王超，付天姿，張曉烜，李秀樂(lè)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）簡(jiǎn)稱甘藍(lán)，是十字花科蔬菜中重要一種。航海大發(fā)現(xiàn)時(shí)代傳播到世界各地，明清時(shí)期傳入我國(guó)[1]。初蓮香等1993年初次發(fā)現(xiàn)結(jié)球甘藍(lán)無(wú)蠟粉亮綠型突變體[2]，該種突變體甘藍(lán)在生長(zhǎng)階段植被表面均無(wú)蠟粉覆蓋，與普通結(jié)球甘藍(lán)相比差異顯著。Justus和Stoner等報(bào)道指出，小菜蛾和部分鱗翅目昆蟲(chóng)等害蟲(chóng)在蕓薹屬無(wú)蠟粉植株上具有產(chǎn)卵偏好性[3-4]，但瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)和卵數(shù)量有所增加[5]，該害蟲(chóng)天敵在無(wú)蠟粉植株上移動(dòng)速度快于有蠟粉植株，益蟲(chóng)捕食能力提高使無(wú)蠟粉亮綠植株對(duì)蕓薹屬常見(jiàn)害蟲(chóng)具有一定抗性[6]。Cole等研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)蠟粉亮綠性狀對(duì)植株本身而言，增加對(duì)水脅迫敏感性，這一現(xiàn)象導(dǎo)致植株體內(nèi)分泌阻止昆蟲(chóng)取食化合物濃度升高[7]。此背景下，無(wú)蠟粉亮綠突變體研究對(duì)于抗蟲(chóng)性等優(yōu)勢(shì)甘藍(lán)品種選育具有重要意義。

多種分子標(biāo)記技術(shù)已運(yùn)用于結(jié)球甘藍(lán)無(wú)蠟粉亮綠性狀和目的基因定位相關(guān)研究，董昕探究甘藍(lán)顯性蠟質(zhì)缺失基因BoGL-3定位與候選基因，通過(guò)BSA法篩選標(biāo)記，利用F2群體驗(yàn)證標(biāo)記，將甘藍(lán)蠟質(zhì)缺失基因BoGL-3定位在8號(hào)染色體末端83 kb區(qū)間內(nèi)[8]。劉東明對(duì)甘藍(lán)蠟質(zhì)缺失基因BoGL-4作精細(xì)定位，利用SSR標(biāo)記精細(xì)定位，將目的基因BoGL-4定位在1號(hào)染色體170 kb區(qū)間內(nèi)[9]。李景濤選用無(wú)蠟粉亮綠結(jié)球甘藍(lán)10Q-961和普通有蠟粉結(jié)球甘藍(lán)10Q-206為父母本，在對(duì)目的基因定位時(shí)，利用gSSR和InDel多態(tài)性引物篩選F2群體，最終試驗(yàn)結(jié)果表明，共顯性標(biāo)記Scaffold2324與突變體結(jié)球甘藍(lán)10Q-961基因gwl遺傳距離為6.5 cM[10]。

在現(xiàn)有分子標(biāo)記手段中，單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）與其他標(biāo)記方法相比，優(yōu)勢(shì)在于其遺傳穩(wěn)定性高、所在位點(diǎn)極具代表性且分布廣泛，已成為熱門(mén)分子標(biāo)記方法之一[11]。除此之外，SNP檢測(cè)方法較多，雖然大部分檢測(cè)方法存在成本過(guò)高或操作繁瑣等缺陷，遺傳育種領(lǐng)域存在一定局限性[12-13]。但CAPS標(biāo)記（酶切擴(kuò)增多態(tài)性，Cleaved amplified polymorphic sequences）和衍生CAPS（衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性，Derived cleaved amplified polymorphic sequences，dCAPS）是可將SNP多態(tài)轉(zhuǎn)化成可酶切擴(kuò)增的有效分子標(biāo)記方法[14]。已有報(bào)道中司文潔[15]、王彩芬[16]和雷天剛[17]等研究證明，CAPS標(biāo)記具有對(duì)DNA用量低、操作方便、共顯性明顯和多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，故在模式植物擬南芥[18]、大田作物小麥[19]和大麥[20]及水果蔬菜作物中應(yīng)用廣泛。dCAPS標(biāo)記開(kāi)發(fā)具有一定復(fù)雜性，且因限制性內(nèi)切酶多樣性，dCAPS引物設(shè)計(jì)變得極其耗時(shí)，Li等開(kāi)發(fā)批量開(kāi)發(fā)工具（http://223.65.208.206.8018/）可直接設(shè)計(jì)引物對(duì)，且提供引物錯(cuò)配等級(jí)[21]，還可使用Neff等開(kāi)發(fā)dCAPS Finder 2.0軟件（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm）設(shè) 計(jì)dCAPS引 物[22]，該方 法 使dCAPS引物開(kāi)發(fā)更方便快捷。

