入w134和w137中，熒光顯微鏡可觀察到轉(zhuǎn)化菌體帶有強烈綠色熒光（見圖1），說明GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入w134和w137菌株中且GFP基因成功表達。w134GFP和w137GFP提質(zhì)粒酶切后電泳見圖2，與南農(nóng)惠贈GFP質(zhì)粒酶切后條帶相同。再次證明GFP質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入w134和w137中，可作定殖能力相關研究。

圖1 w134GFP和w137GFP熒光照片（40×）Fig.1 Fluorescent photos of w134GFP and w137GFP(40×)

圖2 w134GFP和w137GFP質(zhì)粒酶切電泳Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis of plasmids w134GFP and w137 GFP

標記菌在玉米根際土壤中定殖數(shù)量在104cfu·g-1（見表1）。3個施肥組中標記菌定殖數(shù)量均大于不施肥組，定殖數(shù)量依次為：有機肥組>化肥組≈有機+化肥組>不施肥組。其中有機肥組中標記菌定殖數(shù)量最多，M+w137GFP定殖數(shù)量最高，約5.97×104cfu·g-1；M+w134GFP定殖數(shù)量次之，約3.94×104cfu·g-1，分別是單施w137GFP和w134GFP時定殖數(shù)量5.28倍和3.28倍。在非根際土壤中，除有機肥組標記菌定殖數(shù)量在104cfu·g-1外，其他處理中標記菌數(shù)量均在103cfu·g-1左右，比根際土中低一個數(shù)量級。

表1 玉米根際和非根際土壤中標記菌和解磷菌數(shù)量Table 1 Populations of w134GFP,w137GFP and phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere and non-rhizosphere soil of maize

解磷菌群數(shù)量在根際土中約107cfu·g-1，非根際土中約106cfu·g-1，根際土數(shù)量高于非根際土。與標記菌分布狀態(tài)一致，可見根際是微生物活動主要場所。不論施肥與否，有無標記菌接入，各處理間解磷菌群數(shù)量無數(shù)量級差異。

2.2 接種解磷菌對復墾土壤中有效磷含量、磷酸酶活性的影響

不同處理對土壤有效磷含量影響見圖3。接種解磷菌對復墾土壤有效磷含量影響顯著（P=0.02）。相同施肥條件下，接菌土壤比單施肥土壤有效磷含量高：CF+w134GFP比CF有效磷含量提高11.65%；M+w137GFP比M提高8.89%；CFM+w137GFP比CFM提高10.22%。12個處理中，土壤有效磷增幅最大是w134GFP和w137GFP，分別比CK中有效磷含量提高32.89%和16.44%?？梢姡饬拙?種施肥處理中均表現(xiàn)解磷功能，提高土壤有效磷含量。

圖3 不同處理條件下復墾土壤中有效磷含量Fig.3 Content of available phosphorus in reclaimed soil under different treatments

圖4為不同處理對土壤磷酸酶活性影響。盡管接種解磷菌對土壤磷酸酶影響不顯著（P=0.22），但接菌和施肥兩者交互作用對土壤磷酸酶影響顯著（P<0.05）。化肥+解磷菌處理的磷酸酶活性顯著低于單施解磷菌，有機肥+解磷菌處理的磷酸酶活性則高于單施解磷菌。所有處理中，CF+w137GFP處理的磷酸酶活性最低，而M+w134GFP處理的磷酸酶活性最高?？梢?，化肥對接種解磷菌分泌磷酸酶有抑制作用，有機肥表現(xiàn)促進作用。

圖4 不同處理條件下復墾土壤中磷酸酶活性Fig.4 Phosphatase activity in reclaimed soil under different treatments

2.3 接種解磷菌對苗期玉米生長的影響

從表2可知，接種解磷菌對玉米株高影響顯著（P<0.01），在相同施肥處理條件下，接種解磷菌處理比對應單施肥處理效果更佳：w134GFP和w137GFP處理的玉米株高比CK高5.5%~6.7%；CF+w134GFP和CF+w137GFP處理的玉米株高比CF高12.7%~15.8%；CFM+w134GFP和CFM+w137GFP處理的玉米株高比CFM高11.6%~18.4%。類似結(jié)果在玉米株粗、干鮮重上也有體現(xiàn)，表明四種施肥條件下，接種解磷菌均促進復墾土壤中玉米植株生長。

表2 不同處理條件下苗期玉米株高、株粗、干鮮重Table 2 Plant height,plant diameter,dry and fresh weight of maize under different treatments

2.4 接種解磷菌對玉米植株氮、磷含量的影響

玉米植株含氮量見圖5。接種解磷菌對玉米含氮量影響顯著（P=0.038），相同施肥條件下，w134GFP和w137GFP處理分別比CK含氮量提高32.05%和37.18%，差異顯著（P<0.05）。3個施肥組中，解磷菌+施肥處理比對應施肥處理玉米含氮高，其中M+w134GFP處理玉米含氮量最高，為3.07%，比M處理高18.1%。

圖5 不同處理條件下苗期玉米植株含氮量Fig.5 Nitrogen content of maize plant at seedling stage under different treatments

續(xù)表

不同處理條件下玉米植株含磷量見圖6。盡管接種解磷菌對玉米含磷量影響不顯著（P=0.08），但相同施肥條件下，接菌+施肥處理比對應單施肥處理的玉米含磷含量高。

圖6 不同處理條件下苗期玉米植株含磷量Fig.6 Phosphorus content of maize plant at seedling stage under different treatments