綜上，dCAPS標(biāo)記自發(fā)明以來(lái)憑借其位點(diǎn)多、高效快捷等特點(diǎn)在分子研究方面應(yīng)用廣泛，例如基因定位、品種品系鑒定、圖位克隆等方面。本試驗(yàn)開(kāi)展結(jié)球甘藍(lán)dCAPS分子標(biāo)記輔助育種，利用新概念分子育種理論和技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)從經(jīng)驗(yàn)育種到高效育種的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而加快結(jié)球甘藍(lán)新品種選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

結(jié)球甘藍(lán)蠟質(zhì)缺失突變材料“亮葉98-1030”，結(jié)球甘藍(lán)蠟質(zhì)正常的野生型材料“98-1030”，以及其有性雜交F1、F2代單株。材料表型如圖1所示，植株表現(xiàn)為亮葉色、有光澤，葉片表面和莖均無(wú)白色或灰白色粉狀蠟質(zhì)覆蓋，則為無(wú)蠟粉亮葉突變型植株；植株表現(xiàn)為灰綠色，葉片表面和莖上均有一層白色霜狀蠟質(zhì)，葉脈表現(xiàn)為白色或黃白色，則為有蠟質(zhì)正常型植株。以上材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院甘藍(lán)課題組提供，同年同一時(shí)期播種于溫室。

圖1 野生型98-1030及無(wú)蠟粉亮葉突變體98-1030對(duì)比Fig.1 Comparison of wild-type cabbage 98-1030 with bright-leaf mutant without wax powder

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)材料于2019年春播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站溫室內(nèi)，待兩葉一心時(shí)分苗于單個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中并編號(hào)；在苗齡3~4片真葉時(shí)，調(diào)查性狀，根據(jù)表型性狀分離比作卡方檢驗(yàn)。將編號(hào)植株分別取0.2 g，保存于-80℃條件下，備用。

1.2.2 親本基因重測(cè)序及候選SNPs挖掘

將結(jié)球甘藍(lán)野生型98-1030和無(wú)蠟粉亮葉突變型98-1030構(gòu)建DNA文庫(kù)作全基因組重測(cè)序，并篩選測(cè)序結(jié)果，與參考基因組作比對(duì)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10901?genome_assembly_id=59537），利用比對(duì)結(jié)果檢測(cè)和篩選SNPs并注釋統(tǒng)計(jì)，以上部分由深圳華大基因股份有限公司完成。最后使用IGV軟件將測(cè)序所得的親本基因與參考基因組作比對(duì)，獲取目標(biāo)區(qū)間SNPs。

1.2.3 dCAPS引物的設(shè)計(jì)

基于篩選得到的20個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)dCAPS引物：先利用dCAPS Finder 2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm）設(shè)計(jì)dCAPS標(biāo)記錯(cuò)配引物，再利用Premier 5.0設(shè)計(jì)dCAPS標(biāo)記下游引物。錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)原則為上下游引物在23~25 bp之間，錯(cuò)配堿基數(shù)為一個(gè)，PCR產(chǎn)物條帶在150~400 bp之間。上述引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，以PAGE方式純化。

1.2.4 dCAPS多態(tài)性引物篩選

dCAPS引物多態(tài)性篩選具體步驟為：

（1）采用改良CTAB法提取雙親以及F1的DNA，并利用設(shè)計(jì)好的dCAPS引物作PCR擴(kuò)增；

（2）記錄PCR產(chǎn)物電泳帶型，以條帶清晰、易于識(shí)別、可穩(wěn)定擴(kuò)增為篩選條件，使用對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切，最后統(tǒng)計(jì)酶切產(chǎn)物條帶情況，篩選目標(biāo)引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)球甘藍(lán)無(wú)蠟粉亮葉98-1030遺傳模式分析

試驗(yàn)所選5個(gè)F1單株全部表現(xiàn)為顯性野生性狀，于2018年4月開(kāi)始授粉，6月獲得F2代，同年7月播種于溫室，分別編號(hào)，8月統(tǒng)計(jì)表型。F2代材料表現(xiàn)型分為無(wú)蠟粉亮葉型和表面蠟質(zhì)正常型兩類(lèi)，表型性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果為，無(wú)蠟粉亮葉型和表面蠟質(zhì)正常型比例接近1∶3.95，經(jīng)卡方檢驗(yàn)（x2=10.65>x20.05=3.841）與孟德?tīng)?∶1分離比例相差較大。此現(xiàn)象可能是因?yàn)镕2群體較小，且僅來(lái)自3株F1植株造成。本課題組牟香麗等試驗(yàn)結(jié)果證明結(jié)球甘藍(lán)98-1030無(wú)蠟粉亮葉控制基因?yàn)橐粚?duì)隱性基因控制的質(zhì)量性狀[23]，遵循孟德?tīng)栠z傳定律。

2.2 DNA提取與檢測(cè)

按照改良CTAB方法提取野生型98-1030、突變型無(wú)蠟粉亮葉98-1030、F1及F2群體基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA，DNA樣品條帶如圖2所示，條帶清洗、無(wú)降解、無(wú)拖尾，證明DNA樣品提取質(zhì)量較高，可開(kāi)展下一步試驗(yàn)，將提取后DNA原液放置-20℃溫度下保存，使用時(shí)稀釋5倍作為工作液用于PCR擴(kuò)增。

圖2 主要材料DNA檢測(cè)結(jié)果Fig.2 DNA test results of main materials

應(yīng)注意的是，PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物檢測(cè)方法不同。PCR產(chǎn)物檢測(cè)步驟為，待PCR反應(yīng)完成后，配置濃度為1.5%瓊脂糖凝膠，以120 V電壓電泳，時(shí)長(zhǎng)20 min。PCR產(chǎn)物酶切電泳方法為：待酶切完成后，配置濃度為3%瓊脂糖凝膠，以80 V電壓電泳，時(shí)長(zhǎng)1.5 h。

2.3 基于雙親轉(zhuǎn)錄組測(cè)序SNP分析

利用雙親全基因組重測(cè)序比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，一些可能影響基因功能的SNP分布情況如下：6 652個(gè)SNP參與密碼子的提前終止；1 395個(gè)SNP將終止密碼子替換為其他氨基酸殘基，使該SNP所在DNA片段翻譯出更長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框；還有2 442個(gè)SNP可改變基因組上的剪接供體及受體位點(diǎn)；9 325個(gè)SNP導(dǎo)致甲硫氨酸殘基改變。最后根據(jù)測(cè)序結(jié)果注釋信息在目標(biāo)區(qū)間內(nèi)篩選出20個(gè)SNPs篩選dCAPS引物。

2.4 dCAPS標(biāo)記轉(zhuǎn)化

根據(jù)親本基因組重測(cè)序結(jié)果在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)選擇20個(gè)SNP位點(diǎn)，將其轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記，得到20對(duì)可用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段包含特異性酶切位點(diǎn)dCAPS引物，分別編號(hào)為DC01~DC20。

以引物DC01為例，設(shè)計(jì)方法和原理見(jiàn)圖3，該引物所使用限制性內(nèi)切酶AvaII識(shí)別序列為GGW?CC，序列中W為A和T簡(jiǎn)并堿基國(guó)際通用代碼。

圖3 dCAPS引物DC01設(shè)計(jì)Fig.3 Design of primer DC01 for dCAPS

所設(shè)計(jì)上下游引物序列及所對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶見(jiàn)表1，表中加粗斜體字母為錯(cuò)配堿基。

表1 根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的dCAPS引物Table 1 dCAPS primers designed according to SNP

2.5 dCAPS標(biāo)記篩選

將20對(duì)dCAPS引物開(kāi)展野生型結(jié)球甘藍(lán)98-1030和無(wú)蠟粉亮葉突變型結(jié)球甘藍(lán)98-1030以及F1代PCR擴(kuò)增及酶切。PCR結(jié)果表明，有10對(duì)引物可擴(kuò)增出產(chǎn)物條帶；酶切驗(yàn)證結(jié)果顯示，有8對(duì)引物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生多態(tài)性。

圖4為PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物條帶情況概述。圖4A中1號(hào)引物（ND07）和3號(hào)引物（ND12）為可開(kāi)展后續(xù)酶切驗(yàn)證的引物；2號(hào)引物（ND08）擴(kuò)增出多條條帶，故舍去；4號(hào)引物（ND13）無(wú)清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物，故舍去。圖4B中1號(hào)引物（ND06）可穩(wěn)定擴(kuò)增，2號(hào)引物（ND16）顯性親本無(wú)條帶，故舍去。

圖4 部分dCAPS標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4 PCR products by dCAPS molecular markers

由于dCAPS標(biāo)記中酶切位點(diǎn)一般包含于上游引物中，酶切產(chǎn)物即部分PCR產(chǎn)物被酶切得來(lái)，所以多態(tài)性差異較小，長(zhǎng)度僅為20 bp。因酶切產(chǎn)物片段過(guò)于短小，在瓊脂糖凝膠電泳中跑出凝膠區(qū)域，共顯性酶切產(chǎn)物標(biāo)記中一般僅存在2個(gè)條帶片段，如圖5所示。

圖5 Sty I酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Sty I digested product