W134GFP和w137GFP處理分別比CK玉米含磷量提高27.96%和12.83%；CF+w134GFP和CF+w137GFP處理分別比CF提高14.28%和16.76%；M+w134GFP和M+w137GFP處 理 分 別 比M提 高54.9%和27.1%；CFM+w137GFP處理比CFM提高4.32%。

3 討論

3.1 標記菌在復墾土壤中的定殖

微生物定殖是指在有土著微生物參與競爭情況下，外來菌株在植物根表或土壤中生長并維持其種群數(shù)量的能力[22]。試驗借助GFP標記研究解磷假單胞菌w134和w137在復墾土壤中定殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種35 d，w134GFP和w137GFP在玉米根際和非根際土壤中定殖數(shù)量基本在約103~104cfu·g-1（見表1），這與課題組前期僅在復墾土壤中35 d定殖數(shù)量一致，再次印證標記菌在復墾土壤中定殖能力。

本文所用解磷菌為熒光假單胞菌，作為一種重要根際促生菌[15]，其主要定殖在根際土壤中。夏楓耿等用luxAB發(fā)光酶基因標記熒光假單胞菌PF20001，發(fā)現(xiàn)其主要定殖在以菜心主根為中心，半徑3~4 cm土壤中[23]。張亮等研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌PEF-5#18可定殖于番茄根際，其定殖數(shù)量為根際土壤>根>莖[24]。劉方春等對假單胞菌YT3作綠色熒光蛋白標記發(fā)現(xiàn)，YT3-gfp主要定殖于櫻桃根際土壤中，根際土壤定殖數(shù)量是非根際土壤8.75~28.77倍[25]。本試驗得到相近結(jié)果，w134GFP和w137GFP在根際土壤中定殖數(shù)量高于非根際土?？梢姡瑥蛪ㄍ寥赖母H環(huán)境更利于菌株定殖，是熒光假單胞菌發(fā)揮其解磷、促生等功能主要場所。

外來微生物引入導致土壤原有微生物群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生正向或負向影響[26]，因此，功能菌株安全性備受關注。Glandorf等將基因修飾和未經(jīng)修飾的假單胞菌引入田間栽培的小麥根部，發(fā)現(xiàn)接種的熒光假單胞菌對土壤微生物種群代謝能力、土壤硝化潛能和纖維素分解能力無影響，說明引入熒光假單胞菌對土壤微生物生態(tài)無顯著影響[27]。張亮等發(fā)現(xiàn)對接種熒光假單胞菌PEF-5#18對番茄根際土壤可培養(yǎng)細菌總數(shù)無顯著影響[24]。試驗證明，接入熒光假單胞菌（w134和w137）對土壤中解磷菌群數(shù)量無顯著影響（見表1），可見w134和w137是相對安全的功能菌，將在復墾區(qū)大田試驗中繼續(xù)探討未來其對復墾土壤微生物多樣性影響。

3.2 解磷菌對復墾土壤磷素活化和對苗期玉米生長的影響

研究報道添加解磷菌提高土壤速效磷含量，增加植株磷素積累量，增加產(chǎn)量或提高果實品質(zhì)等。孟會生等研究發(fā)現(xiàn)解磷菌肥可提高復墾土壤中磷素有效性，提高玉米產(chǎn)量[7]。喬策策等將高效解磷菌NJAU-B8作盆栽和大田試驗發(fā)現(xiàn)，該菌有效促進苗期玉米生長，增加玉米產(chǎn)量[12]。Chen等從山西復墾土壤中篩選得到解磷菌S32，該菌株對難溶的有機磷和無機磷均表現(xiàn)較高溶解能力，可明顯提高復墾土壤中有效磷含量，顯著提高水稻植株生長量和吸磷量[13]。栗麗等研究發(fā)現(xiàn)，與未接種解磷菌處理相比，解磷菌劑促進磷礦粉和磷酸鈣在復墾土壤中磷的生物有效性，提高盆栽油菜磷素吸收[14]。

本試驗結(jié)果表明，單施解磷菌可促進玉米生長，增加玉米植株氮磷含量和土壤有效磷含量。而解磷菌+肥料大幅度增加標記菌定殖數(shù)量、玉米生長量和土壤有效磷含量。說明在復墾土壤中單施解磷菌效果有限，需提供相應營養(yǎng)，助其有效定殖。Ninwe等研究也證實，營養(yǎng)物質(zhì)是影響熒光假單胞定殖首要因素[28]。復墾土壤養(yǎng)分貧瘠，添加肥料可為解磷菌提供良好載體以及碳、氮等營養(yǎng)物質(zhì)，這些為解磷菌在土壤中有效定殖提供必要條件。因此，從定殖角度講，肥料有助于菌株定殖。僅定殖成功解磷菌才可持續(xù)發(fā)揮解磷作用，促進植物生長，實現(xiàn)復墾土壤向農(nóng)業(yè)土壤轉(zhuǎn)變，縮短復墾周期。

4 結(jié)論

a.在玉米生長35 d后采集土壤，可從土壤中檢測到標記菌w134GFP和w137GFP，根際土壤中兩株標記菌數(shù)量約104cfu·g-1，非根際土壤中兩株標記菌數(shù)量約103cfu·g-1，說明解磷假單胞菌w134和w137可在復墾土壤中有效定殖。

b.接種w134GFP和w137GFP可提高復墾土壤中有效磷含量和磷酸酶活性，增加苗期玉米的株高、株粗、干鮮重以及玉米植株氮、磷含量，這兩株解磷菌可在復墾土壤中起到解磷與促生作用。

c.添加有機肥可為w134GFP和w137GFP提供良好營養(yǎng)條件，促進其在土壤中有效定殖和功能發(fā)揮。