酶切篩選后8對(duì)dCAPS引物為：DC03、DC04、DC06、DC07、DC11、DC12、DC16和DC19，轉(zhuǎn)化效率為40%，可用于后續(xù)基因定位研究。

3 討論

傳統(tǒng)正向遺傳學(xué)（Forward genetics）基因定位方法一般是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，但存在定位區(qū)間較大、定位精確性低等缺陷，且正向遺傳學(xué)步驟過(guò)程繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)[24]。近年來(lái)，隨著第二代測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)逐漸成熟，測(cè)序成本降低，更多方便快捷的基因定位方法被開(kāi)發(fā)。

SNP（Single nucleotide polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性，是指基因中單個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換等突變，共有4種突變形式：C-T（G-A）、T-A（A-T）、C-G（G-C）、C-A（G-T），但第一種突變形式頻率最高，約占全部突變頻率67%[25]。理論上來(lái)說(shuō)，將CAPS和dCAPS相結(jié)合，可檢測(cè)任意SNP位點(diǎn)[26]。但在SNP轉(zhuǎn)化dCAP標(biāo)記中，引物能否轉(zhuǎn)化成功是關(guān)鍵，引物中錯(cuò)配堿基數(shù)以及錯(cuò)配位置距離引物3'端遠(yuǎn)近，均決定dCAPS標(biāo)記開(kāi)發(fā)能否成功。Neff等研究擬南芥探索試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)插入錯(cuò)配堿基在3'端第二位或者距離第二位更遠(yuǎn)位置時(shí)，可成功將限制性酶切位點(diǎn)引入引物中[22]。在PCR擴(kuò)增時(shí)使用不同DNA聚合酶得到的PCR擴(kuò)增結(jié)果可能會(huì)不同[26]，PCR擴(kuò)增時(shí)選用的DNA聚合酶不應(yīng)具有校正功能，否則影響錯(cuò)配堿基插入，無(wú)法擴(kuò)增PCR產(chǎn)物或者無(wú)法正常插入酶切位點(diǎn)。因本試驗(yàn)所選取SNP位點(diǎn)前后堿基均不存在酶切位點(diǎn)，無(wú)法直接設(shè)計(jì)得到CAPS引物，所以采用dCAPS標(biāo)記方法篩選引物和優(yōu)化。但部分dCAPS引物錯(cuò)配堿基距離3'端位置較近，可能導(dǎo)致部分PCR擴(kuò)增效果差。本試驗(yàn)所選用DNA聚合酶為2×EsTaqMas?terMix酶，不具有高保真性，因此在DNA聚合時(shí)可保證順利擴(kuò)增及后續(xù)試驗(yàn)。

Di等研究玉米dCAPS標(biāo)記開(kāi)發(fā)檢測(cè)時(shí)利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法作酶切產(chǎn)物分離[27]。但聚丙烯酰胺凝膠相較于瓊脂糖凝膠電泳而言，不僅制作過(guò)程復(fù)雜，且耗時(shí)久，故不推薦使用?？墒褂酶叻直媛虱傊悄z檢測(cè)酶切產(chǎn)物，Shahinnia等大麥dCAPS標(biāo)記開(kāi)發(fā)中利用高分辨率Metaphor瓊脂糖凝膠[28]；Yanagisawa等在小麥dCAPS分子標(biāo)記中則利用另一種高分辨率Nusieve GTG瓊脂糖凝膠[19]。與本試驗(yàn)所用普通瓊脂糖凝膠相比，高分辨率瓊脂糖雖效果較好，但價(jià)格過(guò)于昂貴，標(biāo)記開(kāi)發(fā)成本升高。

本試驗(yàn)所建立SNP/dCAPS轉(zhuǎn)化體系基因定位方法在甘藍(lán)作物中鮮有記載，本研究增加普通瓊脂糖凝膠電泳濃度，利用降低電泳電壓，延長(zhǎng)電泳時(shí)間方法對(duì)差異較小酶切產(chǎn)物分離片段，達(dá)到經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡(jiǎn)單且有效的目的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)根據(jù)野生型結(jié)球甘藍(lán)98-1030和突變型98-1030的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)所得的非同義SNP位點(diǎn)作為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)20對(duì)dCAPS引物，利用雙親及F1代作引物篩選及優(yōu)化，最終篩選出8對(duì)PCR產(chǎn)物清晰、酶切后可產(chǎn)生特異性片段的共顯性dCAPS標(biāo)記：DC03、DC04、DC06、DC07、DC11、DC12、DC16、DC19，標(biāo)記轉(zhuǎn)化率為40%。研究結(jié)果可為后續(xù)基因定位及結(jié)球甘藍(lán)優(yōu)良品種選育奠定理論基礎(chǔ)。